一种免疫囊泡美登素偶联物及其制备方法与应用转让专利
申请号 : CN202110561582.0
文献号 : CN113244175B
文献日 : 2022-11-04
发明人 : 孙欢利 , 张翼帆 , 袁琴 , 钟志远
申请人 : 苏州大学
摘要 :
本发明公开了一种免疫囊泡美登素偶联物及其制备方法与应用，由两亲性聚合物、美登素、抗体制备；具体的，将官能团化两亲性嵌段聚合物与两亲性嵌段聚合物组装、自发交联的同时通过巯基‑硫硫交换反应偶联美登素，然后与单抗反应，制备免疫囊泡美登素偶联物。美登素具有广谱的抗肿瘤活性，适用于实体瘤和恶性血液肿瘤，然而由于其毒性极强，治疗窗口较窄，无法单独使用，本发明技术方案的出现为强效药DM1的使用提供了可能性。实验结果发现，本发明免疫囊泡美登素偶联物在高剂量下，小鼠可较好耐受，全部存活，有效扩大了毒性分子DM1的治疗窗口。
权利要求 :
1.一种免疫囊泡美登素偶联物在制备抗恶性血液肿瘤药物中的应用，其特征在于，由两亲性聚合物、美登素、抗体制备；所述两亲性聚合物为PEG‑P(TMC‑DTC)；所述抗体为达雷木单抗，所述抗体通过二苯并环辛炔官能化得到，其结构为:所述两亲性聚合物中，PEG链段的分子量为3000～8000 Da；疏水链段分子量为PEG分子量的2.0～6.0倍；PDTC的分子量为疏水链段总分子量的10%～30%；所述美登素通过双硫键偶联在囊泡的疏水膜层；以美登素、两亲性嵌段聚合物、官能团化两亲性嵌段聚合物、单抗为原料，通过溶剂置换法及后修饰单抗制备免疫囊泡美登素偶联物。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述恶性血液肿瘤为多发性骨髓瘤或者急性淋系白血病。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，将官能团化两亲性嵌段聚合物与两亲性嵌段聚合物自发交联同时通过巯基‑硫硫交换反应偶联美登素，然后与单抗反应，制备免疫囊泡美登素偶联物。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述官能团化两亲性嵌段聚合物中的官能团为N3‑。
说明书 :
一种免疫囊泡美登素偶联物及其制备方法与应用
技术领域
[0001] 本发明属于聚合物纳米药物技术领域，具体涉及一种单抗导向的可逆交联聚合物囊泡美登素偶联物及其制备方法与在肿瘤靶向治疗中的应用。
背景技术
[0002] 美登素（DM1）是一种植物来源的大环内酯结构的疏水药物，主要通过作用于微管蛋白，阻止其在细胞有丝分裂中的形成，从而阻滞细胞周期，诱导产生细胞凋亡。美登素因其在临床前实验中出色的抗肿瘤效果而被广泛研究，但在早期临床实验中，美登素表现出较强的胃肠毒性和神经毒性，治疗窗口较小，无法单独使用。由于其强毒性，近年来美登素被广泛研究用于抗体药物偶联物（ADC）的毒素弹头，目前有一款Ado‑transtuzumab emtansine（Kadcyla®）获得FDA批准，且有多款处于不同阶段的临床实验中。ADC 虽然可以改善DM1的循环时间，降低其系统毒性，依然面临着药物含量低、抗体用量大、使用成本高等问题。此外，除了ADC以外，DM1靶向递送的研究非常有限，这主要归因于其强毒性，需要纳米载体具备稳定包裹及肿瘤特异性的药物递送性能。因此，如何实现DM1的高效稳定装载及肿瘤特异性的靶向递送，同时提高药物负载量降低治疗成本，至关重要。
发明内容
[0003] 本发明的目的是公开免疫囊泡美登素偶联物及其制备方法与应用，具体为一种单抗导向的可逆交联聚合物囊泡美登素偶联物及其制备方法和应用。
[0004] 为达到上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
[0005] 一种免疫囊泡美登素偶联物，由美登素、两亲性嵌段聚合物、官能团化两亲性嵌段聚合物、单抗制备；所述两亲性嵌段聚合物为PEG‑P(TMC‑DTC) 、PEG‑P(LA‑DTC)或者PEG‑P(CL‑DTC)。
[0006] 本发明的两亲性嵌段聚合物为现有聚合物，比如两亲性嵌段聚合物PEG‑P(TMC‑DTC)具有如下化学结构式：
[0007]
[0008] 两亲性嵌段聚合物表示为PEG‑P(TMC‑DTC)，与结构式单元对应；所述两亲性嵌段聚合物中，PEG的分子量为3000～8000 Da；P(TMC‑DTC)的分子量为PEG分子量的2.0～6.0倍；PDTC的分子量为P(TMC‑DTC)分子量的10%～30%。
[0009] 本发明中，所述单抗为靶向CD38的单抗，如达雷木单抗（Dar）、艾沙妥昔单抗（Isa）或其它靶向CD38的单抗。
[0010] 上述免疫囊泡美登素偶联物的制备方法为，以美登素、两亲性嵌段聚合物、官能团化两亲性嵌段聚合物、单抗为原料，通过溶剂置换法制备免疫囊泡美登素偶联物。优选的，将官能团化两亲性嵌段聚合物与两亲性嵌段聚合物共组装、交联，同时通过巯基‑硫硫交换反应偶联美登素（DM1），然后与单抗反应，制备免疫囊泡美登素偶联物。
[0011] 本发明公开了上述免疫囊泡美登素偶联物在制备纳米药物中的应用；纳米药物为抗肿瘤药物。所述肿瘤优选为恶性血液肿瘤，具体为多发性骨髓瘤、急性淋系白血病或者急性髓系白血病。
[0012] 本发明的免疫囊泡美登素（DM1）偶联物，由两亲性嵌段聚合物组装并交联得到，其具有对称膜结构，外壳为聚乙二醇（PEG），膜层为可逆交联的疏水聚碳酸酯，疏水连段上的双硫戊环可以与DM1的巯基发生巯基‑硫硫交换反应，从而实现DM1的高效稳定装载。
[0013] 本发明采用两亲性嵌段聚合物先与官能团化两亲性嵌段聚合物作为原料制备聚合物囊泡美登素偶联物，然后再连接单抗，得到免疫囊泡美登素偶联物。官能团来自PEG引发剂，得到的聚合物PEG端带有可反应性官能团，比如叠氮（N3）或N‑羟基琥珀酰亚胺（NHS），官能团化两亲性嵌段聚合物可以为N3‑PEG‑P(TMC‑DTC)、NHS‑PEG‑P(TMC‑DTC)。
[0014] 本发明的免疫囊泡美登素偶联物的制备方法可以如下：
[0015] （1）在PEG‑P(TMC‑DTC)的PEG端引入N3或者NHS等官能团，得到官能化PEG‑P(TMC‑DTC)；
[0016] （2）以美登素（DM1）、PEG‑P(TMC‑DTC)和官能化PEG‑P(TMC‑DTC)为原料，通过溶剂置换法制备表面含有可反应性官能团的、偶联DM1的、可逆交联、可降解聚合物囊泡，进而与单抗反应制备免疫囊泡美登素偶联物。
[0017] 本发明公开了上述免疫囊泡美登素偶联物的制备方法中：将PEG‑P(TMC‑DTC)的DMF溶液和官能化PEG‑P(TMC‑DTC)如N3‑PEG‑P(TMC‑DTC)的DMF溶液混合均匀后，注入含有DM1的PB溶液中，均匀分散后透析即可得到表面含有N3的可逆交联聚合物囊泡DM1偶联物。通过二苯并环辛炔修饰的单抗，如达雷木单抗（Dar）、艾沙妥昔单抗（Isa）或其它靶向CD38的单抗与叠氮官能化的DM1囊泡（N3‑Ps‑DM1）发生张力触动的点击化学反应，可在温和条件下制备得到单抗导向的免疫囊泡DM1偶联物（Ab‑Ps‑DM1）。采用同样的方法，通过单抗与NHS官能化的聚合物囊泡DM1偶联物发生酰胺化反应也可简单制备得到Ab‑Ps‑DM1。
[0018] 本发明通过化学键合（双硫键），在双硫交联的疏水囊泡膜中偶联毒性小分子DM1，可避免在输送过程中泄漏而造成的损失和毒副作用，并在体内还原剂谷胱甘肽（GSH）的作用下，双硫键迅速断裂释放DM1，有效杀伤肿瘤细胞。
[0019] 本发明中的聚合物囊泡为还原敏感可逆交联、细胞内可解交联且生物可降解的聚合物囊泡；所述聚合物为PEG‑P(TMC‑DTC)，其中疏水嵌段的TMC与DTC呈无规排列。囊泡膜为可逆交联的生物可降解且相容性好的PTMC，侧链的双硫戊烷结构类似人体天然的抗氧化剂硫辛酸，可自发形成还原敏感的可逆交联，不但可保证药物在血液中的稳定长循环，还可实现细胞内快速解交联，快速释放药物到靶细胞内。
[0020] 与现有技术相比，本发明具有如下优点：
[0021] 1. 本发明设计了新的单抗导向的聚合物囊泡美登素偶联物用于强毒性小分子药物DM1的高效稳定装载及肿瘤靶向递送，解决了DM1本身毒性大，无法使用的难题；囊泡膜为可逆交联的生物可降解且生物相容性好的PTMC，侧链的双硫戊烷可提供还原敏感的可逆交联，不但可保证药物在血液中的长循环，还可在细胞内快速解交联，释放药物到靶细胞内；外壳为PEG同时具有单抗分子，可特异性结合癌细胞；囊泡的小尺寸以及肿瘤特异性靶向使得囊泡可特异性输送DM1至肿瘤细胞内。
[0022] 2. 本发明公开的免疫囊泡美登素偶联物在体内外具有显著的抗肿瘤效果，聚合物生物相容性好，可通过还原敏感的双硫键偶联强毒性DM1，具有高效稳定的包载效果。
[0023] 3. 本发明的免疫囊泡美登素偶联物规避了现有以DM1为毒素弹头的抗体药物偶联物药物负载量低、抗体用量大，生产成本高及药物可能泄漏等缺陷。
[0024] 4. 本发明的免疫囊泡美登素偶联物有机结合了双硫交联聚合物囊泡和抗体药物偶联物的优点，有望用于高效及特异性靶向递送DM1至肿瘤细胞，实现强效的肿瘤抑制。
附图说明
[0025] 图1A为游离DM1、N3‑Ps‑DM1 及其在10 mM DTT 处理12 h 后的HPLC 图；1B为实施例二例中Dar与Dar‑DBCO的MALDI‑TOF‑MS图。
[0026] 图2为实施例三中不同单抗密度的Dar‑Ps‑Cy5在697和MV4‑11细胞中的内吞情况。
[0027] 图3为实施例三中不同单抗密度的Dar‑Ps‑Cy5在LP‑1细胞中的内吞情况。
[0028] 图4为实施例四中不同单抗密度的Dar‑Ps‑DM1、Ps‑DM1和游离DM1在697、LP‑1、MV4‑11和L929细胞中的毒性。
[0029] 图5为实施例四中不同单抗密度的空囊泡Dar‑Ps、Ps和Dar在LP‑1细胞中的毒性。
[0030] 图6为实施例五中Dar‑Ps‑DM1和游离DM1单剂量处理的昆明鼠的体重变化和生存曲线图。
[0031] 图7为实施例五中Dar‑Ps‑DM1和游离DM1单剂量处理的昆明鼠的血常规测试图。
[0032] 图8为实施例七中Dar‑Ps‑DM1和Ps‑DM1在原位LP‑1‑Luc多发性骨髓瘤模型中的生物分布图。
[0033] 图9为实施例八中原位697急性淋系白血病小鼠移植模型的构建和治疗工作流程图以及Dar‑Ps‑DM1对其的治疗效果图。
[0034] 图10为实施例九中Dar‑Ps‑DM1对原位LP‑1‑Luc多发性骨髓瘤模型的治疗流程和治疗效果图。
[0035] 图11为实施例九中原位LP‑1‑Luc多发性骨髓瘤模型经不同治疗后的Luc信号变化、生存期和体重变化图。
[0036] 图12为实施例九中原位LP‑1‑Luc多发性骨髓瘤模型经不同治疗后的BJP和IgG水平图。
[0037] 图13为实施例九中原位LP‑1‑Luc多发性骨髓瘤模型经不同治疗后的腿骨（股骨和胫骨）切片图。
[0038] 图14为实施例九中原位LP‑1‑Luc多发性骨髓瘤模型经不同治疗后的腿骨TRAP染色图。
具体实施方式
[0039] 本发明免疫囊泡DM1偶联物，由两亲性嵌段聚合物/官能化两亲性嵌段聚合物自组装、自交联的同时通过巯基硫硫交换反应偶联DM1，并后修饰单抗得到；所述嵌段聚合物的分子链包括依次连接的亲水链段及疏水链段；所述亲水链段为聚乙二醇（PEG），分子量为3000‑8000 Da；所述疏水链段为聚碳酸酯链段，分子量为亲水链段分子量的2.1‑5.7倍。
[0040] 聚乙二醇‑b‑聚（三亚甲基碳酸酯‑co‑二硫戊环三亚甲基碳酸酯）（PEG‑P(TMC‑DTC)，Mn = 5.0‑(15.1‑2.0) kg/mol，Mw/Mn = 1.1）和叠氮官能化的聚合物N3‑PEG‑P(TMC‑DTC)（Mn = 7.9‑(15.1‑2.0) kg/mol，Mw/Mn = 1.1）为现有产品，根据申请人已经公开的专利或者文献可常规获取。达雷木单抗（Dar，21.7 mg/mL，分子量：148 kDa，上海赛迈生物科技有限公司），NHS‑OEG4‑DBCO（97%，BroadPharm），美登素（DM1，99.4%，苏州博瑞生物医药有限公司），3‑（4,5‑二甲基噻唑‑2）‑2,5‑二苯基四氮唑溴盐（MTT，北京索莱宝科技有限公司），4,6‑二脒基‑2‑苯基吲哚（DAPI，碧云天），二硫苏糖醇（DTT，99%，Merck），CCK‑8 试剂盒（苏州福麦斯生物科技有限公司），免疫球蛋白G 试剂盒（IgG，上海广锐生物有限公司），本周蛋白BJP 试剂盒（Bence‑Jones 蛋白，上海广锐生物有限公司），不同截留分子量（MWCO）的超滤管（Millipore），透析袋（MWCO：3.5 kDa，西安优博生物科技有限公司）购买后直接使用。N,N‑二甲基甲酰胺（DMF）、无水乙醇、乙腈（ACN）等试剂均从国药集团化学试剂有限公司购买并直接使用。
[0041] 聚合物囊泡的粒径及粒径分布采用英国马尔文公司的633 nm He‑Ne 背散射激光光源的Zeta‑sizer Nano‑ZS 动态光散射仪（DLS，Malvern 公司）测定。紫外光谱由HITACHIUH5300 双光束紫外可见分光光度计（UV‑vis）测定。细胞毒性通过酶标仪（ThermoMultiskan FC）测定570 nm 和450 nm 波长下的吸光值分析得到。聚合物囊泡在细胞中的内吞及细胞内定位采用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM，Leica，TCS SP5）和流式细胞仪（BD FACS Calibur）测定。大分子质谱采用芥子酸（SA）基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI‑TOF‑MS，Bruker）测定。小鼠活体成像采用近红外成像系统（Caliper IVIS LuminaII，Ex 643 nm，Em 668 nm）采集图像并采用Living image 软件分析。H&E 通过倒置显微镜（Eclipse Ci‑L，Nikon）拍摄并采用ImageJ 软件分析。DM1 的浓度通过HPLC（Waters 1525）测定，检测波长为252 nm，流动相为乙腈和水的混合溶液（v/v =60/40），流速为1.0 mL/min，温度为30 ºC。单抗的浓度及接枝率由HPLC（SEC 柱）测定，波长为214 nm，流动相为乙腈和磷酸缓冲溶液（PB，150 mM）的混合液（v/v =10/90）。
[0042] 本发明涉及的原料为现有市售原料，具体的制备方法以及测试方法为本领域常规技术；下面结合实施例和附图对本发明作进一步描述。
[0043] 实施例一 可逆交联且生物可降解的囊泡美登素偶联物（N3‑Ps‑DM1）的制备[0044] N3‑Ps‑DM1通过溶剂置换法制备，其中疏水链段部分的二硫戊环与DM1通过巯基‑硫硫交换作用进行化学键合，将药物偶联在囊泡的疏水膜中。N3‑Ps‑DM1由N3‑PEG‑P(TMC‑DTC)和PEG‑P(TMC‑DTC)共组装的同时偶联DM1而得到，其中N3‑PEG‑P(TMC‑DTC)的含量为1~10 wt.%。具体地，以含有2 wt.% N3‑PEG‑P(TMC‑DTC)的N3‑Ps‑DM1的制备为例，称取0.72 mg N3‑PEG‑P(TMC‑DTC)和35.28 mg PEG‑P(TMC‑DTC)溶解于DMF中（聚合物总浓度为40 mg/mL）；将0.4 mL DM1的DMF溶液（10 mg/mL）加入到7.7 mL PB（pH 7.4，10 mM）中混合均匀，在搅拌下向其中注入0.9 mL聚合物溶液，常规搅拌3分钟后，置于37 ºC静置12小时。用PB（pH
7.4，10 mM）透析（MWCO = 3.5 kDa）6小时除去有机溶剂后，采用纳滤系统除去游离的DM1即得到N3官能团修饰的Ps‑DM1，后续称为Ps‑DM1。其中DM1的理论载药量设定为10 wt.%，研究发现所得N3‑Ps‑DM1的粒径为47 nm，粒径分布~0.13（表1）。通过高效液相色谱法测定其在
252 nm波长下的吸光值计算得到DM1的包封率为63.5%，载药量是6.6 wt.%。
7.4，10 mM）透析（MWCO = 3.5 kDa）6小时除去有机溶剂后，采用纳滤系统除去游离的DM1即得到N3官能团修饰的Ps‑DM1，后续称为Ps‑DM1。其中DM1的理论载药量设定为10 wt.%，研究发现所得N3‑Ps‑DM1的粒径为47 nm，粒径分布~0.13（表1）。通过高效液相色谱法测定其在
252 nm波长下的吸光值计算得到DM1的包封率为63.5%，载药量是6.6 wt.%。
[0045] N3‑Ps由N3‑PEG‑P(TMC‑DTC)和PEG‑P(TMC‑DTC)根据上述方法共组装得到。
[0046] 实施例二 单抗导向的免疫囊泡美登素偶联物（Ab‑Ps‑DM1）的制备
[0047] Ab‑Ps‑DM1通过在叠氮官能化的聚合物囊泡DM1纳米药物（N3‑Ps‑DM1）表面后修饰二苯并环辛炔官能化的单抗（Ab‑DBCO）得到。首先，为了高效地键合单抗，采用切向流装置将N3‑Ps‑DM1由4 mg/mL浓缩到19.8 mg/mL。浓缩后N3‑Ps‑DM1的粒径为48 nm，PDI为0.16。N3‑Ps‑DM1 的长期储存稳定性通过监测其在4 ºC 放置180天期间的粒径、粒径分布及药物泄漏量进行表征，浓缩后N3‑Ps‑DM1在4 ºC 储存180 天期间，N3‑Ps‑DM1的粒径和粒径分布变化不大（3 nm以内），且没有DM1泄漏，表明其具有最佳的长期储存稳定性。在加入10 mM DTT 处理后，DM1以游离的形式快速释放出来（图1A）。另外研究了N3‑Ps‑DM1在37 ºC，含
0.3% 吐温80的PBS中的释放情况，2天后没有检测到游离的DM1，具有优异的稳定性。现有技术公开了FA‑PLA‑TPGS载美登素纳米粒子FA‑DM1‑NPs，无论线性还是星形，都具有大于120 nm的粒径，且5天内DM1释放达到40%。与通常需要多步制备的聚合物前药纳米体系相比，本发明N3‑Ps‑DM1制备简单，在囊泡形成过程中，一步法稳定键合DM1，尤其是得到的载药囊泡具有优异的稳定性，为靶向配体后修饰和DM1的特异性靶向递送提供了一个简单稳定的纳米平台。
0.3% 吐温80的PBS中的释放情况，2天后没有检测到游离的DM1，具有优异的稳定性。现有技术公开了FA‑PLA‑TPGS载美登素纳米粒子FA‑DM1‑NPs，无论线性还是星形，都具有大于120 nm的粒径，且5天内DM1释放达到40%。与通常需要多步制备的聚合物前药纳米体系相比，本发明N3‑Ps‑DM1制备简单，在囊泡形成过程中，一步法稳定键合DM1，尤其是得到的载药囊泡具有优异的稳定性，为靶向配体后修饰和DM1的特异性靶向递送提供了一个简单稳定的纳米平台。
[0048] Ab‑DBCO通过小分子NHS‑OEG4‑DBCO与单抗上的氨基发生酰胺化反应制备得到，其中DBCO的官能化度可通过改变Ab与NHS‑OEG4‑DBCO的摩尔比进行调节。以DBCO官能化Dar单抗（Dar‑DBCO）的制备为例，取4 mg Dar（21.7 mg/mL），用pH 8.5的缓冲液将其稀释至10 mg/mL，在振荡下向其中加入3倍摩尔当量的NHS‑OEG4‑DBCO的DMSO溶液（5 mg/mL），氮气下，置于25 ºC，100 rpm摇床中反应过夜。随后用超滤管离心（MWCO = 10 kDa，3000 rpm）除去未反应的NHS‑OEG4‑DBCO，并用PBS（pH 7.4，10 mM）洗涤超滤两次，得到Dar‑DBCO，以上反应示意如下：
[0049]
[0050] 飞行时间质谱（MALDI‑TOF‑MS）测得此投料摩尔比下每个Dar上修饰了1.4个DBCO（附图1B），表示为Dar‑DBCO1.4。后续均采用Dar‑DBCO1.4及修饰有1.5‑2个DBCO的其它单抗进行实验。
[0051] 通过N3‑Ps‑DM1表面的N3与Dar‑DBCO之间发生张力触动的点击化学反应可简单制备得到Dar‑Ps‑DM1，Dar的表面密度可通过改变投料比进行调节。设定Dar‑DBCO与N3的摩尔比分别为0.5∶1，1∶1和2∶1，即在50.5 μL N3‑Ps‑DM1（19.8 mg/mL）中分别加入9.2、18.4和36.8 μL的Dar‑DBCO溶液（6.84 mg/mL），然后在25 ºC、100 rpm摇床中反应过夜。采用超滤管离心（MWCO = 300 kDa，3000 rpm）除去未键合的Dar‑DBCO，并用PBS（pH 7.4，1×）洗涤两次，同时收集Dar‑Ps‑DM1和下清以测定Dar的键合量。下清中未键合的Dar‑DBCO通过HPLC测定，从而计算出每毫克聚合物囊泡表面Dar的含量分别为27.3、64.1和108.0 μg，根据多角
7
度激光光散射测得的聚合物囊泡的绝对重均分子量（1.54×10 g/mol）和聚集数（635个）计算可知每个Dar‑Ps‑DM1表面分别键合有2.6、6.2和10.5个Dar（表1）。随着Dar密度的增加，Dar‑Ps‑DM1的粒径略有增加（53‑56 nm），粒径分布较窄（PDI：0.21‑0.25）。
7
度激光光散射测得的聚合物囊泡的绝对重均分子量（1.54×10 g/mol）和聚集数（635个）计算可知每个Dar‑Ps‑DM1表面分别键合有2.6、6.2和10.5个Dar（表1）。随着Dar密度的增加，Dar‑Ps‑DM1的粒径略有增加（53‑56 nm），粒径分布较窄（PDI：0.21‑0.25）。
[0052]
[0053] a由HPLC测得；b由DLS测得。
[0054] 其它单抗导向的聚合物囊泡DM1偶联物，如Isa‑Ps‑DM1、Anti‑BCMA‑Ps‑DM1的制备方法均与Dar‑Ps‑DM1类似。其粒径在40‑60 nm之间，粒径分布较窄（PDI：0.10‑0.30），每个囊泡表面单抗的个数为1‑12个。
[0055] Dar‑IPs的制备方法与Dar‑IPs‑DM1 类似，通过Dar‑DBCO与叠氮官能化的空囊泡（N3‑Ps）反应得到，最终分散于超纯水中。Dar‑IPs表面Dar的二级结构通过圆二色谱（CD）测定，以同浓度的游离Dar作为对照。
[0056] 实施例三 Dar‑Ps‑DM1的细胞内吞行为
[0057] 由于DM1本身无荧光，采用Cy5标记聚合物囊泡（Dar‑Ps‑Cy5）并通过流式细胞仪和激光共聚焦显微镜（CLSM）研究不同Dar密度的Dar‑Ps‑Cy5在697急性淋系白血病细胞、LP‑1多发性骨髓瘤细胞及MV4‑11白血病细胞中的摄取情况。Ps‑Cy5通过2 wt.% N3‑PEG‑P(TMC‑DTC)、20 wt.% PEG‑P(TMC‑DTC)‑Cy5和78 wt.% PEG‑P(TMC‑DTC)的聚合物共组装制备得到。具体如下：称取0.32 mg N3‑PEG‑P(TMC‑DTC)、3.2 mg PEG‑P(TMC‑DTC)‑Cy5、12.48 mg PEG‑P(TMC‑DTC)溶解于DMF中（40 mg/mL），将三种聚合物混合均匀后，在搅拌下注入至3.6 mL PB（pH 7.4，10 mM）中。搅拌3分钟后，用PB（pH 7.4，10 mM）透析（MWCO = 1 kDa）除去有机溶剂，并浓缩至聚合物浓度为17 mg/mL。Dar‑Ps‑Cy5的制备方法如同Dar‑Ps‑DM1类似，设定Dar‑DBCO与N3的摩尔比分别为0.5：1，1：1和2：1，以1:1为例，即在100 μL Ps‑Cy5（17 mg/mL）中加入36.9 μL的Dar‑DBCO溶液（5.5 mg/mL），然后在25 ºC、100 rpm摇床中反应过夜。采用超滤管离心（MWCO = 300 kDa，3000 rpm）除去未键合的Dar‑DBCO，并用PBS（pH 7.4，1×）洗涤两次。
[0058] 流式实验中，首先将697细胞（5×105个/孔）、LP‑1细胞（2×105个/孔）或MV4‑11细5
胞悬液（5×10 个/孔）铺在6孔板中，置于培养箱孵育12小时后，每孔加入200 μL Dar‑Ps‑Cy5和Ps‑Cy5（Cy5孔内浓度为2.0 μg/mL），用PBS组作为对照。继续孵育4小时后，离心（800 rpm，5分钟）收集细胞，并用PBS清洗两次，最后用500 μL PBS分散并置于流式管中进行测定。测试结果显示，Dar‑Ps‑Cy5在697和LP‑1细胞中的内吞量明显高于Ps‑Cy5，其中与Dar6.2‑Ps‑Cy5孵育的细胞具有最高的荧光强度，其在697和LP‑1细胞中的荧光强度分别是Ps‑Cy5对照组的5.7倍（附图2A）和3.1倍（附图3A）。然而，在MV4‑11细胞中，Dar‑Ps‑Cy5的摄取量与Ps‑Cy5相比无明显区别（附图2B）。
胞悬液（5×10 个/孔）铺在6孔板中，置于培养箱孵育12小时后，每孔加入200 μL Dar‑Ps‑Cy5和Ps‑Cy5（Cy5孔内浓度为2.0 μg/mL），用PBS组作为对照。继续孵育4小时后，离心（800 rpm，5分钟）收集细胞，并用PBS清洗两次，最后用500 μL PBS分散并置于流式管中进行测定。测试结果显示，Dar‑Ps‑Cy5在697和LP‑1细胞中的内吞量明显高于Ps‑Cy5，其中与Dar6.2‑Ps‑Cy5孵育的细胞具有最高的荧光强度，其在697和LP‑1细胞中的荧光强度分别是Ps‑Cy5对照组的5.7倍（附图2A）和3.1倍（附图3A）。然而，在MV4‑11细胞中，Dar‑Ps‑Cy5的摄取量与Ps‑Cy5相比无明显区别（附图2B）。
[0059] 随后采用CLSM进一步研究了Dar6.2‑Ps‑Cy5和Ps‑Cy5在LP‑1细胞中的内吞行为。具体实验步骤如下，将多聚赖氨酸（300 μL，0.1 mg/mL）预处理的小圆片置于24孔板中，并加5
入LP‑1细胞悬液（3×10 个/孔），于培养箱中培养24小时后，分别加入100 μL Dar6.2‑Ps‑Cy5和Ps‑Cy5（Cy5孔内浓度为40 μg/mL）。继续孵育4小时后小心移去培养基，用PBS洗3次，接着用4%多聚甲醛溶液固定15分钟，用PBS洗3次，再用DAPI染细胞核3分钟，用PBS清洗3次，最后采用甘油封片并用CLSM（Leica，TCS SP5）进行观察和拍摄。附图3B表明，当LP‑1细胞与Dar6.2‑Ps‑Cy5孵育4小时后，细胞核周围呈现明显的Cy5荧光信号，而与Ps‑Cy5孵育的细胞中荧光较为微弱，表明Dar的引入可以显著提高细胞对囊泡的内吞，增加囊泡在细胞内的富集。
入LP‑1细胞悬液（3×10 个/孔），于培养箱中培养24小时后，分别加入100 μL Dar6.2‑Ps‑Cy5和Ps‑Cy5（Cy5孔内浓度为40 μg/mL）。继续孵育4小时后小心移去培养基，用PBS洗3次，接着用4%多聚甲醛溶液固定15分钟，用PBS洗3次，再用DAPI染细胞核3分钟，用PBS清洗3次，最后采用甘油封片并用CLSM（Leica，TCS SP5）进行观察和拍摄。附图3B表明，当LP‑1细胞与Dar6.2‑Ps‑Cy5孵育4小时后，细胞核周围呈现明显的Cy5荧光信号，而与Ps‑Cy5孵育的细胞中荧光较为微弱，表明Dar的引入可以显著提高细胞对囊泡的内吞，增加囊泡在细胞内的富集。
[0060] 实施例四 Dar‑Ps‑DM1的细胞毒性实验
[0061] Dar‑Ps‑DM1在697和LP‑1细胞中的采用CCK‑8试剂盒进行测定，其中以MV4‑11细胞作为对照。将697细胞（18000个/孔）、LP‑1细胞（12000个/孔）和MV4‑11细胞（15000个/孔）铺于96孔板中，置于37 ºC、含5% CO2的培养箱中培养12小时后，向每孔加入20 μL含有不同Dar表面密度的Dar‑Ps‑DM1、Ps‑DM1和游离DM1。对于697细胞而言，孔内DM1的最终浓度分别为0.01、0.1、0.5、1、5和10 ng/mL；对于LP‑1和MV4‑11细胞，孔内DM1的最终浓度分别为0.1、0.5、1、2、5、10、50和100 ng/mL。在37 ºC孵育48小时后，每孔加入10 μL CCK‑8溶液继续孵育4小时，最后用酶标仪测试其在450 nm处的吸光度值。细胞存活率通过实验组吸光度值与加入PBS培养的细胞的吸光度值的比值计算得到，实验平行进行四组（mean ± SD，n = 4）。
附图4为不同靶向密度的Dar‑Ps‑DM1囊泡纳米药物的细胞毒性结果图。结果表明，在697细胞中当每个囊泡表面键合6.2个Dar时（Dar6.2‑Ps‑DM1）细胞毒性最强，其半致死浓度（IC50）低至0.31 ng/mL，相比游离DM1（IC50：2.3 ng/mL）和非靶向对照组Ps‑DM1（IC50：0.62 ng/mL）分别降低了7.4和2倍（附图4A）。附图4B表明，在LP‑1细胞中，当每个囊泡表面键合6.2个Dar时（Dar6.2‑Ps‑DM1），其细胞毒性最强，IC50为3 ng/mL，相比于非靶向对照组降低了4倍左右。然而在MV4‑11细胞中，Dar‑Ps‑DM1与Ps‑DM1的毒性相当，IC50为12 ng/mL（附图4C）。此外，即使在DM1浓度高达1 μg/mL时，对于正常的L929细胞没有明显的杀伤效果（附图4D）。这综合说明Dar的引入有效增加了DM1的靶向细胞内递送和快速释放，进而增强了其体外抗肿瘤活性。
附图4为不同靶向密度的Dar‑Ps‑DM1囊泡纳米药物的细胞毒性结果图。结果表明，在697细胞中当每个囊泡表面键合6.2个Dar时（Dar6.2‑Ps‑DM1）细胞毒性最强，其半致死浓度（IC50）低至0.31 ng/mL，相比游离DM1（IC50：2.3 ng/mL）和非靶向对照组Ps‑DM1（IC50：0.62 ng/mL）分别降低了7.4和2倍（附图4A）。附图4B表明，在LP‑1细胞中，当每个囊泡表面键合6.2个Dar时（Dar6.2‑Ps‑DM1），其细胞毒性最强，IC50为3 ng/mL，相比于非靶向对照组降低了4倍左右。然而在MV4‑11细胞中，Dar‑Ps‑DM1与Ps‑DM1的毒性相当，IC50为12 ng/mL（附图4C）。此外，即使在DM1浓度高达1 μg/mL时，对于正常的L929细胞没有明显的杀伤效果（附图4D）。这综合说明Dar的引入有效增加了DM1的靶向细胞内递送和快速释放，进而增强了其体外抗肿瘤活性。
[0062] 此外，采用同样的方法测试不同靶向密度的Dar‑Ps和Ps空囊泡以及游离Dar对LP‑1细胞的毒性，结果表明即使当Ps和Dar浓度为10 μg/mL时，其均远远高于相对应的载药囊泡和单抗在IC50值附近的浓度时，细胞存活率均接近100%，没有明显的细胞毒性（附图5）。
[0063] 以下实施例中Dar‑Ps‑DM1均是指Dar6.2‑Ps‑DM1囊泡纳米药物，Dar‑Ps‑Cy5均为Dar6.2‑Ps‑Cy5。
[0064] 实施例五 Dar‑Ps‑DM1的体内最大耐受剂量（MTD）实验
[0065] MTD实验是指单剂量下，七天之内不引起小鼠体重下降至原来的85%的一个最大给药剂量，实验选取雌雄相同数量的KM鼠（20‑22 g，7周龄），并根据平均体重随机分组。通过尾静脉单剂量注射Dar‑Ps‑DM1或游离DM1，其中Dar‑Ps‑DM1制剂的DM1剂量梯度分别为0.8、1.2、1.4和1.6 mg/kg，游离DM1剂量设置为0.4和0.6 mg/kg。在给药后一周内观察小鼠的体重和健康状态（活动状况、瞳孔大小、角膜状态），并在实验结束后，随机从游离DM1组（0.4 mg DM1 equiv./kg）和Dar‑Ps‑DM1组（0.8 mg DM1 equiv./kg、1.2 mg DM1 equiv./kg）中分别取三只小鼠做血常规测试。结果发现，Dar‑Ps‑DM1在1.2 mg DM1 equiv./kg剂量下，小鼠可较好耐受，全部存活，且血常规各项指标与健康小鼠无显著差异（附图6 & 7），而在DM1剂量达到1.4 mg/kg及以上时，小鼠出现体重减轻、活动减少、瞳孔缩小、角膜混浊甚至死亡。然而，对于游离DM1而言，其在给药剂量为0.6 mg/kg时，小鼠在短时间内快速死亡，可耐受剂量为0.4 mg/kg。上述结果证明Dar‑Ps‑DM1有效扩大了毒性分子DM1的治疗窗口；但是同样的载体对VCR药物的耐受剂量没有明显改善。美登素具有广谱的抗肿瘤活性，适用于实体瘤和恶性血液肿瘤，然而由于其毒性极强，治疗窗口较窄，无法单独使用，本发明技术方案的出现为强效药DM1的使用提供了可能性。
[0066] 实施例六 荷原位血液肿瘤小鼠模型的构建
[0067] 所有动物实验及操作均获得苏州大学实验动物中心和苏州大学动物护理和使用委员会的批准。原位B‑ALL肿瘤模型的建立：采用6‑8周龄、平均体重约为20 g的NOD/SCID雌性小鼠，在第0天采用150 cGy的剂量辐照并通过腹腔注射0.2 mg（1 mg/mL）的anti‑CD1225
抗体对小鼠进行清髓，随后将697细胞（1×10个/只）通过尾静脉注射到小鼠体内。第6天将小鼠随机分组进行治疗，并持续监测小鼠体重、体态变化及生存期。
抗体对小鼠进行清髓，随后将697细胞（1×10个/只）通过尾静脉注射到小鼠体内。第6天将小鼠随机分组进行治疗，并持续监测小鼠体重、体态变化及生存期。
[0068] 原位MM肿瘤模型的建立：采用6周龄的NOD/SCID雌性小鼠，首先连续两天通过腹腔注射10 mg/mL的环磷酰胺溶液对小鼠进行清髓，每只小鼠每次注射2 mg，第三天将LP‑1‑6
Luc细胞（8×10个/只）通过尾静脉注射到小鼠体内，接种后第10天开始活体成像和治疗，同时对小鼠进行称重。
Luc细胞（8×10个/只）通过尾静脉注射到小鼠体内，接种后第10天开始活体成像和治疗，同时对小鼠进行称重。
[0069] 实施例七 Dar‑Ps‑Cy5在荷原位LP‑1‑Luc多发性骨髓瘤小鼠中的活体成像实验[0070] Dar‑Ps‑Cy5在原位LP‑1‑Luc多发性骨髓瘤小鼠体内的分布情况通过小鼠活体成像分析得到。在小鼠即将发病时，将200 μL Dar‑Ps‑Cy5和Ps‑Cy5溶液（250 µg Cy5 equiv./kg）通过尾静脉分别注射到小鼠体内，注射后分别在1、2、4、6、8、10、12、24小时采用异氟烷麻醉小鼠进行活体荧光成像，采用Lumia II软件分析。结果显示，Dar‑Ps‑Cy5能够高效靶向富集到肿瘤部位，其在小鼠腿部及头颅的荧光信号显著高于非靶向的Ps‑Cy5组（附图8）。
[0071] 实施例八 Dar‑Ps‑DM1在荷原位697急性淋系白血病小鼠中的抗肿瘤效果[0072] 为了研究Dar‑Ps‑DM1对荷原位697急性淋系白血病小鼠的抗肿瘤效果，在接种后第6天根据平均体重随机分组，开展治疗实验。给药方案为每组0.2 mg DM1 equiv./kg，4天给一针，共4针，表示为Dar‑Ps‑DM1（0.2 mg DM1 equiv./kg，Q4d），并采用同等DM1剂量的Ps‑DM1和游离DM1，以及PBS作为对照，每个组别均有6只荷瘤小鼠。研究发现PBS组和游离DM1治疗组小鼠的697细胞持续快速增长，在接种后21‑23天时发病，表现为双腿瘫痪、体重下降并发生死亡。附图9A可以看出，在给药治疗期间（6‑18天），Dar‑Ps‑DM1组、Ps‑DM1及游离DM1组小鼠的体重无明显变化，表明它们可有效抑制小鼠体内697细胞的扩散和增殖，且无明显毒副作用。给药结束后，非靶向Ps‑DM1和游离DM1组小鼠体重出现下降，并迅速发病死亡，中位生存期分别为24天和23.5天。然而尾静脉注射Dar‑Ps‑DM1组小鼠仍表现出稳定增长的体重和健康的体态，中位生存期为31天，与非靶向Ps‑DM1组（**p<0.01）及PBS组（***p<0.001）均有显著性差异（附图9B）。这些结果综合表明Dar‑Ps‑DM1可以高效抑制原位急性淋系白血病的病程发展，延长小鼠的无进展生存期。
[0073] 实施例九 Dar‑Ps‑DM1在荷原位LP‑1‑Luc多发性骨髓瘤小鼠中的抗肿瘤效果[0074] 为了研究Dar‑Ps‑DM1和Ps‑DM1对原位多发性骨髓瘤小鼠的抗肿瘤效果，在接种后6 2
第10天生物发光强度达到1.2×10 p/sec/cm/sr时，将小鼠随机分为4组，每组10只(其中4只用于生物发光成像，6只用于监测体重及观察生存期)，治疗组别分别为PBS、游离DM1(0.2 mg DM1 equiv./kg，Q4d)、Ps‑DM1 (0.2 mg DM1 equiv./kg，Q4d)、Dar‑Ps‑DM1 (0.2 mg DM1 equiv./kg，Q4d)，尾静脉给药，每4天给一针，共5针。在治疗期间（10‑34天），每7天进行一次活体成像监测肿瘤增殖情况，每2天监测一次体重，并通过荧光值、体重和小鼠生存期共同评估治疗情况。在治疗结束后，各组随机解剖四只小鼠，取主要脏器及后腿骨，用4%多聚甲醛固定，采用H&E及TRAP染色进行组织学分析。
第10天生物发光强度达到1.2×10 p/sec/cm/sr时，将小鼠随机分为4组，每组10只(其中4只用于生物发光成像，6只用于监测体重及观察生存期)，治疗组别分别为PBS、游离DM1(0.2 mg DM1 equiv./kg，Q4d)、Ps‑DM1 (0.2 mg DM1 equiv./kg，Q4d)、Dar‑Ps‑DM1 (0.2 mg DM1 equiv./kg，Q4d)，尾静脉给药，每4天给一针，共5针。在治疗期间（10‑34天），每7天进行一次活体成像监测肿瘤增殖情况，每2天监测一次体重，并通过荧光值、体重和小鼠生存期共同评估治疗情况。在治疗结束后，各组随机解剖四只小鼠，取主要脏器及后腿骨，用4%多聚甲醛固定，采用H&E及TRAP染色进行组织学分析。
[0075] 研究发现PBS组小鼠的LP‑1‑Luc细胞持续快速增长，在第28‑34天当生物发光强度9 2
达到1.0×10 p/sec/cm/sr时开始发病，表现为双腿瘫痪、体重下降并发生死亡。在10‑31天成像观察期间，Dar‑Ps‑DM1组的Luc信号明显下降，降低至健康小鼠的背景信号值，表明小鼠体内的LP‑1‑Luc细胞得到了有效清除（附图10，附图11A）。然而，Ps‑DM1及游离DM1组小鼠的Luc信号仍成指数倍数增，在第31天时，两组小鼠的Luc信号强度相比开始治疗时分别增加了347和2535倍（附图11A）。值得注意的是，所有治疗组小鼠在给药期间体重无明显变化，表明它们的毒副作用较低（附图11C）。此外，Dar‑Ps‑DM1治疗组小鼠的生存期得到了显著延长（附图11B），中位生存期为124天，相比于PBS组（35天）、Ps‑DM1（45天）和游离DM1组（43天）有显著性差异（****，p<0.0001）。现有Anti‑CD38‑NPs‑BTZ的中位生存期为28天；现有双硫交联聚合物胶束CFZ 纳米药物（A6‑PMs‑CFZ）在荷皮下LP‑1 MM 小鼠中有效抑制了肿瘤的生长，小鼠的中位生存期由PBS、CFZ‑CD 和PMs‑CFZ 的26、29 和35 天延长至44 天。
达到1.0×10 p/sec/cm/sr时开始发病，表现为双腿瘫痪、体重下降并发生死亡。在10‑31天成像观察期间，Dar‑Ps‑DM1组的Luc信号明显下降，降低至健康小鼠的背景信号值，表明小鼠体内的LP‑1‑Luc细胞得到了有效清除（附图10，附图11A）。然而，Ps‑DM1及游离DM1组小鼠的Luc信号仍成指数倍数增，在第31天时，两组小鼠的Luc信号强度相比开始治疗时分别增加了347和2535倍（附图11A）。值得注意的是，所有治疗组小鼠在给药期间体重无明显变化，表明它们的毒副作用较低（附图11C）。此外，Dar‑Ps‑DM1治疗组小鼠的生存期得到了显著延长（附图11B），中位生存期为124天，相比于PBS组（35天）、Ps‑DM1（45天）和游离DM1组（43天）有显著性差异（****，p<0.0001）。现有Anti‑CD38‑NPs‑BTZ的中位生存期为28天；现有双硫交联聚合物胶束CFZ 纳米药物（A6‑PMs‑CFZ）在荷皮下LP‑1 MM 小鼠中有效抑制了肿瘤的生长，小鼠的中位生存期由PBS、CFZ‑CD 和PMs‑CFZ 的26、29 和35 天延长至44 天。
[0076] M蛋白，如单克隆免疫球蛋白（IgG）和本周蛋白（BJP）的过度生成是多发性骨髓瘤病人的诊断标准之一，附图12为ELISA试剂盒测得的小鼠IgG和BJP的变化趋势图。结果发现PBS组小鼠的IgG和BJP水平随着MM的进展（10‑30天）不断升高，而Dar‑Ps‑DM1治疗组的小鼠蛋白水平则维持不变甚至稍有下降。附图13为各治疗组小鼠后腿骨的HE染色图，从图中可以看出PBS和DM1治疗组的小鼠后腿骨中有明显可见的肿瘤浸润，且骨髓腔内的造血细胞大量消失。Ps‑DM1组也存在着大量的造血细胞消失，然而，Dar‑Ps‑DM1组的骨组织形态和造血细胞均与健康小鼠类似，未见明显异常，说明Dar‑Ps‑DM1有效地抑制了MM的进展。溶骨性病变是MM患者常见的临床表现之一，其中主要是由于破骨细胞与成骨细胞之间的平衡遭到破坏。通过TRAP染色分析发现Dar‑Ps‑DM1组小鼠腿骨中的破骨细胞含量较少，明显低于PBS、DM1和Ps‑DM1治疗组小鼠（附图14）。
[0077] 多发性骨髓瘤（MM）是由骨髓（BM）中恶性浆细胞异常增殖而引起的恶性血液肿瘤，复发率高，对于复发的MM 患者，可用的有效治疗方案有限，存活率较低。因此，迫切需要开发新的治疗方案，改善新发及复发难治MM患者的预后，实现深度缓解。本发明实施例结果综合表明Dar的引入显著增加了Ps‑DM1的选择性靶向，从而高效清除了LP‑1‑Luc多发性骨髓瘤细胞，大幅延长了小鼠的生存期。另外，Dar‑Ps‑DM1可以高效抑制原位急性淋系白血病的病程发展，延长小鼠的无进展生存期。