一种利用霉变水果为碳源发酵合成ε-聚赖氨酸的方法转让专利
申请号 : CN202110618602.3
文献号 : CN113234765B
文献日 : 2022-04-08
发明人 : 曾昕 , 李峰 , 曾化伟 , 徐大勇 , 信丙越 , 张标 , 李珊珊
申请人 : 淮北师范大学
摘要 :
本发明公开了一种利用霉变水果为碳源发酵合成ε‑聚赖氨酸的方法，是以霉变水果为碳源，在ε‑聚赖氨酸的发酵过程中采用补料分批发酵的方式投加，以促进ε‑聚赖氨酸的生物合成。与传统ε‑聚赖氨酸液态发酵相比，本发明所示的以染霉水果为碳源的ε‑聚赖氨酸发酵方法能够显著提高ε‑聚赖氨酸产量、生产强度，在染霉水果无害化、资源化以及ε‑聚赖氨酸工业化生产中具有重要的意义和应用价值。
权利要求 :
1.一种利用霉变水果为碳源发酵合成ε‑聚赖氨酸的方法，其特征在于：以霉变水果为碳源，在ε‑聚赖氨酸的发酵过程中采用补料分批发酵的方式投加，以促进ε‑聚赖氨酸的生物合成；包括如下步骤：步骤1：染霉水果浓缩物的制备
将霉变水果进行充分匀浆，压榨取清液，置于旋转蒸发仪中浓缩，并在80℃烘箱中烘干获得染霉水果浓缩物；所述霉变水果的霉变总面积为20%‑25%；霉变病原菌包括链格孢霉、灰葡萄孢菌、黑曲霉、青霉；
步骤2：ε‑聚赖氨酸发酵种子培养将小白链霉菌接种于固体贝塔纳培养基上，于30℃恒温培养箱中培养10天，直至长出孢子；用接种环挑取2环孢子置于装液量80mL的M3G培养基摇瓶中，于30℃恒温振荡培养箱中200rpm培养1天，获得可用于ε‑聚赖氨酸发酵的成熟小白链霉菌种子液；所述小白链霉菌购于中国工业微生物菌种保藏中心，保藏编号CICC 11022；
步骤3：以染霉水果为碳源的ε‑聚赖氨酸发酵将ε‑聚赖氨酸发酵培养基配好加入到5L发酵罐中，总装液量设置为3L，于115‑121℃灭菌20‑30min；结束冷却至室温后向发酵罐中添加葡萄糖作为初始碳源；以8%的接种量接种小白链霉菌成熟发酵种子培养发酵，在发酵24h后不断流加补充预灭菌的染霉水果浓缩物，并以预灭菌的600 g/L的硫酸铵溶液流加补充氨氮使其浓度位于0.5‑1g/L之间，直至发酵液中总糖消耗殆尽；待发酵pH值自发下降到4.0时，采用自动流加12.5%氨水的方式控制pH值为4.0直至发酵结束。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述霉变水果包括柑橘、梨、葡萄、草莓、猕猴桃、水蜜桃中的一种或几种。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述霉变水果为葡萄。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤3中，初始碳源葡萄糖的添加量为15‑20g/L。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤3中，培养发酵条件为：初始pH值6.8、温度30℃、溶氧保持在30%以上。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤3中，在发酵24h后不断流加补充预灭菌的染霉水果浓缩物，以控制碳源浓度在5‑
15g/L。
说明书 :
一种利用霉变水果为碳源发酵合成ε‑聚赖氨酸的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种ε‑聚赖氨酸的生物合成方法，具体涉及一种利用霉变水果为碳源发酵合成ε‑聚赖氨酸的方法，属于工业生物技术领域。
背景技术
[0002] 我国水果资源丰富、种类繁多，水果在生长及采摘储存过程中极易感染霉菌，导致水果腐烂，腐烂水果含有动物生物毒性物质，难以作为饲料被重新利用。当前，腐烂水果的
处理方式大多和其他有机固废一样，即直接填埋。然而，此种方式缺陷明显，不仅造成了有
机质浪费，且其中病原真菌不会消亡，条件合适将逸出造成二次真菌污染。目前，处理这类
腐烂水果主要以下几种方式，即堆/沤肥发酵生产有机肥，厌氧发酵生产沼气/氢气等。此类
处理方式的优点在于能有效杀死原料中的病原菌、获得易利用的有机肥回用于田、获得部
分可燃气体产品，缺点在于发酵时间过长、发酵过程受环境影响较大、产物单一且附加值
低，具有较大的局限性。“如何将染霉水果进行高值利用”是农业领域的重要研究课题。
处理方式大多和其他有机固废一样，即直接填埋。然而，此种方式缺陷明显，不仅造成了有
机质浪费，且其中病原真菌不会消亡，条件合适将逸出造成二次真菌污染。目前，处理这类
腐烂水果主要以下几种方式，即堆/沤肥发酵生产有机肥，厌氧发酵生产沼气/氢气等。此类
处理方式的优点在于能有效杀死原料中的病原菌、获得易利用的有机肥回用于田、获得部
分可燃气体产品，缺点在于发酵时间过长、发酵过程受环境影响较大、产物单一且附加值
低，具有较大的局限性。“如何将染霉水果进行高值利用”是农业领域的重要研究课题。
[0003] ε‑聚赖氨酸是一种同型阳离子聚合物(聚合度约为25‑35，赖氨酸残基)，主要通过链霉菌属经液态深层发酵而合成，其生产菌包括小白链霉菌、禾粟链霉菌、灰褐链霉菌、北
里孢菌等。鉴于其强大的广谱抑菌效果(抑制细菌、霉菌、酵母生长以及病毒复制)、较高的
安全性(GRAS，美国食品药品管理局认定)、较好的水溶性、较强的热稳定性及pH稳定性，目
前ε‑聚赖氨酸在食品防腐、医药载体、生物芯片、水凝胶方面有着广泛应用，具有较大的社
会需求和经济价值。ε‑聚赖氨酸目前的市场价为1200‑1500元/kg，是一种高附加值产品。
里孢菌等。鉴于其强大的广谱抑菌效果(抑制细菌、霉菌、酵母生长以及病毒复制)、较高的
安全性(GRAS，美国食品药品管理局认定)、较好的水溶性、较强的热稳定性及pH稳定性，目
前ε‑聚赖氨酸在食品防腐、医药载体、生物芯片、水凝胶方面有着广泛应用，具有较大的社
会需求和经济价值。ε‑聚赖氨酸目前的市场价为1200‑1500元/kg，是一种高附加值产品。
[0004] 发明人前期研究发现，霉变水果中的主要病原真菌(链格孢霉、灰葡萄孢菌、黑曲霉、青霉)能够合成一类促进ε‑聚赖氨酸合成的物质，同时霉变水果中的还原糖能够作为碳
源被ε‑聚赖氨酸生产菌利用。本发明基于此开发出一种以小白链霉菌(Streptomyces
albulusIFO 14147)为生产菌，以霉变水果浓缩液为碳源，液态发酵合成ε‑聚赖氨酸的方
法。该方法不仅可解决霉变水果固废问题，还可将该固废“变废为宝”作为碳源用于发酵合
成高值产品——ε‑ 聚赖氨酸，其技术效果更是促进了ε‑聚赖氨酸的生物合成，因此本发明
在霉变水果固废处理和ε‑聚赖氨酸工业化生产方面具有重要的应用价值。
源被ε‑聚赖氨酸生产菌利用。本发明基于此开发出一种以小白链霉菌(Streptomyces
albulusIFO 14147)为生产菌，以霉变水果浓缩液为碳源，液态发酵合成ε‑聚赖氨酸的方
法。该方法不仅可解决霉变水果固废问题，还可将该固废“变废为宝”作为碳源用于发酵合
成高值产品——ε‑ 聚赖氨酸，其技术效果更是促进了ε‑聚赖氨酸的生物合成，因此本发明
在霉变水果固废处理和ε‑聚赖氨酸工业化生产方面具有重要的应用价值。
发明内容
[0005] 为有效处理霉变水果固废，并将其转化为高附加值产品，本发明以“变废为宝”的思路，对可作为ε‑聚赖氨酸发酵碳源的霉变水果种类进行筛选，并以最适宜的霉变水果为
原料，经预处理后作为碳源经三角瓶分批发酵、5L发酵罐分批发酵、补料分批发酵合成ε‑聚
赖氨酸，由此提出了一种利用霉变水果为碳源发酵合成ε‑聚赖氨酸的方法。
原料，经预处理后作为碳源经三角瓶分批发酵、5L发酵罐分批发酵、补料分批发酵合成ε‑聚
赖氨酸，由此提出了一种利用霉变水果为碳源发酵合成ε‑聚赖氨酸的方法。
[0006] 本发明利用霉变水果为碳源发酵合成ε‑聚赖氨酸的方法，是以霉变水果为碳源，在ε‑聚赖氨酸的发酵过程中采用补料分批发酵的方式投加，以促进ε‑聚赖氨酸的生物合
成。
成。
[0007] 具体包括如下步骤：
[0008] 步骤1：染霉水果浓缩物的制备
[0009] 将霉变水果进行充分匀浆，压榨取清液，置于旋转蒸发仪中浓缩，并在80℃烘箱中烘干获得染霉水果浓缩物。
[0010] 步骤2：ε‑聚赖氨酸发酵种子培养
[0011] 将小白链霉菌接种于固体贝塔纳培养基上，于30℃恒温培养箱中培养10天，直至7
长出孢子；用接种环挑取2环孢子(约7×10个)置于装液量80mL的500mLM3G培养基摇瓶中，
于30℃恒温振荡培养箱中200rpm培养1天，获得可用于ε‑聚赖氨酸发酵的成熟小白链霉菌
种子液。
长出孢子；用接种环挑取2环孢子(约7×10个)置于装液量80mL的500mLM3G培养基摇瓶中，
于30℃恒温振荡培养箱中200rpm培养1天，获得可用于ε‑聚赖氨酸发酵的成熟小白链霉菌
种子液。
[0012] 步骤3：以染霉水果为碳源的ε‑聚赖氨酸发酵
[0013] 选择5L液态发酵罐，其中装配2组圆盘六直页涡轮搅拌器。将ε‑聚赖氨酸发酵培养基配好加入到5L发酵罐中，总装液量设置为3L，于115‑121℃灭菌20‑30min；结束冷却至室
温后向发酵罐中添加20g/L葡萄糖作为初始碳源；以8％的接种量接种小白链霉菌成熟发酵
种子，于初始pH值6.8、温度30℃、溶氧保持在30％以上(调控转速控制)的培养条件下发酵，
在发酵24h时不断流加补充预灭菌的60％总糖的染霉水果浓缩物，以控制碳源浓度在5‑
15g/L 之间，并以预灭菌的600g/L的硫酸铵溶液流加补充氨氮使其浓度位于0.5‑1g/L之
间，直至发酵液中总糖消耗殆尽；待发酵pH值自发下降到4.0时，采用自动流加12.5％氨水
的方式控制 pH值为4.0直至发酵结束。
温后向发酵罐中添加20g/L葡萄糖作为初始碳源；以8％的接种量接种小白链霉菌成熟发酵
种子，于初始pH值6.8、温度30℃、溶氧保持在30％以上(调控转速控制)的培养条件下发酵，
在发酵24h时不断流加补充预灭菌的60％总糖的染霉水果浓缩物，以控制碳源浓度在5‑
15g/L 之间，并以预灭菌的600g/L的硫酸铵溶液流加补充氨氮使其浓度位于0.5‑1g/L之
间，直至发酵液中总糖消耗殆尽；待发酵pH值自发下降到4.0时，采用自动流加12.5％氨水
的方式控制 pH值为4.0直至发酵结束。
[0014] 本发明中，所述霉变水果包括柑橘、梨、葡萄、草莓、猕猴桃、水蜜桃等，优选为葡萄；霉变病原菌包括链格孢霉、灰葡萄孢菌、黑曲霉、青霉等。所述霉变水果的霉变总面积为
20％‑25％。
20％‑25％。
[0015] 本发明采用的ε‑聚赖氨酸产生菌为小白链霉菌IFO14147(Streptomyces albulus IFO14147， Streptomyces albulus CICC 11022)，购于中国工业微生物菌种保藏中心
(CICC)。
(CICC)。
[0016] 本发明采用的培养基配方：
[0017] (1)贝塔纳培养基(g/L)：葡萄糖10，酵母粉1，蛋白胨2，琼脂20,pH 7.5；
[0018] (2)ε‑聚赖氨酸发酵种子培养基(g/L)：葡萄糖50，酵母粉5，(NH4)2SO4 10，MgSO4·7H2O 0.5，K2HPO4·3H2O 0.8，KH2PO4 1.36，FeSO4·7H2O 0.03，ZnSO4·7H2O 0.04，pH 6.8；
[0019] (3)ε‑聚赖氨酸发酵培养基(g/L)：碳源(总糖60)，酵母粉5，(NH4)2SO4 10，MgSO4·7H2O 0.5，K2HPO4·3H2O 0.8，KH2PO4 1.36，FeSO4·7H2O 0.03，ZnSO4·7H2O 0.04，pH 6.8。
[0020] 以上凡涉及到葡萄糖，均将含糖物与其他成分分开配制，121℃高温灭菌20min后再合并于同一体系培养基中。
[0021] 与传统ε‑聚赖氨酸液态发酵相比，本发明所示的以染霉水果为碳源的ε‑聚赖氨酸发酵方法能够显著提高ε‑聚赖氨酸产量、生产强度，在染霉水果无害化、资源化以及ε‑聚赖
氨酸工业化生产中具有重要的意义和应用价值。
氨酸工业化生产中具有重要的意义和应用价值。
[0022] 下面结合具体实施例，可以更好地理解本发明。实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件以及结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本
发明。
发明。
具体实施方式
[0023] 具体实施时的反应器包括250mL三角瓶、5L液态发酵罐两种。
[0024] 霉变水果筛选实验均在250mL三角瓶中完成，以霉变水果为碳源的ε‑聚赖氨酸分批发酵、补料分批发酵在5L发酵罐中进行。具体操作步骤如下：
[0025] (一)菌种：
[0026] ε‑聚赖氨酸产生菌，小白链霉菌IFO14147(Streptomyces albulus IFO14147，Streptomyces albulus CICC 11022)，购于中国工业微生物菌种保藏中心(CICC)；水果病
原真菌，链格孢霉、灰葡萄孢菌、黑曲霉、青霉，分离于多种霉变水果。
原真菌，链格孢霉、灰葡萄孢菌、黑曲霉、青霉，分离于多种霉变水果。
[0027] (二)培养基配方：
[0028] 1、贝塔纳培养基(g/L)：葡萄糖10，酵母粉1，蛋白胨2，琼脂20,pH 7.5；
[0029] 2、ε‑聚赖氨酸发酵种子培养基(g/L)：葡萄糖50，酵母粉5，(NH4)2SO4 10，MgSO4·7H2O 0.5，K2HPO4·3H2O 0.8，KH2PO4 1.36，FeSO4·7H2O 0.03，ZnSO4·7H2O 0.04，pH 6.8；
[0030] 3、ε‑聚赖氨酸发酵培养基(g/L)：碳源(总糖60)，酵母粉5，(NH4)2SO4 10，MgSO4·7H2O 0.5，K2HPO4·3H2O 0.8，KH2PO4 1.36，FeSO4·7H2O 0.03，ZnSO4·7H2O 0.04，pH 6.8。
[0031] 以上凡涉及到葡萄糖，均将含糖物与其他成分分开配制，121℃高温灭菌20min后再合并于同一体系培养基中。
[0032] (三)实验步骤：
[0033] 1、固态平板制备霉菌孢子：
[0034] 将链格孢霉、灰葡萄孢菌、黑曲霉、青霉孢子接种于贝塔纳固体培养基中，在28℃培养箱培养5‑10天直至长出孢子，其中灰葡萄孢菌以22℃培养。
[0035] 2、不同染霉水果浓缩物的制备：
[0036] 将水果(柑橘、梨、葡萄、草莓、猕猴桃、水蜜桃)洗净，75％酒精浸泡10min，烘干剩余乙醇和表面水分，将链格孢霉、灰葡萄孢菌、黑曲霉、青霉孢子穿刺接种于水果中，统一在
23℃培养直至约20‑25％水果表面长出霉菌菌斑/块。将霉变水果进行充分匀浆，压榨取清
液，置于旋转蒸发仪中浓缩，并在80℃烘箱中烘干获得水果浓缩物。此浓缩物复溶于水中，
加入终浓度70％乙醇沉淀蛋白，10000rpm离心10min，上清液用液相色谱(Dionex,U‑3000,
USA)测定其中的糖组分和含量。硬件配置：有机酸柱(BIO‑RAD,Aminex HPX‑87H 300×7.8
mm,USA)及示差检测器(Shodex,RI‑101,Japan)。样品物质由5mM H2SO4流动相载负，以
0.6mL/min流速通过柱温为60℃的有机酸分析柱，所分离得到的各组分分别由示差检测器
测定其含量。
23℃培养直至约20‑25％水果表面长出霉菌菌斑/块。将霉变水果进行充分匀浆，压榨取清
液，置于旋转蒸发仪中浓缩，并在80℃烘箱中烘干获得水果浓缩物。此浓缩物复溶于水中，
加入终浓度70％乙醇沉淀蛋白，10000rpm离心10min，上清液用液相色谱(Dionex,U‑3000,
USA)测定其中的糖组分和含量。硬件配置：有机酸柱(BIO‑RAD,Aminex HPX‑87H 300×7.8
mm,USA)及示差检测器(Shodex,RI‑101,Japan)。样品物质由5mM H2SO4流动相载负，以
0.6mL/min流速通过柱温为60℃的有机酸分析柱，所分离得到的各组分分别由示差检测器
测定其含量。
[0037] 3、ε‑聚赖氨酸发酵种子培养：
[0038] 将小白链霉菌接种于固体贝塔纳培养基上，于30℃恒温培养箱中培养10天，直至7
长出孢子；用接种环挑取2环孢子(约7×10个)置于装液量80mL的500mLM3G培养基摇瓶中，
于30℃恒温振荡培养箱中200rpm培养1天，获得可用于ε‑聚赖氨酸发酵的成熟小白链霉菌
种子液。
长出孢子；用接种环挑取2环孢子(约7×10个)置于装液量80mL的500mLM3G培养基摇瓶中，
于30℃恒温振荡培养箱中200rpm培养1天，获得可用于ε‑聚赖氨酸发酵的成熟小白链霉菌
种子液。
[0039] 4、以染霉水果为碳源的ε‑聚赖氨酸三角瓶发酵：
[0040] 本部分ε‑聚赖氨酸发酵培养基中的碳源为不同染霉水果浓缩物，以之调整培养基终总糖浓度为60g/L。往装有30mL以上培养基的250mL三角瓶中，添加8％接种量的成熟小白
链霉菌种子液，在30℃200rpm环境下培养24h，此后在超净台中加入终浓度为20g/L的柠檬
酸钠缓冲液(pH 4.0)以控制三角瓶发酵中的pH为3.5‑4.5，继续发酵至48h结束，取出发酵
液测定其中的ε‑聚赖氨酸浓度。
链霉菌种子液，在30℃200rpm环境下培养24h，此后在超净台中加入终浓度为20g/L的柠檬
酸钠缓冲液(pH 4.0)以控制三角瓶发酵中的pH为3.5‑4.5，继续发酵至48h结束，取出发酵
液测定其中的ε‑聚赖氨酸浓度。
[0041] 5、以染霉葡萄为碳源的5L发酵罐中ε‑聚赖氨酸分批发酵：
[0042] 本部分按照两种情况进行：(1)发酵至始至终均采用染霉葡萄浓缩物为碳源，终总糖浓度为60g/L；(2)0h添加终浓度15g/L葡萄糖作为碳源，在24h时加入终浓度45g/L总糖的
霉变葡萄浓缩物作为碳源，发酵至碳源全部消耗完。
霉变葡萄浓缩物作为碳源，发酵至碳源全部消耗完。
[0043] 选择5L液态发酵罐，其中装配2组圆盘六直页涡轮搅拌器。将ε‑聚赖氨酸发酵培养基配好加入到5L发酵罐中，总装液量设置为3L，于115‑121℃灭菌20‑30min，结束冷却至室
温后将以115‑121℃单独灭菌20‑30min的染霉葡萄浓缩物加入发酵罐。以8％的接种量接种
小白链霉菌成熟发酵种子，于初始pH值6.8、温度30℃、溶氧保持在30％以上(调控转速控
制) 的培养条件下发酵，直至发酵液中总糖消耗殆尽；待发酵pH值自发下降到4.0时，采用
自动流加12.5％氨水的方式控制pH值为4.0直至分批发酵结束。对照组发酵罐碳源为等浓
度的葡萄糖，同样分开灭菌并待体系冷却后于发酵前加入。本发酵过程中，每隔12h取样测
定ε‑聚赖氨酸浓度、菌体干重和残糖浓度。
温后将以115‑121℃单独灭菌20‑30min的染霉葡萄浓缩物加入发酵罐。以8％的接种量接种
小白链霉菌成熟发酵种子，于初始pH值6.8、温度30℃、溶氧保持在30％以上(调控转速控
制) 的培养条件下发酵，直至发酵液中总糖消耗殆尽；待发酵pH值自发下降到4.0时，采用
自动流加12.5％氨水的方式控制pH值为4.0直至分批发酵结束。对照组发酵罐碳源为等浓
度的葡萄糖，同样分开灭菌并待体系冷却后于发酵前加入。本发酵过程中，每隔12h取样测
定ε‑聚赖氨酸浓度、菌体干重和残糖浓度。
[0044] 6、以染霉葡萄为碳源的5L发酵罐中ε‑聚赖氨酸补料分批发酵：
[0045] 本部分按照两种情况进行：(1)发酵至始至终均采用染霉葡萄浓缩物为碳源；(2)发酵初期利用葡萄糖(添加20g/L葡萄糖)，在24h时以染霉葡萄浓缩物为碳源进行补料，直
至发酵结束。
至发酵结束。
[0046] 情况(1)，选择与上述分批发酵相同的发酵罐及相关培养基、培养条件，不同之处在于在碳源耗完后立即补充预灭菌的60％总糖的染霉葡萄浓缩液，以控制碳源浓度在5‑
15g/L之间，并以预灭菌的600g/L的硫酸铵溶液流加补充氨氮使其浓度位于0.5‑1g/L之间。
发酵持续 168h(7d)，本发酵过程中，每隔12h取样测定ε‑聚赖氨酸浓度、菌体干重和残糖浓
度。
15g/L之间，并以预灭菌的600g/L的硫酸铵溶液流加补充氨氮使其浓度位于0.5‑1g/L之间。
发酵持续 168h(7d)，本发酵过程中，每隔12h取样测定ε‑聚赖氨酸浓度、菌体干重和残糖浓
度。
[0047] 情况(2)，选择与上述分批发酵相同的发酵罐、培养条件，不同之处在于初始培养基碳源为20g/L葡萄糖，在24h时补充预灭菌的60％总糖的染霉葡萄浓缩液，以控制碳源浓
度在5‑15g/L之间，并以预灭菌的600g/L的硫酸铵溶液流加补充氨氮使其浓度位于0.5‑1g/
L之间。发酵持续168h(7d)，本发酵过程中，每隔12h取样测定ε‑聚赖氨酸浓度、菌体干重和
残糖浓度。
度在5‑15g/L之间，并以预灭菌的600g/L的硫酸铵溶液流加补充氨氮使其浓度位于0.5‑1g/
L之间。发酵持续168h(7d)，本发酵过程中，每隔12h取样测定ε‑聚赖氨酸浓度、菌体干重和
残糖浓度。
[0048] 7、样品的检测：
[0049] 发酵液样品经4500rpm离心10min后，上清液用于测定ε‑聚赖氨酸浓度和总糖浓度，下层菌体用于测定菌体干重。ε‑聚赖氨酸浓度采用甲基橙法测定，即用0.7mM pH 7.0磷
酸钠缓冲液将发酵上清液适当稀释，取2mL稀释液与2mL 1mM甲基橙溶液进行反应，混合液
在 30℃条件下反应30min后4,500×g离心15min。上清经上述磷酸缓冲液稀释20倍后在
465nm 处测定吸光度，并参照预先制备得到的吸光度与ε‑聚赖氨酸标准品对应的标准曲线
计算得到ε‑聚赖氨酸的浓度。葡萄糖采用HPLC法测定，即采用高效液相色谱仪(Dionex,U‑
3000,USA) 测定发酵上清液中的葡萄糖浓度。硬件配置：有机酸柱(BIO‑RAD,Aminex HPX‑
87H 300×7.8 mm,USA)及示差检测器(Shodex,RI‑101,Japan)。样品物质由5mM H2SO4流动
相载负，以 0.6mL/min流速通过柱温为60℃的有机酸分析柱，所分离得到的各组分分别由
示差检测器测定其含量。菌体干重(DCW)采用滤纸差量测重法。菌体沉淀加蒸馏水洗涤两
次，用预先105℃烘干并称重的滤纸进行抽滤，之后滤纸置于105℃烘干至恒重后称重，计算
前后重量差值。
酸钠缓冲液将发酵上清液适当稀释，取2mL稀释液与2mL 1mM甲基橙溶液进行反应，混合液
在 30℃条件下反应30min后4,500×g离心15min。上清经上述磷酸缓冲液稀释20倍后在
465nm 处测定吸光度，并参照预先制备得到的吸光度与ε‑聚赖氨酸标准品对应的标准曲线
计算得到ε‑聚赖氨酸的浓度。葡萄糖采用HPLC法测定，即采用高效液相色谱仪(Dionex,U‑
3000,USA) 测定发酵上清液中的葡萄糖浓度。硬件配置：有机酸柱(BIO‑RAD,Aminex HPX‑
87H 300×7.8 mm,USA)及示差检测器(Shodex,RI‑101,Japan)。样品物质由5mM H2SO4流动
相载负，以 0.6mL/min流速通过柱温为60℃的有机酸分析柱，所分离得到的各组分分别由
示差检测器测定其含量。菌体干重(DCW)采用滤纸差量测重法。菌体沉淀加蒸馏水洗涤两
次，用预先105℃烘干并称重的滤纸进行抽滤，之后滤纸置于105℃烘干至恒重后称重，计算
前后重量差值。
[0050] 实施例1：各水果染霉前后主要含糖组分对比
[0051] 将水果(柑橘、梨、葡萄、草莓、猕猴桃、水蜜桃)洗净，75％酒精浸泡10min，烘干剩余乙醇和表面水分，将链格孢霉、灰葡萄孢菌、黑曲霉、青霉孢子穿刺接种于水果中，统一在
23℃培养直至约20‑25％水果表面长出霉菌菌斑/块。将霉变水果加水后进行充分匀浆，保
留匀浆液。匀浆液适当稀释后和无水乙醇以3：7体积混合，静置1h，10000rpm离心10min，上
清液用液相色谱(Dionex,U‑3000,USA)测定其中的糖组分和含量。硬件配置：有机酸柱
(BIO‑RAD,Aminex HPX‑87H 300×7.8mm,USA)及示差检测器(Shodex,RI‑101,Japan)。样品
物质由5mM H2SO4流动相载负，以0.6mL/min流速通过柱温为60℃的有机酸分析柱，所分离得
到的各组分分别由示差检测器测定其含量，最终获得数据如表1、2、3、4、5所示。可知，不同
水果含糖量不同，其中葡萄的总糖含量最高，且大多由单糖组成(葡萄糖：果糖≈1： 1)；被
不同霉菌侵染的水果在主要糖含量上均有一定的减少，但仍然存在大量未被利用的糖，其
中染霉后含糖量最多，且单糖比例最高的水果仍然是葡萄。
23℃培养直至约20‑25％水果表面长出霉菌菌斑/块。将霉变水果加水后进行充分匀浆，保
留匀浆液。匀浆液适当稀释后和无水乙醇以3：7体积混合，静置1h，10000rpm离心10min，上
清液用液相色谱(Dionex,U‑3000,USA)测定其中的糖组分和含量。硬件配置：有机酸柱
(BIO‑RAD,Aminex HPX‑87H 300×7.8mm,USA)及示差检测器(Shodex,RI‑101,Japan)。样品
物质由5mM H2SO4流动相载负，以0.6mL/min流速通过柱温为60℃的有机酸分析柱，所分离得
到的各组分分别由示差检测器测定其含量，最终获得数据如表1、2、3、4、5所示。可知，不同
水果含糖量不同，其中葡萄的总糖含量最高，且大多由单糖组成(葡萄糖：果糖≈1： 1)；被
不同霉菌侵染的水果在主要糖含量上均有一定的减少，但仍然存在大量未被利用的糖，其
中染霉后含糖量最多，且单糖比例最高的水果仍然是葡萄。
[0052] 表1各水果中的主要糖含量
[0053]
[0054] 表2被链格孢霉侵染20‑25％面积的各水果中主要糖含量
[0055]
[0056] 表3被灰葡萄孢菌侵染20‑25％面积的各水果中主要糖含量
[0057]
[0058] 表4被黑曲霉侵染20‑25％面积的各水果中主要糖含量
[0059]
[0060] 表5被青霉侵染20‑25％面积的各水果中主要糖含量
[0061]
[0062] 实施例2：三角瓶中添加各霉菌菌体诱导物分批发酵合成ε‑聚赖氨酸
[0063] 选取链格孢霉、灰葡萄孢、黑曲霉、青霉孢子，分别接种于YPD培养基中，链格孢霉、黑曲霉、青霉在28℃下160rpm培养2天，灰葡萄孢菌在24℃160rpm下培养3天，离心收集菌体
细胞。细胞用去离子水洗涤3遍后，加入终浓度为75％乙醇，用研钵研磨菌体，并浸泡 6h，
4500rpm离心10min，取上清液旋转蒸发浓缩后置于烘箱干燥，提取物用适量水复溶后 115
℃灭菌15min，置于4℃冷藏。
细胞。细胞用去离子水洗涤3遍后，加入终浓度为75％乙醇，用研钵研磨菌体，并浸泡 6h，
4500rpm离心10min，取上清液旋转蒸发浓缩后置于烘箱干燥，提取物用适量水复溶后 115
℃灭菌15min，置于4℃冷藏。
[0064] 以上不同真菌提取物以终浓度为36g细胞湿重/L的量添加进三角瓶中进行ε‑聚赖氨酸分批发酵，添加时间分为0h和24h。发酵过程如下，往装有30mL发酵培养基的250mL三角
瓶中添加8％接种量的成熟小白链霉菌种子液，在30℃200rpm环境下培养24h，此后在超净
台中加入终浓度为20g/L的柠檬酸钠缓冲液(pH 4.0)，继续发酵至48h结束，取出发酵液测
定其中的ε‑聚赖氨酸浓度。对照(不添加任何物质)产量为0.62g/L，而真菌提取物添加产量
分别为：链格孢霉0.89g/L(0h)，1.12g/L(24h)添加；灰葡萄孢菌0.92g/L(0h)，1.18g/L
(24h) 添加；黑曲霉0.97g/L(0h)，1.32g/L(24h)添加；青霉0.99g/L(0h)，1.45g/L(24h)添
加。可以发现，0h和24h添加不同的水果主要霉变致病菌提取物，均能够提高ε‑聚赖氨酸生
物合成水平，其中24h添加最优。
瓶中添加8％接种量的成熟小白链霉菌种子液，在30℃200rpm环境下培养24h，此后在超净
台中加入终浓度为20g/L的柠檬酸钠缓冲液(pH 4.0)，继续发酵至48h结束，取出发酵液测
定其中的ε‑聚赖氨酸浓度。对照(不添加任何物质)产量为0.62g/L，而真菌提取物添加产量
分别为：链格孢霉0.89g/L(0h)，1.12g/L(24h)添加；灰葡萄孢菌0.92g/L(0h)，1.18g/L
(24h) 添加；黑曲霉0.97g/L(0h)，1.32g/L(24h)添加；青霉0.99g/L(0h)，1.45g/L(24h)添
加。可以发现，0h和24h添加不同的水果主要霉变致病菌提取物，均能够提高ε‑聚赖氨酸生
物合成水平，其中24h添加最优。
[0065] 实施例3：三角瓶中以各染霉水果浓缩液为碳源分批发酵合成ε‑聚赖氨酸
[0066] 将不同染霉水果(约20‑25％面积)充分匀浆，4500rpm离心10min，上清液置于旋转蒸发仪中加热浓缩，浓缩物在4℃冰箱保存3‑7天。以不同染霉水果浓缩物为碳源，配制ε‑聚
赖氨酸发酵培养基，使得其总糖为60g/L。往装有30mL发酵培养基的250mL三角瓶中添加8％
接种量的成熟小白链霉菌种子液，在30℃200rpm环境下培养24h，此后在超净台中加入终浓
度为20g/L的柠檬酸钠缓冲液(pH 4.0)，继续发酵至48h结束，取出发酵液测定其中的ε‑聚
赖氨酸浓度。最终结果为：葡萄糖为碳源的对照实验组(0.61g/L)；(1)柑橘组：无霉菌污染
(0.33g/L)，链格孢霉(0.46g/L)，灰葡萄孢(0.42g/L)，黑曲霉(0.47g/L)，青霉(0.52g/L)；
(2)梨组：无霉菌污染(0.52g/L)，链格孢霉(0.78g/L)，灰葡萄孢(0.87g/L)，黑曲霉(0.93
g/L)，青霉(1.04g/L)；(3)葡萄组：无霉菌污染(0.87g/L)，链格孢霉(0.94g/L)，灰葡萄孢
(0.95g/L)，黑曲霉(1.24g/L)，青霉(1.25g/L)；(4)草莓组：无霉菌污染(0.57g/L)，链格孢
霉(0.68g/L)，灰葡萄孢(0.73g/L)，黑曲霉(0.81g/L)，青霉(0.87g/L)；(5)猕猴桃组：无霉
菌污染(0.74g/L)，链格孢霉(0.81g/L)，灰葡萄孢(0.92g/L)，黑曲霉(1.05g/L)，青霉
(1.14g/L)；(6)水蜜桃组：无霉菌污染(0.12g/L)，链格孢霉(0.21g/L)，灰葡萄孢 (0.23g/
L)，黑曲霉(0.24g/L)，青霉(0.29g/L)。由此可知，相比为染霉的水果浓缩物，染霉后水果作
为碳源均能够一定程度促进ε‑聚赖氨酸合成；葡萄中含有大量的糖分，且绝大部分为单还
原糖，相比单一葡萄糖碳源，能获得更高的ε‑聚赖氨酸合成水平；当染霉葡萄作为碳源时，
ε‑聚赖氨酸产量相比对照均得到不同程度提高，其中以感染黑曲霉、青霉的葡萄为甚，48h
产量分别达到1.24g/L、1.25g/L，提高幅度显著。因此，染霉葡萄可视为ε‑聚赖氨酸合成的
优秀碳源。
赖氨酸发酵培养基，使得其总糖为60g/L。往装有30mL发酵培养基的250mL三角瓶中添加8％
接种量的成熟小白链霉菌种子液，在30℃200rpm环境下培养24h，此后在超净台中加入终浓
度为20g/L的柠檬酸钠缓冲液(pH 4.0)，继续发酵至48h结束，取出发酵液测定其中的ε‑聚
赖氨酸浓度。最终结果为：葡萄糖为碳源的对照实验组(0.61g/L)；(1)柑橘组：无霉菌污染
(0.33g/L)，链格孢霉(0.46g/L)，灰葡萄孢(0.42g/L)，黑曲霉(0.47g/L)，青霉(0.52g/L)；
(2)梨组：无霉菌污染(0.52g/L)，链格孢霉(0.78g/L)，灰葡萄孢(0.87g/L)，黑曲霉(0.93
g/L)，青霉(1.04g/L)；(3)葡萄组：无霉菌污染(0.87g/L)，链格孢霉(0.94g/L)，灰葡萄孢
(0.95g/L)，黑曲霉(1.24g/L)，青霉(1.25g/L)；(4)草莓组：无霉菌污染(0.57g/L)，链格孢
霉(0.68g/L)，灰葡萄孢(0.73g/L)，黑曲霉(0.81g/L)，青霉(0.87g/L)；(5)猕猴桃组：无霉
菌污染(0.74g/L)，链格孢霉(0.81g/L)，灰葡萄孢(0.92g/L)，黑曲霉(1.05g/L)，青霉
(1.14g/L)；(6)水蜜桃组：无霉菌污染(0.12g/L)，链格孢霉(0.21g/L)，灰葡萄孢 (0.23g/
L)，黑曲霉(0.24g/L)，青霉(0.29g/L)。由此可知，相比为染霉的水果浓缩物，染霉后水果作
为碳源均能够一定程度促进ε‑聚赖氨酸合成；葡萄中含有大量的糖分，且绝大部分为单还
原糖，相比单一葡萄糖碳源，能获得更高的ε‑聚赖氨酸合成水平；当染霉葡萄作为碳源时，
ε‑聚赖氨酸产量相比对照均得到不同程度提高，其中以感染黑曲霉、青霉的葡萄为甚，48h
产量分别达到1.24g/L、1.25g/L，提高幅度显著。因此，染霉葡萄可视为ε‑聚赖氨酸合成的
优秀碳源。
[0067] 实施例4：5L发酵罐中以染霉葡萄浓缩液为碳源分批发酵合成ε‑聚赖氨酸
[0068] 霉变葡萄浓缩物制备：选择霉变葡萄，霉变真菌菌斑主要为灰葡萄孢、黑曲霉、青霉的一种或几种，霉变总面积约20％‑25％，充分匀浆，压榨取清液，置于旋转蒸发仪中浓
缩，并在80℃烘箱中烘干获得霉变葡萄浓缩物。
缩，并在80℃烘箱中烘干获得霉变葡萄浓缩物。
[0069] 分批发酵对比：选择5L液态发酵罐，其中装配2组圆盘六直页涡轮搅拌器。将ε‑聚赖氨酸发酵培养基配好，加入到5L发酵罐中，总装液量设置为3L，于115‑121℃灭菌20‑
30min，结束冷却至室温后将以115‑121℃单独灭菌20‑30min的霉变葡萄浓缩物或葡萄糖加
入发酵罐作为碳源使用。以8％的接种量接种小白链霉菌成熟发酵种子，于初始pH值6.8、温
度30℃、溶氧保持在30％以上(调控转速)的培养条件下发酵，直至发酵液中糖消耗殆尽；待
发酵pH 值自发下降到4.0时，采用自动流加12.5％氨水的方式控制pH值为4.0，直至分批发
酵结束。此部分分为三组实验，分别为：实验组1，霉变葡萄浓缩物在发酵起始加入培养基
中，终总糖浓度60g/L；实验组2，起始添加终浓度20g/L葡萄糖，24h后一次性加入终浓度为
40g/L 霉变葡萄浓缩物作为碳源直至所有碳源耗尽；对照组，起始添加60g/L葡萄糖，发酵
至所有碳源消耗殆尽。本发酵过程中，每隔12h取样测定ε‑聚赖氨酸浓度、菌体干重。
30min，结束冷却至室温后将以115‑121℃单独灭菌20‑30min的霉变葡萄浓缩物或葡萄糖加
入发酵罐作为碳源使用。以8％的接种量接种小白链霉菌成熟发酵种子，于初始pH值6.8、温
度30℃、溶氧保持在30％以上(调控转速)的培养条件下发酵，直至发酵液中糖消耗殆尽；待
发酵pH 值自发下降到4.0时，采用自动流加12.5％氨水的方式控制pH值为4.0，直至分批发
酵结束。此部分分为三组实验，分别为：实验组1，霉变葡萄浓缩物在发酵起始加入培养基
中，终总糖浓度60g/L；实验组2，起始添加终浓度20g/L葡萄糖，24h后一次性加入终浓度为
40g/L 霉变葡萄浓缩物作为碳源直至所有碳源耗尽；对照组，起始添加60g/L葡萄糖，发酵
至所有碳源消耗殆尽。本发酵过程中，每隔12h取样测定ε‑聚赖氨酸浓度、菌体干重。
[0070] 其中，实验组1发酵总时间为58.1h，ε‑聚赖氨酸产量为3.12g/L，菌体干重为14.51g/L，生产强度为0.054g/L/h；实验组2发酵总时间为50.1h，ε‑聚赖氨酸产量为4.72g/
L，菌体干重为18.50g/L，生产强度为0.094g/L/h；对照组(添加等体积水)发酵总时间为
61.7h，ε‑聚赖氨酸产量为2.83g/L，菌体干重为12.21g/L，生产强度为0.046g/L/h。可知，相
比对照组，实验组1的ε‑聚赖氨酸产量提高了10.24％，菌体干重提高18.75％，发酵时间缩
减3.6h，生产强度提高17.39％，发酵水平提升；实验组2的ε‑聚赖氨酸产量提高了66.78％，
菌体干重提高51.51％，发酵时间缩减11.6h，生产强度提高了104.34％，发酵水平大幅提
升。
L，菌体干重为18.50g/L，生产强度为0.094g/L/h；对照组(添加等体积水)发酵总时间为
61.7h，ε‑聚赖氨酸产量为2.83g/L，菌体干重为12.21g/L，生产强度为0.046g/L/h。可知，相
比对照组，实验组1的ε‑聚赖氨酸产量提高了10.24％，菌体干重提高18.75％，发酵时间缩
减3.6h，生产强度提高17.39％，发酵水平提升；实验组2的ε‑聚赖氨酸产量提高了66.78％，
菌体干重提高51.51％，发酵时间缩减11.6h，生产强度提高了104.34％，发酵水平大幅提
升。
[0071] 实施例5：5L发酵罐中以染霉葡萄浓缩液为碳源补料分批发酵合成ε‑聚赖氨酸
[0072] 霉变葡萄浓缩物制备：选择霉变葡萄，霉变真菌菌斑主要为灰葡萄孢、黑曲霉、青霉的一种或几种，霉变总面积约20％‑25％，充分匀浆，压榨取清液，置于旋转蒸发仪中浓
缩，并在80℃烘箱中烘干获得霉变葡萄浓缩物。
缩，并在80℃烘箱中烘干获得霉变葡萄浓缩物。
[0073] 补料分批发酵对比：选择与上述分批发酵相同的发酵罐及相关培养基、培养条件，不同之处在于在碳源耗完后立即补充预灭菌的60％葡萄糖溶液，以控制碳源浓度在5‑15g/
L之间，以预灭菌的600g/L的硫酸铵溶液流加补充氨氮使其浓度位于0.5‑1g/L之间。发酵持
续168h (7d)，本发酵过程中，每隔12h取样测定ε‑聚赖氨酸浓度、菌体干重和残葡萄糖浓
度。本实施例分为两组：(1)实验组，即起始添加终浓度20g/L葡萄糖作为唯一碳源，24h后不
断流加霉变葡萄浓缩物作为碳源直至发酵结束，除前期24h发酵使用葡萄糖为唯一碳源外，
其余时间均采用霉变葡萄浓缩物作为唯一碳源；(2)对照组，起始添加60g/L葡萄糖作为唯
一碳源，后期不断流加预灭菌葡萄糖直至发酵结束，全过程只有葡萄糖一种碳源。最终，实
验组发酵ε‑聚赖氨酸最终产量为37.75g/L，菌体干重为33.28g/L；对照组发酵ε‑聚赖氨酸
最终产量为 22.14g/L，菌体干重为22.78g/L；可知，相比对照组，实验组ε‑聚赖氨酸产量为
对照的1.70 倍，这说明染霉水果能够“变废为宝”，作为有效碳源在ε‑聚赖氨酸补料分批发
酵中促进产物的合成。
L之间，以预灭菌的600g/L的硫酸铵溶液流加补充氨氮使其浓度位于0.5‑1g/L之间。发酵持
续168h (7d)，本发酵过程中，每隔12h取样测定ε‑聚赖氨酸浓度、菌体干重和残葡萄糖浓
度。本实施例分为两组：(1)实验组，即起始添加终浓度20g/L葡萄糖作为唯一碳源，24h后不
断流加霉变葡萄浓缩物作为碳源直至发酵结束，除前期24h发酵使用葡萄糖为唯一碳源外，
其余时间均采用霉变葡萄浓缩物作为唯一碳源；(2)对照组，起始添加60g/L葡萄糖作为唯
一碳源，后期不断流加预灭菌葡萄糖直至发酵结束，全过程只有葡萄糖一种碳源。最终，实
验组发酵ε‑聚赖氨酸最终产量为37.75g/L，菌体干重为33.28g/L；对照组发酵ε‑聚赖氨酸
最终产量为 22.14g/L，菌体干重为22.78g/L；可知，相比对照组，实验组ε‑聚赖氨酸产量为
对照的1.70 倍，这说明染霉水果能够“变废为宝”，作为有效碳源在ε‑聚赖氨酸补料分批发
酵中促进产物的合成。