同时检测HIV-1、HBV、HCV、CMV的特异性引物和试剂盒

摘要

本发明涉及一种生物分子的检测领域，具体涉及同时检测HIV‑1、HBV、HCV、CMV的特异性引物和试剂盒。本发明提供了一种快速、简便的使用荧光定量PCR技术一次性检测HIV‑1病毒及其它三种常见并发感染病毒的病毒载量检测试剂盒，检测结果特异性好，灵敏度高，病毒载量检测结果准确。

权利要求

1.一种HIV‑1、HBV、HCV、CMV的多重荧光定量PCR病毒载量检测试剂盒，其特征在于，所书述试剂盒包括同时检测HIV‑1、HBV、HCV、CMV的特异性引物和探针，其中，检测HIV的特异性引物和探针为：

引物HIVF：5′‑AGTGGGGGGACAYCARGCAGC ‑3′和引物 HIVR：5′‑TACTAGTAGTTCCTGCTATRTCACTTCC ‑3′，探针 HIVP：5′‑FAM‑AAGCTGCAGAATGGGATA ‑BHQ1‑3′；

检测HBV的特异性引物和探针为：

引物HBVF：5′‑GATGTGTCTGCGGCGTTTTA ‑3′和引物HBVR：5′‑GCAACATACCTTGATAGTCCAGAAGAA ‑3′，探针HBVP：5′‑TET‑CTTCCTCTTCATCCTGC ‑BHQ1‑3′；

检测HCV的特异性引物和探针为：

引物 HCVF：5′‑AGCGTCTAGCCATGGCGTT ‑3′和引物 HCVR：5′‑GCAAGCACCCTATCAGGCAGT ‑3′，探针HCVP：5′‑JOE‑TCCTTTCTTGGATAAACC ‑BHQ1‑3′；

检测CMV的特异性引物和探针为：

引物CMVF：5′‑TCAATCATGCGTTTGAAGAGGTA ‑3′和引物CMVR：5′‑ACCACCGCACTGAGGAATGTCAG ‑3′探针 CMVP：5′‑NED‑TCCACGTACTCGTAGGC ‑BHQ1‑3′。

说明书

同时检测HIV‑1、HBV、HCV、CMV的特异性引物和试剂盒

技术领域

[0001] 本发明涉及一种生物分子的检测领域，具体涉及同时检测HIV‑1、HBV、HCV、CMV的特异性引物和试剂盒。

背景技术

[0002] 人类免疫缺陷病毒Ⅰ型(Human Immunodeficiency Virus，HIV)是诱发人获得性免疫缺陷综合征(Acquired Immunodeficiency Syndrome，AIDS)的主要病原体，在分类学上
属于逆转录病毒科(Retroviridae)，慢病毒属(Lentivirus)

[0003] 乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)是引起乙型肝炎(简称乙肝)的病原体，属嗜肝DNA病毒科。乙肝病毒携带者中，50％～75％的人有活动性病毒复制的慢性乙肝，估
计5年中从慢性乙肝进展为肝硬化的发生率为2％‑20％；从代偿性肝硬化到肝脏失代偿为
20％‑23％；从代偿肝硬化到肝癌为6％‑15％。慢性乙肝是进展为肝硬化、肝衰竭和肝细胞
癌的首要危险因素。HBV的传染性很强，接种0.00004mL含病毒血液足以使人发生感染。而乙
肝病毒又常常产生突变，这给乙肝的确诊和治疗带来极大的麻烦，所以迫切需要一种既准
确又快速的实验室检验方法来检测乙肝病毒。

[0004] 丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus,HCV)感染后一般到抗体转阳有一个较长的窗口期，平均为70天，有的患者窗口期可延长至6‑9个月或更长，约1‑3％的患者抗‑HCV可持续
阴性，而基因组的复制出现得很早，感染后数天即出现病毒血症。

[0005] 巨细胞病毒(Cytomegalovirus,CMV)是一种疱疹病毒组DNA病毒，亦称细胞包涵体病毒，在人群中感染非常广泛，中国成人感染率达95％以上。巨细胞病毒感染正常人群后通
常呈潜伏状态,当机体处于免疫功能受损或受抑制状态时,潜伏的CMV可能被激活。

[0006] 对于HIV感染者，HBV、HCV、CMV常作为HIV的并发感染病毒出现在患者外周血中。并且已有的临床病例跟踪调查表明，由于HBV、HCV在感染途径上与HIV的感染途径相近，HIV感
染者相较于普通人更易感染并发病毒；另外，同时携带并发感染病毒的HIV感染者免疫能力
下降更加严重，更易进展为艾滋病患者。健康人血浆中并不含CMV，由于艾滋病重症患者免
疫功能严重受损，在艾滋病发病后期，患者血浆中常常含有高载量的CMV。

发明内容

[0007] 本申请的目的是提供能够同时鉴定HIV‑1、HBV、HCV、CMV的特异性引物。

[0008] 本申请的再一目的是提高一种HIV‑1、HBV、HCV、CMV的多重荧光定量PCR病毒载量检测试剂盒。

[0009] 根据本申请的提供能够同时鉴定HIV‑1、HBV、HCV、CMV的特异性引物，其中，HIV特异性引物为：

[0010] 引物1HIVF：5′‑AGTGGGGGGACAYCARGCAGC‑3′，和

[0011] 引物2HIVR：5′‑TACTAGTAGTTCCTGCTATRTCACTTCC‑3′；

[0012] HBV特异性引物为：

[0013] 引物3HBVF：5′‑GATGTGTCTGCGGCGTTTTA‑3′，和

[0014] 引物4HBVR：5′‑GCAACATACCTTGATAGTCCAGAAGAA‑3′；

[0015] HCV特异性引物为：

[0016] 引物5HCVF：5′‑AGCGTCTAGCCATGGCGTT‑3′，和

[0017] 引物6HCVR：5′‑GCAAGCACCCTATCAGGCAGT‑3′；

[0018] CMV特异性引物为：

[0019] 引物7CMVF：5′‑TCAATCATGCGTTTGAAGAGGTA‑3′，和

[0020] 引物8CMVR：5′‑ACCACCGCACTGAGGAATGTCAG‑3′。

[0021] 根据本申请的HIV‑1、HBV、HCV、CMV的多重荧光定量PCR病毒载量检测试剂盒，包括HIV‑1、HBV、HCV、CMV特异性引物和探针，其中，

[0022] HIV的特异性引物和探针为：

[0023] 引物1HIVF：5′‑AGTGGGGGGACAYCARGCAGC‑3′和

[0024] 引物2HIVR：5′‑TACTAGTAGTTCCTGCTATRTCACTTCC‑3′，

[0025] 探针1HIVP：5′‑FAM‑AAGCTGCAGAATGGGATA‑BHQ1‑3′；

[0026] HBV的特异性引物和探针为：

[0027] 引物3HBVF：5′‑GATGTGTCTGCGGCGTTTTA‑3′和

[0028] 引物4HBVR：5′‑GCAACATACCTTGATAGTCCAGAAGAA‑3′，

[0029] 探针2HBVP：5′‑TET‑CTTCCTCTTCATCCTGC‑BHQ1‑3′；

[0030] HCV的特异性引物和探针为：

[0031] 引物5HCVF：5′‑AGCGTCTAGCCATGGCGTT‑3′和

[0032] 引物6HCVR：5′‑GCAAGCACCCTATCAGGCAGT‑3′，

[0033] 探针3HCVP：5′‑JOE‑TCCTTTCTTGGATAAACC‑BHQ1‑3′；

[0034] CMV的特异性引物和探针为：

[0035] 引物7CMVF：5′‑TCAATCATGCGTTTGAAGAGGTA‑3′和

[0036] 引物8CMVR：5′‑ACCACCGCACTGAGGAATGTCAG‑3′

[0037] 探针4CMVP：5′‑NED‑TCCACGTACTCGTAGGC‑BHQ1‑3′。

[0038] 根据本申请的HIV‑1、HBV、HCV、CMV的多重荧光定量PCR病毒载量检测试剂盒，所述试剂盒包括：RT‑PCR反应缓冲液、引物探针、混合酶、校准品号、阳性对照品和阴性对照品。

[0039] 本申请实施例采用的上述至少一个技术方案能够达到以下有益效果：

[0040] 本发明提供了一种快速、简便的使用荧光定量PCR技术一次性检测HIV‑1病毒及其它三种常见并发感染病毒的病毒载量检测试剂盒，检测结果特异性好，灵敏度高，病毒载量
检测结果准确。本发明的另一个优点是只需要患者抽取一次血液，就能同时进行4种血浆病
毒的检测，减轻了患者的痛苦，避免了多次检测的繁琐步骤，缩短了检测时间，节约了开支。

附图说明

[0041] 此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：

[0042] 图1为HIV阳性样本扩增曲线；

[0043] 图2为HBV阳性样本扩增曲线；

[0044] 图3为HCV阳性样本扩增曲线；

[0045] 图4为CMV阳性样本扩增曲线；

[0046] 图5为标准品扩增曲线，其中，ΔRn代表荧光增量，亦即扩增产物增量，Ct值表示循环数；

[0047] 图6为引物浓度优选结果，其中，ΔRn代表荧光增量，亦即扩增产物增量，Ct值表示循环数；

[0048] 图7显示探针浓度优选结果；

[0049] 图8为对比实施例1中采用本申请的引物的近似引物检测HIV阳性样本的扩增曲线；

[0050] 图9为对比实施例1中采用本申请的引物的近似引物检测HBV阳性样本的扩增曲线；

[0051] 图10为对比实施例1中采用本申请的引物的近似引物检测HCV阳性样本的扩增曲线；

[0052] 图11为对比实施例1中采用本申请的引物的近似引物检测CMV阳性样本的扩增曲线。

具体实施方式

[0053] 为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本申请具体实施例及相应的附图对本申请技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅是本申请一
部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做
出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

[0054] 以下结合附图，详细说明本申请各实施例提供的技术方案。

[0055] 本发明通过考察人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus,HIV)Ⅰ型、乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)、丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus,HCV)、巨细
胞病毒(Cytomegal virus，CMV)基因组序列，筛选优化，设计出4对特异性引物。最优的引物
和探针如下：

[0056] 引物1HIVF：5′‑AGTGGGGGGACAYCARGCAGC‑3′

[0057] 引物2HIVR：5′‑TACTAGTAGTTCCTGCTATRTCACTTCC‑3′

[0058] 探针1HIVP：5′‑FAM‑AAGCTGCAGAATGGGATA‑BHQ1‑3′

[0059] 引物3HBVF：5′‑GATGTGTCTGCGGCGTTTTA‑3′

[0060] 引物4HBVR：5′‑GCAACATACCTTGATAGTCCAGAAGAA‑3′

[0061] 探针2HBVP：5′‑TET‑CTTCCTCTTCATCCTGC‑BHQ1‑3′

[0062] 引物5HCVF：5′‑AGCGTCTAGCCATGGCGTT‑3′

[0063] 引物6HCVR：5′‑GCAAGCACCCTATCAGGCAGT‑3′

[0064] 探针3HCVP：5′‑JOE‑TCCTTTCTTGGATAAACC‑BHQ1‑3′

[0065] 引物7CMVF：5′‑TCAATCATGCGTTTGAAGAGGTA‑3′

[0066] 引物8CMVR：5′‑ACCACCGCACTGAGGAATGTCAG‑3′

[0067] 探针4CMVP：5′‑NED‑TCCACGTACTCGTAGGC‑BHQ1‑3′。

[0068] 其中，引物1、引物2和探针1用于检测HIV‑1，引物3、引物4和探针2用于检测HBV，引物5、引物6和探针3用于检测HCV，引物7、引物8和探针4用于检测CMV。

[0069] 根据本申请的HIV‑1、HBV、HCV、CMV的多重荧光定量PCR病毒载量检测试剂盒，包括上述特异性引物和荧光探针，采用该试剂盒，实时荧光定量RT‑PCR方法分别扩增目的基因。

[0070] 可使用传统的酚‑氯仿提取方法或购买商业化的核酸提取试剂盒提取待检测样品的核酸。

[0071] 根据本发明的具体实施方式，所述试剂盒成分的具体成分为：

[0072] RT‑PCR反应液为30mM Tris‑HCl(pH＝8.3)、100mM KCl、1.5mM dNTPs、4mM MgCl2的混合液；所述的酶混合物为逆转录酶(3U/μL)、TaqDNA聚合酶(2U/μL)的混合物；所提供的
引物和探针为：

[0073] 引物各1.5μM；

[0074] 其中，引物1、引物2和探针1用于检测HIV‑1，引物3、引物4和探针2用于检测HBV，引物5、引物6和探针3用于检测HCV，引物7、引物8和探针4用于检测CMV。

[0075] 所提供的阴性对照品为纯净水；所提供的阳性对照品为适当浓度的HIV‑1、HBV、HCV、CMV扩增目的片段人工合成质粒；所提供的的4种校准品为已知浓度的分别含有四种病
毒基因片段的质粒稀释液。

[0076] 在反应体系中其他组分相同的情况下，将引物浓度分别从0.05μM到2.0μM作倍比连续稀释，结果见图6。通过实验结果的分析比较，确定最优引物浓度为0.5μM。

[0077] 在反应体系中其他组分相同的情况下，将探针浓度分别从0.01μM到1.0μM作倍比连续稀释，实验结果见图7。通过实验结果的分析比较，最优探针浓度为0.05μM。

[0078] 利用上述引物和探针进行反应体系的建立，最后确定，荧光定量RT‑PCR的最优体系为20μL。

[0079] RT‑PCR反应条件优化为：48℃30min；95℃10min；95℃15s，60℃30s，40cycles。于“60℃30s”阶段分别收集荧光。

[0080] 实施例1

[0081] 1.样本模板的制备：

[0082] 采用磁珠法提取血浆中的病毒核酸，将核酸提取物置于‑80℃贮藏备用。

[0083] 2.配制反应液：

[0084] 按如下配方配制One step RT‑PCR反应缓冲液(终浓度)：

[0085] 30mM Tris‑HCl(pH＝8.3)、100mM KCl、1.5mM dNTPs、4mM MgCl2；

[0086] 按如下配方配制混合酶(终浓度)：

[0087] 逆转录酶(3U/μL)、TaqDNA聚合酶(2U/μL)；

[0088] 按如下配方配制引物探针混合液(终浓度)：

[0089] 引物(0.5μM)、探针(0.05μM)；

[0090] 按如下配方配制校准品：

[0091] 使用前将该人工合成的四种病毒的质粒用超纯水分别溶解并稀释成107copies/6 5 4 3
mL、10copies/mL、10copies/mL、10copies/mL、10copies/mL，依次作为标准品1‑5号。

[0092] 试剂盒组成为如表1所示：

[0093] 表1

[0094] 组成成分(100人份/盒) 体积One step RT‑PCR反应缓冲液 1000μL(2×)
引物1+引物2+探针1 250μL(4×)
引物3+引物4+探针2 250μL(4×)
引物5+引物6+探针3 250μL(4×)
引物7+引物8+探针4 250μL(4×)
混合酶 250μL(4×)
HIV‑1校准品 干粉
HBV校准品 干粉
HCV校准品 干粉
CMV校准品 干粉

[0095] 按每人份One step RT‑PCR反应缓冲液10μL、混合酶2.5μL、引物探针2.5μL的配方配制PCR反应液，并按15μL/管分装到0.2mL PCR管中，然后加入5μL待检的核酸提取物作为
模板，使反应总体积为20μL。

[0096] 3.PCR程序：

[0097] 按如下程序进行一步法RT‑PCR检测：反应管先在48℃反应30分钟，然后95℃保温10分钟，再按95℃15秒→60℃30秒循环40次(60℃退火条件下采集相应探针标记通道的荧
光)。

[0098] 4.实验结果：

[0099] 如图5所示：标准品1‑5的Ct值均<35，且线性相关系数R2>0.99。

[0100] 1)如图1所示，检测HIV的荧光定量PCR结果显示，样本Ct值为32，阴性对照无扩增。

[0101] 2)如图2所示，检测HBV的荧光定量PCR结果显示，样本Ct值为19，阴性对照无扩增。

[0102] 3)如图3所示，检测HCV的荧光定量PCR结果显示，样本Ct值为32，阴性对照无扩增。

[0103] 4)如图4所示，检测CMV的荧光定量PCR结果显示，样本Ct值为33，阴性对照无扩增。

[0104] 直接读取仪器分析的对应种类病毒的定量结果，显示本发明提供的引物和探针的检测灵敏度达到200copies/mL，显示了其将具有很好的检出率。

[0105] 本发明提供的引物和探针检测阴性样品没有信号，显示了其很好的特异性。

[0106] 对比实施例1

[0107] 对实施例1中得到的核酸提取物，其它量保持不变，采用下列引物进行实时荧光定量PCR扩增检测：

[0108] 1.HIV‑F AGTGGGGGGACAYCARGCAGC

[0109] 2.HIV‑R TACTAGTAGTTCCTGCTATRTCACTTCC

[0110] 3.HBV‑F TTCCGGAAACTACTGTTGTTAGAC

[0111] 4.HBV‑R ATTGAGATTCCCGAGATTGAGA

[0112] 5.HCV‑F CTGTCTTCACGCAGAAAGCG

[0113] 6.HCV‑R CACTCGCAAGCACCCTATCA

[0114] 7.CMV‑F GCGGTGGTTGCCCAACAGGA

[0115] 8.CMV‑R ACGACCCGTGGTCATCTTTA

[0116] 扩增结果见图8～图11，实验组的Ct值均大于35或者在35附近。对比实施例1的扩增结果表明，与申请引物对相比，利用近似引物对扩增结果不具有良好的灵敏度，本发明申
请引物对优于近似引物对。