一种冻干血浆的制备方法

摘要

本发明公开了一种冻干血浆的制备方法。该方法不添加保护剂，冻干前不进行旋冻，凝血因子Ⅷ和血管性血友病因子(vWF)的回收率能达到70％以上，其余各血浆蛋白的回收率能达到80％以上，具有重要的应用价值。

权利要求

1.一种制备冻干血浆的方法，依次包括：将血浆置于冻干机中，液面高度不超过3.7cm，以1℃/min速率降温至‑45℃，维持18h～

20h后，进行第一次抽真空；

再按照如下升温步骤进行升温：在3h内升温至‑30℃并维持此温度12h～14h；

之后每4h升温5℃直至体系温度为‑15℃；

再在2h内升温至‑10℃并维持此温度16h～18h；

再在2h内升温至‑5℃并维持此温度16h～18h；

再在2h内升温至0℃并维持此温度4h～6h；

之后每2h升温10℃直至20℃；

再在30min内升温至25℃并同时进行第二次抽真空，保持3h，然后压瓶塞，维持原真空度密封。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述第一次抽真空步骤中，抽真空后的真空度为0.100mbar；

所述第二次抽真空步骤中，抽真空后的真空度为0.001mbar。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述升温步骤为：在3h内升温至‑30℃并维持此温度12h；

之后每4h升温5℃直至体系温度为‑15℃；

再在2h内升温至‑10℃并维持此温度16h；

再在2h内升温至‑5℃并维持此温度16h；

再在2h内升温至0℃并维持此温度4h；

之后每2h升温10℃直至20℃。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述升温步骤为：在3h内升温至‑30℃并维持此温度14h；

之后每4h升温5℃直至体系温度为‑15℃；

再在2h内升温至‑10℃并维持此温度18h；

再在2h内升温至‑5℃并维持此温度18h；

再在2h内升温至0℃并维持此温度6h；

之后每2h升温10℃直至20℃。

说明书

一种冻干血浆的制备方法

技术领域

[0001] 本发明属于血液制品领域，涉及一种冻干血浆的制备方法。

背景技术

[0002] 鉴于新鲜冰冻血浆在保存(‑20℃)和运输(冷链)方面存在的一系列问题，无法满足特殊环境及边远地区紧急救护的需要，冻干血浆成为创伤休克复苏救治中新鲜冰冻血浆的理想替代品。

[0003] 与新鲜冰冻血浆相比，冻干血浆的基本成分与其相同(包括白蛋白、免疫球蛋白、纤维蛋白原和大部分凝血因子)，虽然部分凝血因子的生物活性有所降低，但仍然具备维持患者体内胶体渗透压、增加循环血容量和补充血浆蛋白等主要功效。冻干血浆可以在10℃以下保存，25℃以下运输，不需要庞大的低温冷链设备。在使用前冻干血浆复溶迅速，而新鲜冰冻血浆至少需要30分钟的融化时间，这将极大提高救治效率。在无法获得融化血浆的情况下，可以用于重大事故或自然灾害的紧急救护中。

[0004] 现有技术的冻干血浆的制备方法一般需在冻干前进行低温旋冻，从而使冻干总时长缩短，进而达到保证较低水分含量及较高血浆蛋白活性的目的。然而，在冻干前进行旋冻一是增加操作难度，二是可能会产生外来病原体污染。此外，为尽量提高血浆蛋白活性，现有技术通常会在血浆中添加保护剂，而加入保护剂可能会在大剂量使用冻干血浆时引发不良反应。

[0005] 中国专利01106637.7公开的冻干血浆的制备方法，需加入保护剂，冻干前需进行低温旋冻，纤维蛋白原、凝血因子Ⅴ、凝血因子Ⅷ、凝血因子Ⅸ、凝血因子Ⅹ等主要凝血因子的回收率可达到65％以上。

[0006] 中国专利02103960.7公开的血浆冻干程序中也在冻干前进行低温旋冻，总时长达100～120小时，未对制备获得的冻干血浆中血浆蛋白活性进行描述。

发明内容

[0007] 本发明的目的是针对现有技术的上述缺陷，提供一种冻干血浆的制备方法，不添加保护剂，冻干前不进行旋冻，冻干后主要血浆蛋白的回收率能达到80％以上。

[0008] 本发明提供的制备冻干血浆的方法，依次包括：

[0009] 将血浆置于冻干机中，液面高度不超过3.7cm，以1℃/min速率降温至‑45℃，维持18h～20h后，进行第一次抽真空；

[0010] 再按照如下升温步骤进行升温：

[0011] 在3h内升温至‑30℃并维持此温度12h～14h；

[0012] 之后每4h升温5℃直至体系温度为‑15℃；

[0013] 再在2h内升温至‑10℃并维持此温度16h～18h；

[0014] 再在2h内升温至‑5℃并维持此温度16h～18h；

[0015] 再在2h内升温至0℃并维持此温度4h～6h；

[0016] 之后每2h升温10℃直至20℃；

[0017] 再在30min内升温至25℃并同时进行第二次抽真空，保持3h，然后压瓶塞，维持原真空度密封。

[0018] 上述方法所述第一次抽真空步骤中，抽真空后的真空度为0.100mbar；

[0019] 所述第二次抽真空步骤中，抽真空后的真空度为0.001mbar。

[0020] 具体的，所述升温步骤为：

[0021] 在3h内升温至‑30℃并维持此温度12h；

[0022] 之后每4h升温5℃直至体系温度为‑15℃；

[0023] 再在2h内升温至‑10℃并维持此温度16h；

[0024] 再在2h内升温至‑5℃并维持此温度16h；

[0025] 再在2h内升温至0℃并维持此温度4h；

[0026] 之后每2h升温10℃直至20℃。

[0027] 或者，所述升温步骤为：

[0028] 在3h内升温至‑30℃并维持此温度14h；

[0029] 之后每4h升温5℃直至体系温度为‑15℃；

[0030] 再在2h内升温至‑10℃并维持此温度18h；

[0031] 再在2h内升温至‑5℃并维持此温度18h；

[0032] 再在2h内升温至0℃并维持此温度6h；

[0033] 之后每2h升温10℃直至20℃。

[0034] 本发明提供的制备冻干血浆的方法，不添加保护剂，冻干前不进行旋冻，凝血因子Ⅷ和血管性血友病因子(vWF)的回收率能达到70％以上，其余各血浆蛋白的回收率能达到80％以上，具有重要的应用价值。

附图说明

[0035] 图1为冻干血浆外观。

[0036] 图2为实施例1冻干前后血浆中主要血浆蛋白活性；每组中，左为冻干前；右为冻干后。

[0037] 图3为实施例1冻干前后血浆中纤维蛋白原含量；每组中，左为冻干前；右为冻干后。

[0038] 图4为实施例2冻干前后血浆中主要血浆蛋白活性；每组中，左为冻干前；右为冻干后。

[0039] 图5为实施例2冻干前后血浆中纤维蛋白原含量；每组中，左为冻干前；右为冻干后。

具体实施方式

[0040] 下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径获得。

[0041] 实施例1、

[0042] 新鲜冰冻血浆的制备：通过静脉穿刺法采集献血者全血，采集后的血液标本尽快放置在2～8℃温度下保存，在6小时内完成血浆分离并迅速放入速冻机冻结成固体，放入‑18℃以下低温冰箱内保存。

[0043] 将新鲜冰冻血浆置于37℃水浴中融化，融化后将血浆分装到200ml冻干瓶中，每瓶100mL血浆。

[0044] 将血浆放入冻干机中，以1℃/min速率降温至‑45℃，维持18h，然后抽真空至0.100mbar。

[0045] 在3h内升温至‑30℃并维持此温度12h。

[0046] 之后每4h内缓慢升温5℃直至‑15℃。

[0047] 在2h内升温至‑10℃并维持此温度16h。

[0048] 在2h内升温至‑5℃并维持此温度16h。

[0049] 在2h内升温至0℃并维持此温度4h。

[0050] 之后每2h内升温10℃直至20℃。

[0051] 然后30min内升温至25℃并同时抽真空至0.001mbar，最后维持此温度和真空度3h。然后压瓶塞，真空密封样本。总时长为95h40min。血浆冻干的具体程序设置如表1所示。

[0052] 表1、血浆冻干程序设置

[0053]

[0054]

[0055]

[0056] 冻干结束后，对关键指标进行检测，检测结果如下：

[0057] 1)外观：冻干后的血浆外观淡黄均匀疏松，复溶后为淡黄色、黄色液体，无可见异物。

[0058] 2)水分含量：冻干血浆水分含量为1.955％±0.321％。

[0059] 3)复溶时间：加入100ml 20～25℃灭菌注射用水，轻轻摇动，冻干血浆复溶时间为12.98±0.56min。

[0060] 4)血浆蛋白活性：使用凝固法分别检测冻干前后血浆中凝血酶原、凝血因子Ⅴ、凝血因子Ⅶ、凝血因子Ⅷ、凝血因子Ⅸ、凝血因子Ⅹ、凝血因子Ⅺ、凝血因子Ⅻ、蛋白S(PS)及纤维蛋白原含量；发色底物法检测纤溶酶原、抗凝血酶Ⅲ、α2‑抗纤溶酶、蛋白C(PC)；免疫比浊法检测血管性血友病因子(vWF)活性(如图2和图3)。

[0061] 结果显示，凝血因子Ⅷ和血管性血友病因子(vWF)的回收率能达到70％以上，其余各血浆蛋白的回收率能达到80％以上(如表2所示)。

[0062] 表2冻干前后血浆中主要血浆蛋白活性/含量比较

[0063]

[0064] NS：无显著性差异。P>0.05。

[0065] 实施例2、

[0066] 单采新鲜冰冻血浆的获取：采用血液单采机在全封闭的条件下自动将全血中的血浆分离出，并迅速放入速冻机在6h内冻结成固体，放入‑18℃以下低温冰箱内保存。

[0067] 将新鲜冰冻血浆置于37℃水浴中融化，融化后将血浆分装到200ml冻干瓶中，每瓶100mL血浆。

[0068] 将血浆放入冻干机中，以1℃/min速率降温至‑45℃，维持20h，然后抽真空至0.100mbar。

[0069] 在3h内升温至‑30℃并维持此温度14h。

[0070] 之后每4h内缓慢升温5℃直至‑15℃。

[0071] 在2h内升温至‑10℃并维持此温度18h。

[0072] 在2h内升温至‑5℃并维持此温度18h。

[0073] 在2h内升温至0℃并维持此温度6h。

[0074] 之后每2h内升温10℃直至20℃。

[0075] 然后30min内升温至25℃并同时抽真空至0.001mbar，最后维持此温度和真空度3h。然后压瓶塞，真空密封样本。总时长为105h40min。

[0076] 血浆冻干的具体程序设置如表3所示。

[0077] 表3、血浆冻干程序设置

[0078]

[0079]

[0080] 冻干结束后，对关键指标进行检测，检测结果如下：

[0081] 血浆蛋白活性：使用凝固法分别检测冻干前后血浆中凝血酶原、凝血因子Ⅴ、凝血因子Ⅶ、凝血因子Ⅷ、凝血因子Ⅸ、凝血因子Ⅹ、凝血因子Ⅺ、凝血因子Ⅻ、蛋白S(PS)及纤维蛋白原含量；发色底物法检测纤溶酶原、抗凝血酶Ⅲ、α2‑抗纤溶酶、蛋白C(PC)；免疫比浊法检测血管性血友病因子(vWF)活性(如图4和图5)。

[0082] 结果显示，凝血因子Ⅴ、凝血因子Ⅷ和血管性血友病因子(vWF)的回收率能达到70％以上，其余各血浆蛋白的回收率能达到80％以上(如表4所示)。

[0083] 表4冻干前后血浆中主要血浆蛋白活性/含量比较

[0084]

[0085] NS：无显著性差异。P>0.05。