肝脏毒性的预防和干预药物

摘要

本发明公开了肝脏毒性的预防和干预药物。具体地，黄毒素B或黄药子提取物引发的肝脏毒性的预防和干预的药物为伊曲康唑、N‑乙酰半胱氨酸、N‑乙酰赖氨酸中的任一种。本发明拓展了伊曲康唑、N‑乙酰半胱氨酸、N‑乙酰赖氨酸治疗由黄毒素B或黄药子提取物引发的肝脏毒性的用途，为开发治疗黄药子肝毒性药物提供了试验依据。

权利要求

1.一种以伊曲康唑为有效组分制备的用于预防和干预由黄独素B或黄药子提取物引发的肝脏毒性的药物。

2.根据权利要求1所述的药物，其特征在于，所述黄药子提取物成分中含有黄独素B。

3.伊曲康唑在制备由黄独素B或黄药子提取物引发的肝脏毒性预防和干预药物中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述黄药子提取物成分中含有黄独素B。

说明书

肝脏毒性的预防和干预药物

技术领域

[0001] 本发明属于生物医药技术领域，涉及肝脏毒性的治疗药物，具体涉及由黄毒素B或黄药子提取物引发的肝脏毒性的预防和干预的药物。

背景技术

[0002] 黄药子为薯蓣科薯蓣属多年生草本植物黄独块茎，又名黄独、黄药根、黄药、黄药脂、山慈姑、金线吊虾蟆、铁秤砣等。主产于湖南、湖北、江苏等地，山东、河南、安徽、浙江、福建等地亦有种植。黄药子性凉、味苦，具有凉血、降火、清瘿、解毒的功效，其药理作用及临床应用古书早有记载，药用价值较高且应用广泛。现代临床多将黄药子用于甲状腺肿、吐血衄血、食道癌、胃癌、淋巴结核、乳腺肿瘤等疾病的治疗，但发现黄药子具有肝毒性，其毒性严重制约了临床作用的发挥。

[0003] 黄药子中含有茋类、黄酮类、甾体、二萜内酯类以及其他等多种化合物，但是目前针对黄药子中具体某一种化学成分的药理作用及其相关机制的研究尚集中在少数化合物中，如山药皂苷元、黄独素等，其余化合物的药理作用及其机制还有待进一步探究(朱大成等,江西中医药大学学报,2020,32(02),117‑121)。现代研究表明，二萜内酯类化合物是黄药子的主要有效及毒性成分，已发现的二萜内酯类成分主要有黄独素A‑M、8‑表黄独素乙酸酯(EEA)等，其中以黄独素B和8‑表黄毒素乙酸酯为主(李俊等,中华中医药学刊,2020,38(12),100‑103)。以黄独素B为代表的二萜内酯类成分，既是黄药子的活性成分，又是其毒性成分(李军等,中国老年学杂志,2019,39(15),3846‑3848)。

[0004] 关于黄药子肝毒性的毒理学研究，主要从代谢激活、氧化应激、线粒体损伤和细胞凋亡等方面探讨黄药子的肝毒性机制。基于L‑02细胞进行6种黄毒素(Diosbulbins)平行的体外毒性筛选，得出包括黄毒素B在内的多种黄毒素是黄药子肝脏毒性的物质基础(苏钰文等,2012年中国药学大会暨第十二届中国药师周论文集)。梁玉琼等的研究得出，黄药子总皂苷(TSRD)连续给药对小鼠肝脏具有一定的毒性，其机制可能与氧化应激损伤，诱导肝组织Nrf2及CYP2E1表达有关(中华中医药学刊,2020年10期)。

[0005] 随着近年来关于黄药子毒性成分和毒理学机制的研究不断深入，对黄药子肝毒理机制的认识也变得更加客观和清晰。但是，黄药子及其提取物引发肝脏毒性的预防和干预机制仍需要进一步探究。

发明内容

[0006] 本发明的目的在于提供由黄毒素B或黄药子提取物引发的肝脏毒性的预防和干预的药物。

[0007] 基于现有文献及其揭示的研发成果，以黄独素B为代表的二萜内酯类化合物是黄药子的主要有效及毒性成分，现有研究普遍认为包括黄独素B在内的多种组分是黄药子肝脏毒性的物质基础。本专利发明人团队通过敲除试验巧妙的得出黄药子肝毒性成分是黄毒素B，并且只(仅)是黄毒素B，敲除黄毒素B的黄药子提取物并不表现出明显的肝脏毒性，从而消除了本领域普通技术人员，包括本领域的研究人员对黄药子肝脏毒性物质基础的偏见或误解。具体参见专利申请CN202110579946.8。

[0008] 本发明在专利申请CN202110579946.8的基础上，进一步揭示由黄毒素B或黄药子提取物引发的肝脏毒性的预防和干预的药物。具体地，黄毒素B或黄药子提取物引发的肝脏毒性的预防和干预的药物为伊曲康唑、N‑乙酰半胱氨酸、N‑乙酰赖氨酸中的任一种。需要指出的是，本发明所述“预防和干预”与生物医药领域的“治疗”概念相同或等同，不会让本领域技术人员产生误解或引起歧义。

[0009] 本发明提供一种以伊曲康唑为有效组分制备的用于预防和干预由黄毒素B或黄药子提取物引发的肝脏毒性的药物。

[0010] 本发明提供一种以N‑乙酰半胱氨酸为有效组分制备的用于预防和干预由黄毒素B或黄药子提取物引发的肝脏毒性的药物。

[0011] 本发明提供一种以N‑乙酰赖氨酸为有效组分制备的用于预防和干预由黄毒素B或黄药子提取物引发的肝脏毒性的药物。

[0012] 本发明所述黄毒素B从黄药子，或黄药子提取物中分离得到，或者从其他可能的途径获得。本发明对此不作特别的限定。

[0013] 本发明所述黄药子提取物的组分中含有黄毒素B。至于所述黄药子提取物的制备方法，本发明对此不作特别的限定。本发明实施例给出的药子提取物的制备方法仅用于示例性的说明。

[0014] 本领域普通技术人员，包括本领域的研究人员，制备本发明含所述伊曲康唑、N‑乙酰半胱氨酸、N‑乙酰赖氨酸的药物，除含有有效组分外外，还包括医药领域可接受的辅料、载体或助剂。对此，本发明不做进一步的详实阐述。基于本发明的技术启示，本发明含所述伊曲康唑、N‑乙酰半胱氨酸、N‑乙酰赖氨酸的药物，并不排除含有其他的药物成分，所述药物成分存在或不存在和干预由黄毒素B或黄药子提取物引发的肝脏毒性的用途。

[0015] 与现有技术相比，本发明所述肝脏毒性的预防和干预药物的有益效果或优点：本发明的主要贡献在于明确了黄毒素B或黄药子提取物引发的肝脏毒性的预防和干预的药物为伊曲康唑、N‑乙酰半胱氨酸、N‑乙酰赖氨酸中的任一种。本发明通过对照试验验证了伊曲康唑、N‑乙酰半胱氨酸、N‑乙酰赖氨酸在预防和干预由黄毒素B或黄药子提取物引发的肝脏毒性的用途，拓展了伊曲康唑、N‑乙酰半胱氨酸、N‑乙酰赖氨酸的新用途。另外，本发明为黄药子肝毒性治疗药物的研制提供了实验依据，为开发治疗黄药子肝毒性药物开辟了途径。

附图说明

[0016] 图1是DSB和DBL对小鼠血清ALT和AST活性的影响。图1中(A)是灌胃小鼠DSB后12、24、36、48、60、72和96h血清ALT活性的时程变化；图1中(B)是灌胃小鼠DBL后12、24、36、48、
60、72和96h血清ALT活性的时程变化；图1中(C)是灌胃小鼠DSB后12、24、36、48、60、72和96h血清AST活性的时程变化；图1中(D)是灌胃小鼠DBL后12、24、36、48、60、72和96h血清AST活性的时程变化。

[0017] 图2是DSB与ITC/NAC/NAL的混合溶液对小鼠血清ALT和AST活性的影响。图2中(A)是灌胃小鼠DSB与ITC混合物后12、24、36、48、60、72和96h血清ALT活性的时程变化；图2中(B)是灌胃小鼠DSB和NAC混合物后12、24、36、48、60、72和96h血清ALT活性的时程变化；图2中(C)是灌胃小鼠DSB和NAL混合物后12、24、36、48、60、72和96h血清ALT活性的时程变化；图2中(D)是灌胃小鼠DSB与ITC混合物后12、24、36、48、60、72和96h血清AST活性的时程变化；
图2中(E)是灌胃小鼠DSB和NAC混合物后12、24、36、48、60、72和96h血清AST活性的时程变化；图2中(F)是灌胃小鼠DSB和NAL混合物后12、24、36、48、60、72和96h血清AST活性的时程变化。

[0018] 图3是给予DSB 24h后灌胃小鼠ITC/NAC/NAL对小鼠血清ALT和AST活性的影响。图3中(A)是给予小鼠DSB 24h后灌胃ITC 36、48、60、72和96h后(以灌胃DSB为0h计)血清ALT活性的时程变化；图3中(B)是给予小鼠DSB 24h后灌胃NAC 36、48、60、72和96h后(以灌胃DSB为0h计)血清ALT活性的时程变化；图3中(C)是给予小鼠DSB 24h后灌胃NAL 36、48、60、72和96h后(以灌胃DSB为0h计)血清ALT活性的时程变化；图3中(D)是给予小鼠DSB 24h后灌胃ITC 36、48、60、72和96h后(以灌胃DSB为0h计)血清AST活性的时程变化；图3中(E)是给予小鼠DSB 24h后灌胃NAC 36、48、60、72和96h后(以灌胃DSB为0h计)血清AST活性的时程变化；
图3中(F)是给予小鼠DSB 24h后灌胃NAL 36、48、60、72和96h后(以灌胃DSB为0h计)血清AST活性的时程变化。

[0019] 图4是DBL与ITC/NAC/NAL的混合溶液对小鼠血清ALT和AST活性的影响。图4中(A)是灌胃小鼠DBL与ITC混合物后12、24、36、48、60、72和96h血清ALT活性的时程变化；图4中(B)是灌胃小鼠DBL和NAC混合物后12、24、36、48、60、72和96h血清ALT活性的时程变化；图4中(C)是灌胃小鼠DBL和NAL混合物后12、24、36、48、60、72和96h血清ALT活性的时程变化；图4中(D)是灌胃小鼠DBL与ITC混合物后12、24、36、48、60、72和96h血清AST活性的时程变化；
图4中(E)是灌胃小鼠DBL和NAC混合物后12、24、36、48、60、72和96h血清AST活性的时程变化；图4中(F)是灌胃小鼠DBL和NAL混合物后12、24、36、48、60、72和96h血清AST活性的时程变化。

[0020] 图5是给予DBL 24h后灌胃小鼠ITC/NAC/NAL对小鼠血清ALT和AST活性的影响。图5中(A)是给予小鼠DBL 24h后灌胃ITC 36、48、60、72和96h(以灌胃DBL为0h计)血清ALT活性的时程变化；图5中(B)是给予小鼠DBL 24h后灌胃NAC 36、48、60、72和96h(以灌胃DBL为0h计)血清ALT活性的时程变化；图5中(C)是给予小鼠DBL 24h后灌胃NAL 36、48、60、72和96h(以灌胃DBL为0h计)血清ALT活性的时程变化；图5中(D)是给予小鼠DBL 24h后灌胃ITC 36、48、60、72和96h(以灌胃DBL为0h计)血清AST活性的时程变化；图5中(E)是给予小鼠DBL24h后灌胃NAC 36、48、60、72和96h(以灌胃DBL为0h计)血清AST活性的时程变化；图5中(F)是给予小鼠DBL 24h后灌胃NAL 36、48、60、72和96h(以灌胃DBL为0h计)血清AST活性的时程变化。

具体实施方式

[0021] 下面，结合实施例对本发明的技术方案进行说明，但是，本发明并不限于下述的实施例。

[0022] 1、相关溶液的配制

[0023] 黄独素B(DSB)溶液：称取800mg DSB，加入40mL的CMC‑Na，超声使其充分混悬，4℃保存，备用。

[0024] 黄药子提取物(DBL)溶液：取黄药子干燥饮片5kg，加入50L蒸馏水浸泡2h后煎煮1h，过滤，滤渣加入50L蒸馏水煎煮1h，重复6次。合并滤液浓缩至200mL，加入乙醇(终醇浓度为85％)，静置过夜后抽滤并收集滤液，去除溶剂得干浸膏，经冷冻干燥机干燥后存于4℃冰箱，备用。实验时，将黄药子提取物浸膏使用CMC‑Na混悬，LC‑MS/MS测定其DSB含量，使DSB含量为150mg/kg。

[0025] 伊曲康唑(ITC)溶液：称取200mg ITC，加入20mL的CMC‑Na，超声使其充分混悬，4℃保存，备用。

[0026] N‑乙酰半胱氨酸(NAC)溶液：称取312mg NAC，加入20mL的CMC‑Na，超声使其充分混悬，4℃保存，备用。

[0027] N‑乙酰赖氨酸(NAL)溶液：称取362mg NAL，加入20mL的CMC‑Na，超声使其充分混悬，4℃保存，备用。

[0028] TRO19622溶液：称取4.8mg ITC，加入4mL的CMC‑Na，超声使其充分混悬，4℃保存，备用。

[0029] 2、实验动物处理

[0030] 2.1)DSB、DBL时间‑依赖实验

[0031] 雄性昆明小鼠(18‑22g)63只，随机分成3组，对照组7只，其余每组28只，一组灌胃CMC‑Na作为对照组，一组为DSB组，一组为DBL组，分别灌胃DSB、DBL(200mg/kg，混悬于CMC‑Na中)，于给药后12，24，36，48，60，72，96h取4只，乙醚麻醉，心脏取血，并取得肝脏，对照组在每个给药组取血时间点各取一只。血液静置2h后，8000g离心后，取上清，获得血清，放置在4℃冰箱中，备用。

[0032] 2.2)ITC、NAC、NAL预防DSB、DBL引起肝损伤实验

[0033] 雄性昆明小鼠(18‑22g)175只，随机分成7组：

[0034] (1)对照组；

[0035] (2)DSB和ITC同时给药组；

[0036] (3)DSB和NAC同时给药组；

[0037] (4)DSB和NAL同时给药组；

[0038] (5)DBL和ITC同时给药组；

[0039] (6)DBL和NAC同时给药组；

[0040] (7)DBL和NAL同时给药组。

[0041] 除对照组灌胃7只CMC‑Na外，其余每组28只。于给药后12，24，36，48，60，72，96h取4只，乙醚麻醉，心脏取血，并取得肝脏，对照组在每个给药组取血时间点各取一只。血液静置2h，8000g离心后，取上清，获得血清，放置在4℃冰箱中，备用。

[0042] 3)TRO19622预防DSB引起肝损伤实验

[0043] 雄性昆明小鼠(18‑22g)12只，随机分成3组，每组4只，一组灌胃CMC‑Na作为对照组；一组灌胃DSB(200mg/kg，混悬于CMC‑Na中)；另一组灌胃TRO19622，于给药4h后灌胃DSB(200mg/kg，混悬于CMC‑Na中)，于灌胃DSB 24h后，乙醚麻醉，心脏取血，并取得肝脏，对照组同时间取血。血液静置2h，8,000g离心后，取上清，获得血清，放置在4℃冰箱中，备用。

[0044] 4)ITC、NAC、NAL干预DSB、DBL引起肝损伤实验

[0045] 雄性昆明小鼠(18‑22g)125只，随机分成7组：

[0046] (1)对照组；

[0047] (2)预先给予DSB 24h后给予ITC组；

[0048] (3)预先给予DSB 24h后给予NAC组；

[0049] (4)预先给予DSB 24h后给予NAL组；

[0050] (5)预先给予DBL 24h后给予ITC组；

[0051] (6)预先给予DBL 24h后给予NAC组；

[0052] (7)预先给予DBL 24h后给予NAL组。

[0053] 除对照组灌胃5只CMC‑Na外，其余每组20只。分别先给予DSB、DBL 24h后给予ITC、NAC、NAL，于给予DSB、DBL后36，48，60，72，96h取4只，乙醚麻醉，心脏取血，并取得肝脏，对照组在每个给药组取血时间点各取一只。血液静置2h，8000g离心后，取上清，获得血清，放置在4℃冰箱中，备用。

[0054] 3、ALT、AST活性测定及结果

[0055] 小鼠心脏取血，用获得的血清测定血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)值。

[0056] 灌胃小鼠DSB后能够引起时间依赖性ALT、AST值升高(图1A、C)，给予DSB 24h后小鼠血清中ALT、AST值与未给药时出现显著差异，并在给药后36h时达到峰值，48h与空白组相比仍有显著差异，其后ALT、AST值逐渐下降。同样地，在给予DBL后引起了时间依赖性ALT、AST值升高(图1B、C)给药24h后ALT、AST值与未给药时出现显著差异，并在48h时ALT、AST值达到峰值，60h时与空白相比仍有显著差异，随后ALT、AST值逐渐下降。

[0057] ITC是细胞色素P4503A家族的强效抑制剂，ITC与DSB同时给药后，与单独给予DSB相比，所有时间点处ALT、AST值均降低，并且在36h处未见ALT、AST值的明显升高(图2A、D)。给予DSB24h后再灌胃ITC，显著降低了单独给予DSB 36h后出现的ALT、AST峰值，随后时间点ALT、AST值均降低(图3A、D)。ITC与DBL同时给药后，与单独给予DBL相比，相同时间处ALT、AST值显著降低(图4A、D)。与单独给予DBL 48h后出现的ALT、AST峰值相比，给予DBL 24h后再灌胃ITC后测得的ALT、AST显著降低(图5A、D)。

[0058] DSB经过P450酶代谢活化后形成的cis‑enedial可与亲核性的NAC、NAL结合，将NAC与DSB同时灌胃小鼠后，与单独灌胃DSB相比，相同时间点ALT、AST值显著降低(图2B、E)。同时给予小鼠NAL与DSB后也出现类似的现象(图2C、F)。给予DSB 24h后再灌胃NAC，与单独给予DSB后相比，36h时ALT、AST值显著降低(图3B、E)。

[0059] 同时给予小鼠NAC与DBL后，与单独给予DBL相比，相同时间点ALT、AST值显著降低(图4B、E)。同样地，在同时给予NAL与DBL后ALT、AST值显著降低(图4C、F)。给予DBL 24h后再灌胃NAC，与单独给予DBL后ALT、AST峰值相比显著降低(图5B、E)。灌胃小鼠DBL 24h后再灌胃NAL，ALT、AST值的变化情况与同时灌胃小鼠NAC和DBL类似(图5C、F)。

[0060] 如上所述，即可较好地实现本发明，上述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种改变和改进，均应落入本发明确定的保护范围内。