编码大豆ARF转录因子的GmARF16基因及应用

摘要

本发明公开了编码大豆ARF转录因子的GmARF16基因及应用，所述GmARF16基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述基因能够影响根瘤的生长发育。并且本发明利用CRISPR/Cas载体，通过农杆菌介导的大豆毛状根遗传转化，快速获得嵌合体转基因植株，成功将GmARF16基因突变，对嵌合体转基因植株进行了抗盐性分析，结果表明突变GmARF16基因能够提高大豆的抗盐性和抑制大豆根瘤产生。

权利要求

1.编码大豆ARF转录因子的GmARF16基因或蛋白在促进大豆根瘤产生中的应用，其特征在于，所述GmARF16基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1 所示，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2 所示。

2.抑制编码大豆ARF转录因子的GmARF16基因或蛋白的功能表达在提高大豆抗盐性中的应用，其特征在于，所述GmARF16基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1 所示，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2 所示。

3.根据权利要求2所述的应用，通过敲除GmARF16基因的方式来获得耐盐性大豆植株。

说明书

编码大豆ARF转录因子的GmARF16基因及应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及编码大豆ARF转录因子GmARF16及应用。

背景技术

[0002] 土壤盐渍化是影响全球农业生产最主要的因子之一，中国土地盐渍化大约占到全6 2
球盐渍化面积的1/10，且土地盐渍化呈现上升的趋势，我国次生盐渍地超过6×10 hm ，占全
国耕地面积的25％。因此，研究植物耐盐机制与提高作物耐盐性成为许多研究者关注的焦
点问题。盐胁迫会对植物造成多方面的损伤，如离子失衡、氧化胁迫与渗透胁迫等，盐浓度
过高甚至会导致植物死亡。

[0003] 生长素在植物生长发育的几乎所有方面以及植物对环境中生物、非生物胁迫和生长趋向性的响应几乎无处不在的调控作用。ARFs(auxin response factors)是植物生长素
信号感知和信号传导途径非常关键的转录因子，在植物发育、生物、非生物胁迫和生长趋向
性的响应等方面起到极端重要的作用。它通过特异结合生长素响应基因启动子区域的生长
素响应元件TGTCTC/TGTCCC/TGTCAC，激活或者抑制靶基因的表达。ARF蛋白包含3个结构域：
一个N端的B3类DNA结合域(DNA binding domain，DBD)、一个中间的MR结构域‑抑制结构域
(repression domain，RD)或激活结构域(activation domain，AD)和一个C端的二聚作用结
构域(carboxy‑terminal dimerizationdomain，CTD)。

[0004] 大豆(Glycine max(Linn.)Merr)起源于5000年之前的中国，是一种重要的粮饲兼用作物，在我国的作物结构中占有重要地位，但近年来我国大豆产业发展缓慢，进口比例居
高不下，供需矛盾较为突出。同时，我国盐碱地面积广阔，且由于气候变化及人类不合理的
耕作方式，盐碱地面积存在进一步增加的趋势，而土壤盐渍化对大豆形态建成及生长发育
有很大影响，将直接影响大豆的产量和品质。因此在大豆中克隆盐胁迫相关基因GmARF16，
可为大豆耐盐研究提供基因资源，为抗逆大豆新品种的培育做出贡献。

发明内容

[0005] 本发明的目的之一在于提供一种编码大豆ARF转录因子的GmARF16基因。

[0006] 本发明的第二个目的是提供一种上述基因编码的蛋白。

[0007] 本发明的第三个目的是提供一种能够突变该基因的表达载体，即GmARF16基因编辑载体。

[0008] 本发明的第四个目的是提供一种含有该表达载体的宿主细胞。

[0009] 本发明的最主要的一个目的在于提供通过抑制该基因的表达在提高大豆抗盐性中的应用。

[0010] 本发明的技术方案概述如下：

[0011] 一种编码大豆ARF转录因子的GmARF16基因，它是SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。所述的核苷酸序列由2103个碱基组成。所述GmARF16基因具有调节植物抗盐的功能。

[0012] 上述基因编码的蛋白质，它是SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。所述的序列由700个氨基酸残基组成(1)。

[0013] 上述GmARF16基因编码的蛋白还可以包括将SEQ ID NO.2氨基酸序列经过一个或多个(如1‑30个；较佳地1‑20个；更佳地1‑10个；如5个，3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加
而形成的，且具有(1)蛋白功能的由(1)衍生的蛋白；或与(1)限定的蛋白序列有80％(较佳
地90％以上，如95％，98％，99％或更高)以上同源性且具有(1)蛋白功能的由(1)衍生的蛋
白。

[0014] 也就是说本发明所保护的基因的功能，不仅包括上述GmARF16基因，还包括与SEQ ID NO.1具有较高同源性(如同源性高于40％；较佳地高于50％；较佳地高于60％；更佳地高
于70％；更佳地高于80％；更佳地高于90％；更佳地高于95％；更佳地高于98％)的同源基
因。

[0015] 含有上述基因的转基因细胞系、重组菌、重组载体、表达载体以及含有该表达载体的宿主细胞，也落入本发明的保护范围之内。

[0016] 所述基因具有促进大豆根瘤产生的功能，和GmARF16基因编辑突变体植株相比，其根瘤数量较多。可见，大豆GmARF16能够影响根瘤的生长发育。

[0017] GmARF16基因编辑载体、基因编辑遗传材料以及含有所述载体的宿主细胞及其构建方法也落入本发明的保护范围之内。含有上述基因的CRISPR/Cas载体pGEL201×U6‑
GmARF16，它能够将GmARF16基因突变。具体地，本发明通过利用CRISPR/Cas载体，通过农杆
菌介导的大豆毛状根遗传转化，快速获得嵌合体转基因植株，成功将GmARF16基因突变，也
就是说抑制了该基因的功能表达，能够提高大豆抗盐性，并且能够抑制大豆根瘤产生。

[0018] 本发明中，对于适用于本发明的植物没有特别的限制，只要其适合进行基因的转化操作，如各种农作物、花卉植物、或林业植物等。所述的植物比如可以是(不限于)：双子叶
植物、单子叶植物或裸子植物。

[0019] 作为一种实施方式，所述的“植物”包括但不限于：大豆，凡是具有该基因或者与之同源的基因均适用。尤其适用于需要提高耐盐性的植物，在实际的应用过程中，对于需要提
高耐盐性的植物，均可以通过转基因的方式培育转入该基因的株系。

[0020] 本发明中所说的“植物”包括整株植物，其亲本和子代植株以及植物的不同部位，包括种子、果实、芽、茎、叶、根(包括块茎)、花、组织和器官，在这些不同的部分均有我们目
的基因或者核酸。这里所提及的“植物”也包括植物细胞、悬浮培养物、愈伤组织、胚、分生组
织区、配子体、孢子体、花粉和小孢子，同样，其中每种前述对象包含目的基因/核酸。

[0021] 本发明包括任何植物细胞，或任何由其中的方法获得或可获得的植物，以及所有的植物部分及其繁殖体。本专利也包含由任何前述方法所获得的转染细胞、组织、器官或完
整植物。唯一的要求是子代表现出相同的基因型或表型特征，使用本专利中的方法获得的
子代特性相同。

[0022] 本发明还扩展到如上所述的植物的可收获的部分，但不限于种子、叶、果实、花、茎、根、根茎、块茎和球茎。同时进一步涉及植株收获后的其他衍生物，如干燥颗粒或粉末、
油、脂肪和脂肪酸、淀粉或蛋白质。本发明还涉及由相关植物获得的食品或食品添加剂。

[0023] 本发明的优点：

[0024] 本发明首次公开了一种编码大豆ARF转录因子的GmARF16基因，在对其功能进行鉴定的过程中，本发明利用CRISPR/Cas载体，通过农杆菌介导的大豆毛状根遗传转化，快速获
得嵌合体转基因植株，成功将GmARF16基因突变，对嵌合体转基因植株进行了抗盐性分析，
结果表明突变GmARF16基因能够提高大豆的抗盐性，并且能够抑制大豆根瘤产生。

[0025] 发明人利用基因编辑技术将GmARF16基因从大豆中敲除进行功能验证，有利于从分子机制上阐明GmARF16基因在植物发育和植物耐盐性中的作用，为大豆分子育种提供理
论基础和基因资源。

[0026] 对于盐碱地区，需要培育一些耐盐性的植物来适应该地区的生长，可以通过敲除GmARF16基因或者同源基因的方式培育一些新品种。

附图说明

[0027] 图1.GmARF16序列结构分析；

[0028] 图2.盐胁迫诱导GmARF16的表达；

[0029] 图3.GmARF16在不同组织中的表达；

[0030] 图4.盐胁迫下突变体植株与对照耐盐性鉴定(EV：空载对照；CR‑GmARF16：GmARF16突变体植株)；

[0031] 图5.突变体植株与对照在盐处理下的根相对伸长率(EV：空载对照；CR‑GmARF16：GmARF16突变体植株)；

[0032] 图6.突变体植株靶位点基因编辑鉴定(双峰视为存在基因编辑)；

[0033] 图7.突变体植株与对照根瘤生长表型(EV：空载对照；CR‑GmARF16：GmARF16突变体植株)。

具体实施方式

[0034] 下面将通过具体实施例对本发明进行详细的描述。提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。

[0035] 若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。下述实施例中的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。如无特殊说明，所采用的试剂及材
料，均可以通过商业途径获得。

[0036] 除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述
的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

[0037] 除非另有说明，本发明的实施将使用本领域技术人员显而易见的植物学常规技术、微生物、组织培养、分子生物学、化学、生物化学、DNA重组及生物信息学技术。这些技术
均在已经公开的文献中进行了充分解释，另外，本发明所采用的DNA提取、系统发育树的构
建、基因编辑方法、基因编辑载体的构建、基因编辑植物获得等方法，除了下述实施例采用
的方法外，采用现有文献中已经公开的方法均能实现。

[0038] 此处使用的“核酸”、“核酸序列”、“核苷酸”、“核酸分子”或“多聚核苷酸”术语意思是指包括分离的DNA分子(例如，cDNA或者基因组DNA)，RNA分子(例如，信使RNA)，自然类型，
突变类型，合成的DNA或RNA分子，核苷酸类似物组成的DNA或RNA分子，单链或是双链结构。
这些核酸或多聚核苷酸包括基因编码序列、反义序列及非编码区的调控序列，但不仅限于
此。这些术语包括一个基因。“基因”或“基因序列”广泛用来指一有功能的DNA核酸序列。因
此，基因可能包括基因组序列中的内含子和外显子，和/或包括cDNA中的编码序列，和/或包
括cDNA及其调控序列。在特殊实施方案中，例如有关分离的核酸序列，优先默认其为cDNA。

[0039] 另外，为了对本发明技术方案更直观的理解，对于本发明涉及到的一些专业术语解释如下：

[0040] “基因编辑”，Gene editing，是一种新兴的精确对生物体基因组特定靶序列进行修饰的基因功能技术。

[0041] “基因敲除”，Gene knockout，是通过同源重组将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点，以达到定点修饰改造染色体上某一基因的目的的一种技术。

[0042] “突变体”，Mutant，是指发生突变的个体，具有与野生型不同的表型的特点。

[0043] “表达载体”，Expression vectors，是指在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件(如启动子、RBS、终止子等)，使目的基因能够表达的载体。

[0044] “农杆菌介导转化法”，Agrobacterium‑mediated transformation，指将目的基因插入到经过改造的T‑DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然
后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株的技术。

[0045] 实施例

[0046] 本发明的发明人利用生物信息学技术在大豆基因组基础上得到GmARF16基因序列。通过分子克隆克隆了GmARF16基因的编码框序列。另外利用CRISPR/Cas9基因编辑系统
在大豆中对GmARF16基因进行了编辑，获得了其功能缺失突变体，并对其基因编辑植株进行
功能验证。

[0047] 与传统转基因技术相比，CRISPR/Cas9基因编辑技术存在许多优点。传统转基因技术是将外源目的基因导入目的生物体中，从而改变植物性状，目的基因在受体基因组中的
插入位置是随机的，而CRISPR/Cas9基因编辑技术没有外源基因的导入，只对内源基因进行
修饰，其更加安全、高效；其次，CRISPR/Cas9基因编辑技术可以实现同时对多个位点进行编
辑，并能够对突变或插入位点实现精确调控，这是传统转基因技术所无法完成的；另外，传
统转基因技术只能在RNA水平上下调目的基因的表达，并不能完全抑制其转录，且遗传不稳
定，而CRISPR/Cas9基因编辑技术能够实现靶基因的突变，更加稳定可靠。

[0048] 一、编码大豆ARF转录因子的GmARF16基因的获取

[0049] 利用转录组、基因组和蛋白组学等多种技术手段筛选得到一个编码大豆ARF转录因子的GmARF16基因(图1)，该基因全长编码框核苷酸序列长度为2103bp，由700个氨基酸组
成，经过测序得到其核苷酸序列如序列SEQ ID NO.1所示，其蛋白序列如SEQ ID NO.2所示。

[0050] 二、GmARF16基因对盐胁迫的响应以及在不同部位的表达测定

[0051] 在两叶一心期取用0.9％Nacl+1/2Hoagland溶液处理，取不同时间段叶片，液氮速冻后存于‑80℃冰箱中。使用Trizol法提取RNA并反转成cDNA。采用是TAKARA公司的荧光定
量试剂盒。反应在定量PCR仪(Applied Biosystems Stepone Plus)上进行，按照相对定量
的方法检测基因的表达量，反应程序按照TAKARA提供的操作手册进行，大豆Actin基因作为
反应中的内参，引物序列为：

[0052] Actin‑F：CGGTGGTTCTATCTTGGCATC

[0053] Actin‑R：GTCTTTCGCTTCAATAACCCTA

[0054] GmARF16‑F：GTTATTTTTCTTGTGTGTGCGC

[0055] GmARF16‑R：CTTACAGAGCAAAGCATAGCAG

[0056] 取不同部位叶片，液氮速冻后存于‑80℃冰箱中。使用Trizol法提取RNA并反转成cDNA。采用是TAKARA公司的荧光定量试剂盒。反应在定量PCR仪(Applied Biosystems 
Stepone Plus)上进行，按照相对定量的方法检测基因的表达量，反应程序按照TAKARA提供
的操作手册进行，大豆Actin基因作为反应中的内参，引物序列同上。

[0057] 结果显示，GmARF16基因受盐胁迫诱导，并且在根中的表达量高于其它部位(图2、图3)。

[0058] 三、大豆ARF转录因子GmARF16基因的功能鉴定

[0059] 为了研究GmARF16基因在大豆抗盐中的作用，通过构建基因编辑转基因植株来鉴定其功能。

[0060] 3.1基因编辑载体的构建

[0061] 使用CRISPR/Cas9基因编辑系统，通过在线网站(http：//skl.scau.edu.cn/targetdesign/)，预测GmARF16基因的敲除靶点，在靠近起始编码区的CDS上设计SgRNA，按
照说明书构建pGEL201×U6‑GmARF16基因敲除载体。

[0062] (1)利用CRISPR‑GE在线软件找到靶位点，设计合成寡核苷酸，引物序列如下：

[0063] 引物F：ggattgCAGGAATTTGCAGTGAGAAC

[0064] 引物R：aaacGTTCTCACTGCAAATTCCTGca

[0065] (2)将寡核苷酸退火为双链

[0066]

[0067] 94℃反应50s，室温冷却。

[0068] (3)连接载体

[0069]

[0070] 反应条件如下：37℃，5min；20℃，5min；8个循环，转化大肠杆菌DH5α。将其涂布于含100mg/ml卡那霉素抗性的LB平板上。37℃培养，12h后挑取单菌落进行菌落PCR验证，阳性
菌落进行测序，测序引物使用M13通用引物。

[0071] 3.2大豆毛状根遗传转化

[0072] (1)将大豆东农50种植与混合土中，于温室中萌发，待6天大子叶尚未完全展开时，用注射器挑取农杆菌侵染子叶节；

[0073] (2)注射完成后，用透明盖罩住，保持内部潮湿，待长出毛状根后，用蛭石将大豆子叶节侵染位点及其以下部分埋住，浇水浇透。28℃，14h光照/10h黑暗，培养3‑4周，每两天浇
一次水，保持浸染部分的潮湿环境。

[0074] (3)当毛状根长到5‑10cm时，将主根减去，将复合体植株放入清水中，恢复3‑4天，之后用120mM Nacl处理六天，在盐处理前和盐处理后分别测定根长。

[0075] 3.3基因编辑转基因材料的阳性鉴定

[0076] 取单根，提取基因组DNA，在SgRNA靶位点附近设计特异性的PCR引物(F：CTGTTGCAATCACTTACTTGT，R：CCTTCACACAAAACTCTGGG)，将突变位点附近序列进行扩增，进行
测序，测序峰图在突变位点处出现双峰则视为存在基因编辑(图6)。

[0077] 3.4大豆GmARF16基因编辑突变体表型分析

[0078] 在清水中，培养6天后，突变体与对照相比，根相对伸长率无显著性差异，叶片均保持绿色(图4)，而盐处理6天后，突变体植株的根相对伸长率高于对照，突变体植株叶片大部
分保持绿色，而对照植株叶片变黄枯萎，甚至失活，表明在盐胁迫条件下，突变GmARF16基因
能够提高大豆对盐胁迫的耐受性(图4、图5)。

[0079] 同时发现，在大豆毛状根中突变GmARF16基因能够抑制根瘤的产生，在空载对照中，平均每个毛状根生长大约15个根瘤，而每个突变体毛状根中只产生大约8个根瘤，表明
大豆GmARF16能够影响根瘤的生长发育，该基因突变后，显著减少根瘤的产生(图7)。