一种靶向递送siRNA的基因颗粒/超声造影剂纳米复合体及其制备方法与应用

摘要

一种靶向递送siRNA的基因颗粒/超声造影剂纳米复合体及其制备方法与应用。所述基因颗粒携载有治疗模块、靶向模块和锚定模块；所述超声造影剂是以O‑CMC联合脂质为壳膜材料，液态氟碳为内核的纳米级超声造影剂；所述基因颗粒/超声造影剂纳米复合体的粒径为160～220nm，分散系数为0.25～0.35。本发明提供的基因颗粒/超声造影剂纳米复合体具有超声响应特性，在超声辐照下，一方面可以实现肿瘤水平的超声分子成像，另外一方面可以借助超声辐照产生的声孔效应促进siRNA基因更多的进入细胞内，实现诊疗一体化。

权利要求

1.一种靶向递送siRNA的基因颗粒/超声造影剂纳米复合体，其特征在于，所述基因颗粒携载有治疗模块、靶向模块和锚定模块；所述超声造影剂是以O‑CMC/DSPE‑PEG为壳膜材料，液态氟碳为内核的纳米级超声造影剂；所述基因颗粒/超声造影剂纳米复合体的电位为负电荷‑12.98mV，粒径为160 220nm，分散系数为0.25 0.35；

~ ~

所述治疗模块为siCAT‑1序列，siCAT‑1的核酸序列为：GAcAuAuucGcAGuGAucAuAuu；

所述靶向模块为A10‑3.2适体，A10‑3.2适体的核酸序列为：GGGAGGAcGAuGcGGAucA GccAuGuuuAcGucAcuccu；

所述锚定模块为胆固醇修饰的aWJ侧链；

所述基因颗粒的制备方法，包括步骤如下：（1）根据3WJ‑pRNA的核心序列分别设计合成4条RNA单链，分别为cholesterol修饰的aWJ侧链、A10‑3.2修饰的bWJ侧链、siCAT‑1修饰的cWJ侧链、治疗模块的反义链；

（2）将步骤（1）所述4条RNA单链分别溶解于DEPC水中后，混合均匀，分别得到RNA单链浓度为50 100μmol的DEPC水溶液；

~

（3）将步骤（2）所述4条RNA单链DEPC水溶液混合于退火缓冲液中，混匀后进行程序性降温，得到基因颗粒；

其中，步骤（1）中所述aWJ侧链的核酸序列为：uuGccAuGuGuAuGuGGG；所述bWJ侧链的核酸序列为：cccAcAuAcuuuGuuGAucc；所述cWJ侧链的核酸序列为：GGAucAAucAuGGcAAuu；所述aWJ、bWJ、cWJ、siCAT‑1、A10‑3.2核酸序列中所有嘧啶核苷酸均进行2’氟化修饰；

步骤（3）中所述含有4条RNA单链的退火缓冲液中RNA单链的摩尔比为1:1:1:1；所述程序性降温采用PCR仪进行，具体程序为：95℃，5min→每个循环下降‑0.1℃，750个循环→4℃；在基因颗粒构建过程中实时监测产物荧光强度；在基因颗粒构建完成后，采用8%非变性凝胶电泳及原子力显微镜检测构建效率；

所述超声造影剂的制备方法，包括步骤如下：

1）将二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺‑聚乙二醇、液态氟碳、吐温20分散于去离子水中，高速均质法制得混悬液；

2）高速机械搅拌下，向步骤1）制得的混悬液中逐滴加入O‑CMC溶液，制得悬乳液；

3）将步骤2）制得的悬乳液室温静置5 10min，低速离心，取上层液体，经过滤后即获得~

超声造影剂；

其中，步骤1）中，各材料的用量分别为：5.0mL去离子水中含有8 12mg二硬脂酰基磷脂~

酰乙醇胺‑聚乙二醇、250 300μL液态氟碳、10 15μL吐温20；

~ ~

所述基因颗粒/超声造影剂纳米复合体的制备方法，包括步骤如下：a、将基因颗粒溶解于超声造影剂中，混合均匀，得到混合液；

b、将步骤a中的混合液在室温下，静置共孵育，低速离心5min，吸取上层液体，即得基因颗粒/超声造影剂纳米复合体；

其中，步骤a中，所述基因颗粒与超声造影剂的质量比为0.5：1；所述基因颗粒标记荧光cy3，超声造影剂标记荧光FITC；

步骤b中，所述共孵育时间为60min，低速离心转速为300 600rpm。

~

2.如权利要求1所述的靶向递送siRNA的基因颗粒/超声造影剂纳米复合体，其特征在于，满足下列条件一项或多项：

i.步骤1）中，所述高速均质转速为16000 20000rpm，时间为0.5 1.5min；

~ ~

ii.步骤2）中，所述O‑CMC溶液的浓度为1 3mg/mL，O‑CMC溶液与去离子水的体积比1：~

0.8 1.2，高速机械搅拌转速为12000 15000rpm，1 3min；

~ ~ ~

iii.步骤3）中，所述低速离心转速为300 600rpm，时间为4 6min，过滤为采用0.4 0.5μ~ ~ ~

m的滤膜进行过滤。

3.权利要求1所述的靶向递送siRNA的基因颗粒/超声造影剂纳米复合体在制备抗肿瘤药物中的应用。

说明书

一种靶向递送siRNA的基因颗粒/超声造影剂纳米复合体及其

制备方法与应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种靶向递送siRNA的基因颗粒/超声造影剂纳米复合体及其制备方法与应 用，属于超声分子影像学与基因递送技术领域。

背景技术

[0002] 基于siRNA的基因治疗具有设计简单、可针对各种致病靶点等优势，有望成为难治性疾 病尤其是恶性肿瘤的有效治疗策略。未经修饰的裸siRNA在体内容易被降解，半衰期
短，无 法维持有效药物浓度，为此需要借助递送载体，常用的载体主要包括病毒载体和脂
质体载体， 尽管这些载体广泛用于基础研究，但它们却不太适合直接用于临床。基因递送
载体应用有着 安全性和有效性的双重标准，病毒载体会带来安全性上的不确定性，脂质体
载体则面临效率 上的挑战。因此，限制siRNA临床应用的主要因素是缺乏一种安全、高效的
递送系统。

[0003] O‑CMC是壳聚糖的一种衍生物，集聚合物与多糖材料的优点与一身，具有优良的生物兼 容性质、生物活性、抗肿瘤性、稳定性和水溶性质，而且活性官能团羧基(‑COOH)为后
续 修饰提供了可能性，在生物技术领域应用比较广泛。中国专利文献CN111840575A提供了
一 种递送siRNA的壳聚糖衍生物纳米颗粒及其制备方法。所述递送siRNA的壳聚糖衍生物
纳米 颗粒由正电荷的壳聚糖盐酸盐与负电荷的O‑CMC混合而成，通过分子间静电相互作用
自组 装形成。但是，该专利所述纳米颗粒整体为正电荷，存在阳离子毒性问题，容易与血清
阴离 子蛋白发生凝集，也容易被网状内皮系统(RES)所清除。

[0004] 与依赖静电相互作用来携载siRNA的正电荷纳米载体相比，亲脂性修饰为中性或负电荷 纳米载体携载siRNA提供了另一种选择。与正电荷纳米载体相比，中性或负电荷纳
米载体可 避免阳离子毒性，能够实现血液长循环，更具有临床转化价值。三叶草形构象
3WJ‑pRNA基 因纳米颗粒，可根据碱基配对原则自身折叠成三个角度的空间结构，其独特优
势是三条侧链 顶端可以分别进行修饰实现不同的功能，其核心结构由核酸序列组成，易于
修饰合成，且无 毒性，是基因携载的合适载体。亲脂性修饰的3WJ‑pRNA基因颗粒可以锚定
结合到脂质体或 外泌体等具有壳核结构的纳米载体，为纳米载体的siRNA递送提供了一种
新思路。

发明内容

[0005] 针对现有技术的不足，本发明提供了一种靶向递送siRNA的基因颗粒/超声造影剂纳米复 合体及其制备方法与应用。该基因颗粒/超声造影剂纳米复合体具有较高的生物安
全性、优良 的对比增强成像水平、较强的肿瘤细胞靶向与siRNA递送能力。

[0006] 术语说明：

[0007] 3WJ‑pRNA：属于基因纳米颗粒的一种，全称为three‑way junction of bacteriophage phi29 motor packaging RNA，又称为噬菌体phi29马达包装RNA，可根据碱
基配对原则自身折叠 成三个角度的空间结构，其独特优势是三条侧链(aWJ、bWJ、cWJ)顶端
可以分别进行修饰 实现不同的功能。

[0008] O‑CMC：中文名为O‑羧甲基壳聚糖，是壳聚糖糖残基的‑OH被羧甲基取代而成；作为一 种水溶性壳聚糖衍生物，O‑CMC抗菌性强，具有保鲜作用，是一种两性聚电解质。

[0009] RNA适体：是一段RNA序列，通常是利用体外筛选技术‑‑指数富集的配体系统进化技术 (Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)，从核酸
分子文库中得 到的寡核苷酸片段，可以特异性结合细胞表面的表达受体。

[0010] DSPE‑PEG‑FITC：中文名为二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺‑聚乙二醇‑异硫氰酸荧光素。

[0011] DEPC水：焦碳酸二乙酯处理过并经高温高压消毒的MiliQ纯水，不含RNA、DNA和蛋 白酶。

[0012] 室温：具有本领域公知的含义，一般是指25±2℃。

[0013] 本发明的技术方案如下：

[0014] 一种靶向递送siRNA的基因颗粒/超声造影剂纳米复合体，所述基因颗粒携载有治疗模 块、靶向模块和锚定模块；所述超声造影剂是以O‑CMC联合脂质为壳膜材料，液态氟碳
为 内核的纳米级超声造影剂；所述基因颗粒/超声造影剂纳米复合体的粒径为160～
220nm，分散 系数为0.25～0.35。

[0015] 根据本发明优选的，所述治疗模块为siCAT‑1序列，siCAT‑1的核酸序列为： GAcAuAuucGcAGuGAucAuAuu。其中，小写字母代表2’氟化修饰的碱基。

[0016] 根据本发明优选的，所述靶向模块为RNA适体A10‑3.2，A10‑3.2的核酸序列为： GGGAGGAcGAuGcGGAucAGccAuGuuuAcGucAcuccu。其中，小写字母代表2’氟化修饰的碱 基。RNA
适体A10‑3.2作为靶向配体，优势在于：比蛋白质类抗体体积更小，拥有与抗原‑ 抗体反应
相匹敌的灵敏度，同时合成更容易，稳定性更好。

[0017] 根据本发明优选的，所述锚定模块为胆固醇修饰的aWJ侧链(aWJ‑Chol)。锚定模块能 够将靶向模块呈现在超声造影剂的外表面，从而有利于与肿瘤细胞的靶向识别。

[0018] 上述靶向递送siRNA的基因颗粒/超声造影剂纳米复合体是通过锚定作用将基因颗粒固 定于超声造影剂表面，形成整体基因颗粒/超声造影剂纳米复合体结构。

[0019] 根据本发明优选的，所述基因颗粒的制备方法，包括步骤如下：

[0020] (1)根据3WJ‑pRNA的核心序列分别设计合成4条RNA单链(strand 1～4)，分别为胆 固醇修饰的aWJ侧链(aWJ‑Chol，strand 1，锚定模块)、A10‑3.2修饰的bWJ侧链(bWJ‑A10‑
3.2， strand 2，靶向模块)、siCAT‑1修饰的cWJ侧链(CWJ‑siCAT‑1，strand 3，治疗模块)、
治 疗模块的反义链(siCAT‑1antisense，strand 4)；

[0021] (2)将步骤(1)所述4条RNA单链分别溶解于DEPC水中后，混合均匀，分别得到RNA 单链浓度为50～100μmol的DEPC水溶液；

[0022] (3)将步骤(2)所述4条RNA单链DEPC水溶液混合于退火缓冲液中，混匀后进行程 序性降温，得到基因颗粒。

[0023] 根据本发明优选的，步骤 (1) 中，所述aWJ侧链的核酸序列为：uuGccAuGuGuAuGuGGG； 所述bWJ侧链的核酸序列为：cccAcAuAcuuuGuuGAucc；所述cWJ侧链
的核酸序列为： GGAucAAucAuGGcAAuu。其中，小写字母代表2’氟化修饰的碱基。

[0024] 根据本发明优选的，步骤(3)中，所述含有4条RNA单链的退火缓冲液中RNA单链 的摩尔比为1:1:1:1。

[0025] 根据本发明优选的，步骤(3)中，所述程序性降温的程序如下：95℃，5min→每个循环 下降‑0.1℃(750个循环)→4℃。

[0026] 根据本发明优选的，所述超声造影剂的制备方法，包括步骤如下：

[0027] 1)将脂质、液态氟碳、吐温20分散于去离子水中，高速均质法制得混悬液；

[0028] 2)高速机械搅拌下，向步骤1)制得的混悬液中逐滴加入O‑CMC溶液，制得悬乳液；

[0029] 3)将步骤2)制得的悬乳液室温静置5～10min，低速离心，取上层液体，经过滤后即获 得超声造影剂。

[0030] 根据本发明优选的，步骤1)中，所述脂质为二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺‑聚乙二醇‑异硫氰 酸荧光素(DSPE‑PEG‑FITC)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺‑聚乙二醇(DSPE‑PEG)、二硬
脂酰基磷 脂酰乙醇胺‑聚乙二醇‑氨(DSPE‑PEG‑NH2)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)或二硬
脂酰基磷脂酰 乙醇胺‑聚乙二醇‑短肽(DSPE‑PEG‑短肽)。

[0031] 进一步优选的，所述脂质为二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺‑聚乙二醇‑异硫氰酸荧光素 (DSPE‑PEG‑FITC)。由于PEG集团的存在，脂质生物相容性好，易溶于水，能够与同为水溶 性
的O‑CMC组成造影剂的壳膜结构，并且FITC荧光对于造影剂的后续检测有一定帮助。

[0032] 根据本发明优选的，步骤1)中，所述液态氟碳为全氟戊烷或全氟己烷；进一步优选的， 所述液态氟碳为全氟己烷。全氟己烷分子式为C6F14，分子量338.04，CAS为355‑42‑0，沸
点 为29.2℃，在血液循环过程中可以保持稳定的物理状态，在超声辐照下能够发生液气相
变， 液态氟碳转变为气态氟碳，有助于超声显像。

[0033] 根据本发明优选的，步骤1)中，各材料的用量分别为：5.0mL去离子水中含有8～12mg 脂质、250～300μL液态氟碳、10～15μL吐温20。

[0034] 根据本发明优选的，步骤1)中，所述高速均质转速为16000～20000rpm，时间为0.5～1.5min。

[0035] 根据本发明优选的，步骤2)中，所述O‑CMC溶液的浓度为1～3mg/mL，O‑CMC溶液 与去离子水的体积比1：(0.8～1.2)，高速机械搅拌转速为12000～15000rpm，1～3min。

[0036] 根据本发明优选的，步骤3)中，所述低速离心转速为300～600rpm，时间为4～6min；所 述过滤为采用0.4～0.5μm的滤膜进行过滤。

[0037] 上述靶向递送siRNA的基因颗粒/超声造影剂纳米复合体的制备方法，包括步骤如下：

[0038] a、将基因颗粒溶解于超声造影剂中，混合均匀，得到混合液；

[0039] b、将步骤a中的混合液在室温下，静置共孵育后低速离心，吸取上层液体，即得靶向递 送siRNA的基因颗粒/超声造影剂纳米复合体。

[0040] 根据本发明优选的，步骤a中，所述基因颗粒与超声造影剂的质量比为(0.2～1)：1； 进一步优选的，基因颗粒与超声造影剂的质量比例为0.5:1。低于此比例的基因携载效
率会降 低，而高于此比例的基因携载已达到饱和状态。

[0041] 根据本发明优选的，步骤b中，所述共孵育时间为30～120min；进一步优选的，共孵育 时间为60min。更长时间的共孵育并不能形成更多的基因颗粒/超声造影剂纳米复合体。

[0042] 根据本发明优选的，步骤(2)中，所述低速离心转速为300～600rpm，时间为4～6min。

[0043] 上述靶向递送siRNA的基因颗粒/超声造影剂纳米复合体在制备抗肿瘤药物中的应用。

[0044] 以上本发明制备方法中未特别说明的均按照现有技术。

[0045] 本发明的技术特点：

[0046] 胆固醇修饰的Chol‑siRNA能够锚定在脂质体或外泌体的壳膜表面。而超声造影剂具有与 脂质体或外泌体类似的壳核结构，因此Chol‑siRNA能够锚定在超声造影剂的壳膜
表面。 3WJ‑pRNA是一种多功能的生物相容性基因纳米颗粒，根据碱基互补配对原则自身折
叠成具 有不同角度的三叶草结构。3WJ‑pRNA的三条侧链可分别进行修饰，形成锚定模块，
靶向模 块和治疗模块，再通过锚定模块与超声造影剂结合，形成基因颗粒/超声造影剂复
合体，一方 面基于3WJ‑pRNA基因颗粒部分，复合体可以实现RNA适体修饰与siRNA携载，通
过主动 靶向作用精准递送siCAT‑1；另一方面基于超声造影剂部分，复合体可以实现超声
响应与液 气相变，通过声孔效应实现可视化及增强治疗。基因颗粒/超声造影剂纳米复合
体将为肿瘤siRNA治疗提供一种有效的递送载体。实现了既能够靶向递送siRNA，同时又具
有超声成像 功能。本发明为表面负电荷的纳米载体siRNA递送提供了一种新方案。

[0047] 有益效果：

[0048] 1、本发明制备的基因颗粒/超声造影剂纳米复合体，是以O‑CMC联合脂质为壳膜材料， 液态氟碳为内核，基因颗粒锚定结合于壳膜表面，平均粒径为160～220nm，聚合物分散
系数 为0.25～0.35，该粒径范围能穿过肿瘤组织血管壁间隙，对于肿瘤的治疗具有靶向性
和高效性。

[0049] 2、本发明制备的基因颗粒/超声造影剂纳米复合体具有优良的超声对比增强显像能力， 壳膜材料、液态氟碳、基因颗粒均为低毒性和低免疫原性的材料，生物安全性高，具
有临床 转化应用价值。

[0050] 3、本发明制备的基因颗粒/超声造影剂纳米复合体具有靶向性，通过靶向模块与肿瘤细 胞PSMA的配体‑受体相互作用，实现主动靶向性，并且促进siRNA更多的进入肿瘤细
胞内， 特异性杀伤肿瘤，增强肿瘤细胞的治疗效果。

[0051] 4、本发明制备的基因颗粒/超声造影剂纳米复合体通过3WJ‑pRNA基因颗粒实现了 siRNA携载，避免了传统正电荷纳米载体的阳离子毒性作用，为负电荷纳米载体的siRNA携 
载提供了一种新策略。

[0052] 5、本发明制备的基因颗粒/超声造影剂纳米复合体通的内核液态氟碳具有液气相变特性， 常规条件下，包裹在壳膜下的液态氟碳为液态，保证了复合体的稳定性及小粒径，
在超声辐 照下，液态氟碳转变为气体，有助于超声显像。

[0053] 6、本发明制备的基因颗粒/超声造影剂纳米复合体具有超声响应特性，在超声辐照下， 一方面可以实现肿瘤水平的超声分子成像，另外一方面可以借助超声辐照产生的声
孔效应促 进siRNA基因更多的进入细胞内，实现诊疗一体化。

附图说明

[0054] 图1是基因颗粒Chol/A10‑3.2/siCAT‑1/3WJ‑pRNA的构建示意图。

[0055] 图2是基因颗粒Chol/A10‑3.2/siCAT‑1/3WJ‑pRNA逐步降温自助装过程中的实时荧光检 测，其中横坐标是逐步降温循环次数(‑0.1℃/cycle)，纵坐标是荧光强度。

[0056] 图3是基因颗粒Chol/A10‑3.2/siCAT‑1/3WJ‑pRNA(矩形框)在8％非变性凝胶电泳中的 分布，strand 1～4作为对照。

[0057] 图4是基因颗粒Chol/A10‑3.2/siCAT‑1/3WJ‑pRNA在原子力显微镜下的形貌，右图为单 个颗粒放大后的图像，可以观察到三叶草结构。

[0058] 图5是超声造影剂O‑CMC/DSPE‑PEG‑FITC/NDs的结构示意图。

[0059] 图6是基因颗粒/超声造影剂纳米复合体A10‑3.2/siCAT‑1/3WJ‑NDs的纳米粒径分布图， 其中，左侧纵坐标是粒径强度百分比，右侧纵坐标是粒径累积强度百分比，横坐标是
指粒径。

[0060] 图7是基因颗粒/超声造影剂纳米复合体A10‑3.2/siCAT‑1/3WJ‑NDs的纳米表面电荷图， 其中，纵坐标是指强度，上方横坐标是指频率，下方横坐标是指zeta电位。

[0061] 图8是基因颗粒/超声造影剂纳米复合体A10‑3.2/siCAT‑1/3WJ‑NDs的1000x光镜图谱。

[0062] 图9是基因颗粒/超声造影剂纳米复合体A10‑3.2/siCAT‑1/3WJ‑NDs的荧光图像，FITC代 表O‑CMC/DSPE‑PEG‑FITC/NDs超声造影剂，cy3代表Chol/A10‑3.2/siCAT‑1/3WJ‑
pRNA基 因纳米颗粒，FITC/cy3代表基因颗粒/超声造影剂纳米复合体A10‑3.2/siCAT‑1/
3WJ‑NDs。

[0063] 图10是基因颗粒/超声造影剂纳米复合体A10‑3.2/siCAT‑1/3WJ‑NDs的超声对比增强显像 图，DDI水作为对照。

[0064] 图11是基因颗粒/超声造影剂纳米复合体A10‑3.2/siCAT‑1/3WJ‑NDs的生物安全性分析， 其中横坐标是不同质量浓度的纳米颗粒/超声造影剂复合体的壳膜材料，纵坐标
是细胞存活 率。

[0065] 图12是基因颗粒/超声造影剂纳米复合体A10‑3.2/siCAT‑1/3WJ‑NDs与前列腺癌细胞 22RV1细胞结合能力的荧光检测图，以PSMA低表达的PC‑3细胞作为对照。

[0066] 图13是基因颗粒/超声造影剂纳米复合体A10‑3.2/siCAT‑1/3WJ‑NDs与前列腺癌细胞 22RV1细胞结合的流式检测结果图，图中纵坐标为细胞数量，横坐标为荧光信号强度，
以 PSMA低表达的PC‑3细胞作为对照。

[0067] 图14是基因颗粒/超声造影剂纳米复合体A10‑3.2/siCAT‑1/3WJ‑NDs联合超声辐照靶向递 送siRNA的能力分析，通过RT‑PCR检测递送后CAT‑1mRNA的表达水平，可以提示
siRNA 递送的多少。

具体实施方式

[0068] 下面结合实施例对本发明做进一步的说明，但本发明的保护范围并不仅限于此。

[0069] O‑CMC购自Santa Cruz，产品编号CAS 83512‑85‑0，重均分子量为100‑300KD；吐温20 购自索莱宝，产品编号CAS 9005‑64‑5/T8220；DSPE‑PEG‑FITC购自西安瑞禧，产品编号 
R0055。

[0070] 本实施例涉及药品及试剂如无特殊说明，均为普通市售产品。

[0071] 实施例1基因颗粒Chol/A10‑3.2/siCAT‑1/3WJ‑pRNA的合成及鉴定

[0072] 基因颗粒Chol/A10‑3.2/siCAT‑1/3WJ‑pRNA的合成，包括步骤如下：

[0073] (1)根据3WJ‑pRNA的核心序列分别设计合成4条RNA单链，分别为胆固醇修饰的aWJ 侧链(aWJ‑Chol)、RNA适体A10‑3.2修饰的bWJ侧链(bWJ‑A10‑3.2)、siCAT‑1修饰的 cWJ侧链
(cWJ‑siCAT‑1)、siCAT‑1的反义链(siCAT‑1antisense)；

[0074] (2)将步骤(1)所述4条RNA单链分别溶解于DEPC水中后，混合均匀，分别得到RNA 单链浓度为100μmol的DEPC水溶液；

[0075] (3)将步骤(2)所述将4条RNA单链DEPC水溶液按照RNA单链等摩尔比比例混合 于退火缓冲液中，混匀后置于PCR仪中进行程序性降温，得到基因颗粒，保存于‑20℃。

[0076] 本实施例基因颗粒Chol/A10‑3.2/siCAT‑1/3WJ‑pRNA具体构建过程，如图1所示。

[0077] 步骤(1)中，所述aWJ侧链的核酸序列为：uuGccAuGuGuAuGuGGG；所述bWJ侧链 的核酸序列为：cccAcAuAcuuuGuuGAucc；所述cWJ侧链的核酸序列为： GGAucAAucAuGGcAAuu；，
siCAT‑1的核酸序列为：GAcAuAuucGcAGuGAucAuAuu；A10‑3.2 的核酸序列为：GGGAGGAcGAu
GcGGAucAGccAuGuuuAcGucAcuccu。其中，小写字母代表 2’氟化修饰的碱基。

[0078] 步骤(3)中，设置程序降温反应程序为，95℃，5min→每个循环下降‑0.1℃(750个循 环)→4℃。

[0079] 反应过程中实时监测产物荧光强度，结果如图2所示。

[0080] 由图2可知，本实施例基因颗粒Chol/A10‑3.2/siCAT‑1/3WJ‑pRNA逐步降温自助装过程 中的实时荧光强度的升高代表基因纳米颗粒的逐步合成。

[0081] 基因颗粒Chol/A10‑3.2/siCAT‑1/3WJ‑pRNA的鉴定：

[0082] 取2μL本实施例合成的基因颗粒加入到8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳上样孔内，100V 电压运行30min，取出凝胶，将其置入含有0.01％Gelred染色液的PBS溶液中，摇床匀
速水 平振动20min，采用凝胶成像仪观察条带分布，结果如图3所示。

[0083] 由图3可知，矩形框显示的是合成后的基因纳米颗粒，同时lane 1‑lane 4是对照，代表 原材料RNA单链strand 1～strand 4。

[0084] 另取1μL本实施例合成的基因颗粒滴在单面剖光10mm*10mm硅片上，采用原子力显微 镜观察颗粒的结构，结果如图4所示。

[0085] 由图4可知，显示基因颗粒呈现三条侧链结构。

[0086] 实施例2超声造影剂O‑CMC/DSPE‑PEG‑FITC/NDs的制备

[0087] 超声造影剂O‑CMC/DSPE‑PEG‑FITC/NDs的制备，包括步骤如下：

[0088] 1)将300μL全氟己烷液体、12μL吐温20、10mg脂质DSPE‑PEG‑FITC分散于5mL去 离子水中，19000rpm高速均质1min制得混悬液；

[0089] 2)在高速机械搅拌的条件下，向步骤1)制得的混悬液中逐滴加入5mL浓度为2mg/mL 的O‑CMC溶液，制得悬乳液；其中，高速机械搅拌的转速为15000rpm，时间为2min；

[0090] 3)将步骤2)制得的悬乳液室温静置10min，500rpm低速离心5min，取上层液体，经 0.45μm滤膜过滤即获得超声造影剂O‑CMC/DSPE‑PEG‑FITC/NDs。

[0091] 本实施例制备的超声造影剂O‑CMC/DSPE‑PEG‑FITC/NDs结构如图5所示。

[0092] 实施例3基因颗粒/超声造影剂纳米复合体A10‑3.2/siCAT‑1/3WJ‑NDs的合成及鉴定 基因颗粒/超声造影剂纳米复合体A10‑3.2/siCAT‑1/3WJ‑NDs的合成，包括步骤如下：

[0093] a、将实施例1制备的Chol/A10‑3.2/siCAT‑1/3WJ‑pRNA基因颗粒溶解于 O‑CMC/DSPE‑PEG/NDs超声造影剂中，混合均匀，得到混合液；其中基因颗粒和超声造影剂 的质量
比为0.5:1；

[0094] b、将步骤a中的混合液在室温下，静置共孵育60min后，在500rpm下低速离心5min， 吸取上层液体，即得靶向递送siRNA的基因颗粒/超声造影剂纳米复合体 A10‑3.2/siCAT‑
1/3WJ‑NDs。

[0095] 基因纳米颗粒/超声造影剂复合体A10‑3.2/siCAT‑1/3WJ‑NDs的鉴定：

[0096] 取1mL本实施例制备的基因颗粒/超声造影剂纳米复合体A10‑3.2/siCAT‑1/3WJ‑NDs，稀 释5倍后，使用纳米激光粒度及Zeta电位分析仪检测粒径和表面电位，结果如图6、7
所示。

[0097] 由图6和图7可知，本实施例制备基因颗粒/超声造影剂纳米复合体 A10‑3.2/siCAT‑1/3WJ‑NDs的平均粒径为198nm，PDI为0.306；超声造影剂的表面电位为 ‑12.98mV。

[0098] 取2μL本实施例制备的基因颗粒/超声造影剂纳米复合体A10‑3.2/siCAT‑1/3WJ‑NDs，稀 释5倍后滴在载玻片上，放上盖玻片后在光学显微镜及荧光显微镜下观察，结果图
8、9所示。

[0099] 由图8可知，本实施例制备基因颗粒/超声造影剂纳米复合体A10‑3.2/siCAT‑1/3WJ‑NDs 在1000×光学显微镜下可见复合体均呈球形，粒径均一，分散均匀无聚集。

[0100] 由图9可知，FITC代表O‑CMC/DSPE‑PEG‑FITC/NDs超声造影剂，cy3代表 Chol/A10‑3.2/siCAT‑1/3WJ‑pRNA基因纳米颗粒，FITC/cy3图为黄色表示两者重叠，说明复 合体合成
成功。

[0101] 实施例4基因颗粒/超声造影剂纳米复合体体外超声对比增强显像测定

[0102] 将实施例3制备的基因颗粒/超声造影剂纳米复合体置于琼脂凝胶制成的圆孔中，采用 GE logiq E9超声诊断仪的造影模式，频率9.0MHz，机械指数(MI)0.12，二维与超声造
影 模式同步观察，调节参数设置，用超声仪内部工作站存储图像资料，以DDI水为对照组，
结 果如图10所示。

[0103] 由图10可知，显示基因颗粒/超声造影剂纳米复合体组出现增强显像，而对照DDI水组 未出现增强显像。

[0104] 实施例5基因颗粒/超声造影剂纳米复合体生物安全性评价

[0105] 将22RV1细胞以1×104个/孔接种于96孔板中，加入培养基，37℃、5％CO2孵育培养24h， 分别加入含有造影剂壳膜材料(O‑CMC/DSPE‑PEG‑FITC质量比例为1:1)浓度为0、
0.01、 0.05、0.1、0.2、0.5、1.0mg/mL的新鲜培养基，孵育24h、48h后，将培养基换成含有
CCK‑8 (10μL)的新鲜培养基(100μL)，继续孵育2h，用酶标仪在450nm波长处检测其光吸收
值， 结果如图11所示。

[0106] 由图11可知，当壳膜材料浓度≤0.2mg/mL时，细胞活性均高于95％，说明基因颗粒/超 声造影剂纳米复合体的安全性高。

[0107] 实施例6基因颗粒/超声造影剂纳米复合体的靶向能力分析

[0108] 将22RV1细胞以1×106个/孔接种于6孔板，待细胞生长至60～70％密度时，加入实施例 3制备的基因颗粒/超声造影剂纳米复合体，共孵育培养30min后，用PBS缓冲液洗去未
结合 的基因颗粒/超声造影剂纳米复合体。分别用荧光显微镜及流式细胞仪分析靶向能
力。同时， 以PSMA低表达PC‑3细胞、无靶向纳米复合体siCAT‑1/3WJ‑NDs作为对照，结果如
图12、 13所示。

[0109] 由图12、13可知，与无靶向纳米复合体相比，基因颗粒A10‑3.2/siCAT‑1/3WJ‑NDs与 22RV1细胞结合更强(图12上，图13左，92.3％VS.3.69％)；基因颗粒 A10‑3.2/siCAT‑1/
3WJ‑NDs与22RV1细胞(PSMA+)的靶向结合明显高于PC‑3细胞(PSMA‑) (图12下，图13右，
92.3％VS.7.52％)。说明该基因颗粒/超声造影剂纳米复合体能靶向结合 22RV1细胞，靶向
结合能力与细胞PSMA表达水平正相关。

[0110] 实施例7基因颗粒/超声造影剂纳米复合体的siRNA递送能力检测

[0111] 将22RV1细胞以1×106个/孔接种于6孔板，待细胞生长至60～70％密度时，加入实施例 3制备的基因颗粒/超声造影剂纳米复合体，共孵育培养30min后，用PBS缓冲液洗去未
结合 的纳米复合体，继续培养24h，提取细胞总RNA，通过RT‑PCR检测CAT‑1mRNA表达水平， 
结果如图14所示。

[0112] 由图14可知，基因颗粒/超声造影剂纳米复合体联合超声辐照(A10‑3.2/siCAT‑1/3WJ‑NDs +US)能够显著下调22RV1细胞CAT‑1mRNA表达水平(24.37％of scramble)，下调能
力 显著强于无超声辐照的基因颗粒/超声造影剂纳米复合体(A10‑3.2/siCAT‑1/3WJ‑NDs，
67.36％of scramble)、无靶向纳米复合体联合超声辐照(siCAT‑1/3WJ‑NDs+US，69.89％of 
scramble)、 脂质体siRNA递送(siCAT‑1+lipofectamin，47.96％of scramble)。

[0113] 以上数据均表明靶向性及超声辐照对于基因颗粒/超声造影剂纳米复合体的siRNA递送 具有重要的促进作用，而基因颗粒/超声造影剂纳米复合体A10‑3.2/siCAT‑1/
3WJ‑NDs也是一 种有效的siRNA递送载体，既实现siRNA携载，又能够实现超声成像，为表面
负电荷纳米载 体的siRNA携载与递送提供了一种可行的方案。