新型冠状病毒（2019-ncov）抗原表位、抗体及其应用

摘要

本发明提供一种新型冠状病毒(2019‑nCoV)抗原表位，所述抗原表位为编码1D1‑30抗原表位的短肽。本发明所述抗原表位可以与nCoV反应，而不与其它肺部感染性冠状病毒等发生反应，也不与正常人血清发生反应。所述抗原表位在新型冠状病毒(2019‑nCoV)免疫检测和中和抗体设计中的应用，该应用使得新型冠状病毒(2019‑nCoV)抗体诊断抗原可以用普通化学合成方法制备，相比基因工程重组表达蛋白做为诊断抗原，合成抗原工艺简便，纯度更高。

权利要求

1.新型冠状病毒（2019‑nCoV）的抗原表位肽，其特征在于，所述抗原表位肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述新型冠状病毒（2019‑nCoV）的抗原表位肽在制备新型冠状病毒免疫检测试剂盒中的应用。

说明书

新型冠状病毒（2019‑ncov）抗原表位、抗体及其应用

[0001] 相关申请的交叉引用

[0002] 本申请要求2020年2月12日提交的中国专利申请202010089222.0的优先权，所述申请的公开内容均援引加入本文。

技术领域

[0003] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种新型冠状病毒(2019‑nCoV)蛋白质的抗原表位、抗体及其应用。

背景技术

[0004] 冠状病毒(Coronaviruses，CoVs)是一组高度多样化的、包膜的、正向单链RNA 病毒，其基因组为26‑32kilobases(kb)，是基因组规模最大的RNA病毒。冠状病毒 (coronavirus，CoV)属巢状病毒目，冠状病毒科，分为本α、β、γ三个属，其中α、β属仅对哺乳动物致病，γ属主要引起鸟类感染。CoV主要通过直接接触分泌物或经气溶胶、飞沫传播，也有证据表明可经粪口途径传播。目前已经发现引起人类呼吸道疾病的人冠状病毒(HCoV)已达7种：HCoV‑229E、HCoV‑OC43、SARS‑CoV、HCoV‑NL63、 HCoV‑HKU1、MERS‑CoV和新型冠状病毒(2019‑nCoV)。基因组序列分析发现，新型冠状病毒(2019‑nCoV)与目前发现的感染人肺部的其余六种冠状病毒(HCoV‑229E、 HCoV‑OC43、SARS‑CoV、HCoV‑NL63、HCoV‑HKU1、MERS‑CoV)具有一定的序列同源性，其中与SARS的核酸序列同源性最高(约79.5％sequence identity)，与MERS 次之(约50％sequence identity)，而与其余的四种冠状病毒的同源性低于40％。新型冠状病毒(2019‑nCoV)编码了ORF1ab polyprotein(GeneID:43560238)、S(surface glycoprotein,GeneID:43560230)、ORF3 protein(GeneID:43560231)、envelope protein (GeneID:43560232)、membrane glycoprotein(GeneID:43560233)、ORF6 protein(GeneID: 43560234)、ORF7 protein(GeneID:43560235)、ORF8 protein(GeneID:43560236)和 N(nucleocapsidphosphoprotein,GeneID:43560237)等。用于CoV物种分类的ORF1ab 中7个保守的复制酶区域，nCoV‑2019和SARS‑CoV之间的氨基酸序列一致率为
94.6％，表明两者属于同一物种。

[0005] 冠状病毒的生命周期(life cycle)分为几个步骤：粘附和入胞、病毒复制酶的翻译、基因组转录和复制、结构蛋白的翻译以及病毒体的组装和分泌。冠状病毒CoV附着于细胞受体蛋白质，诱导胞吞作用而完成入胞；然后病毒内体(endosome)中将核衣壳释放到细胞质中；随后将基因组RNA(gRNA)作为多蛋白ORF1a和ORF1b的翻译模板，这些蛋白被切割形成非结构蛋白(Nonstructural proteins，NSPs)。NSPs能够诱导细胞膜重排以形成双膜囊泡(double‑membrane vesicles，DMV)，病毒复制转录复合物(coronavirus replication transcription complex，RTC)锚定在DMV中。全长gRNA通过负链完成复制，并转录合成亚基因组RNA(sgRNA)，然后利用sgRNA来编码病毒结构蛋白和辅助蛋白。病毒颗粒的组装(assembly)发生在内质网‑高尔基中间体(ERGIC)中，成熟的病毒颗粒最终通过囊泡分泌到胞外。

[0006] 在大多数急性感染性疾病病中，有两种主要的表现形式，即显性感染和隐性感染。 (1)显性感染者就是病人。当感染者的机体抵抗力下降或者感染的病原体数量多、毒力强时，病原体会在人体内大量增殖，通过释放毒素或引起人体免疫反应使感染者表现出明显的相同或不同临床症状，同时不断将病原体排出体外，成为重要的传染源。(2) 隐性感染即无症状感染者。当被感染者机体的抵抗力较强，或感染的病原体数量较少、毒力较弱时，人体感染后经过最长潜伏期也没有出现明显症状和体征，即为无症状感染者。但无症状感染者仍可在一定时间内排出少量病原体，成为传染源传播疾病。目前发现，新型冠状病毒(nCoV‑2019)存在显性感染和隐性感染，无症状感染者已经多例作为传染源的报道。新型冠状病毒(2019‑nCoV)感染肺炎平均潜伏期为5.2天，第95百分位数为12.5天。由一人传至另一人的平均时间为7.5天(5.3～19天)。

[0007] 目前，针对新型冠状病毒(2019‑nCoV)的检测方法主要是核酸检测。核酸检测的基本流程是采样→保存送样→病毒灭活→裂解核酸提取→荧光定量PCR检测等。为避免检测过程的交叉污染和生物安全等，核酸检测要在有条件和资质的实验室进行，对场地要求比较高；需要专门的核酸提取和定量PCR仪等专业设备和专门的经过培训的检测人员，很多的基层医疗机构难以开展；检测通量比较有限，出具报告的时间较长。另外，核酸检测对于阳性病人存在“假阴性”，即有些患者核酸检测结果为阴性，却在临床上被确认为疑似新冠肺炎。阴性检测结果可能意味着一个人没有被感染；但是，这也可能意味着感染尚未发展到足以被检测到的程度。因此迫切需要开发新的新型冠状病毒 (2019‑nCoV)检测方法。

发明内容

[0008] 本发明的目的在于提供新型冠状病毒(2019‑nCoV)的抗原表位。本发明抗原表位具有极高的特异性和稳定性，可以与CSFV反应，而不与pCold‑TF空载体发生反应，也不与Vero细胞发生反应。

[0009] 本发明新型冠状病毒(2019‑nCoV)的抗原表位序列如表1所示。

[0010] 表1.新型冠状病毒(2019‑nCoV)的抗原表位序列

[0011]

[0012] 上述新型冠状病毒(2019‑nCoV)的抗原表位或编码上述新型冠状病毒(2019‑nCoV) 的抗原表位肽及其组合在新型冠状病毒(2019‑nCoV)免疫检测试剂中的应用。

[0013] 上述新型冠状病毒(2019‑nCoV)编码蛋白质抗原表位肽在病毒免疫检测种的应用，以获得的抗原表位作为参考化学合成抗原，以合成抗原制备试剂盒主要组分抗原包被板，按常规方法制备试剂盒其他组分，使用试剂盒检测血清中新型冠状病毒 (2019‑nCoV)抗体。

[0014] 上述新型冠状病毒(2019‑nCoV)的抗原表位在制备检测抗新型冠状病毒 (2019‑nCoV)抗体或者抗新型冠状病毒(2019‑nCoV)多肽抗体试剂盒中的应用。

[0015] 一种检测新型冠状病毒(2019‑nCoV)感染的中和性抗体，包含上述新型冠状病毒 (2019‑nCoV)的抗原表位。

[0016] 上述新型冠状病毒(2019‑nCoV)的抗原表位或编码新型冠状病毒(2019‑nCoV) 的抗原表位的基因在制备治疗新型冠状病毒(2019‑nCoV)药物中的应用。

[0017] 一种疫苗组合物，包含上述新型冠状病毒(2019‑nCoV)的抗原表位。进一步，上述疫苗组合物还包含可药用佐剂。

[0018] 有益效果：

[0019] 本发明提供新型冠状病毒(2019‑nCoV)抗原表位，为编码1D1‑30抗原表位的短肽，序列如表1所示。本发明新型冠状病毒(2019‑nCoV)编码的多个病毒蛋白质抗原表位在新型冠状病毒免疫检测试剂中的应用，将检测阳性的表位肽进行组合包被用于检测，能够进一步提高检测的特异性。本发明提供新型冠状病毒(2019‑nCoV)抗原表位用于新型冠状病毒免疫检测，尤其是隐性感染即无症状感染者的筛查，特异性高，稳定性好，具有重要的临床应用价值。本发明使得新型冠状病毒抗体诊断抗原可以用普通化学合成方法制备，相比基因工程表达蛋白做为诊断抗原，合成抗原工艺简便，纯度更高。本发明利用获得的抗原表位合成肽抗原与基因工程表达抗原相比，生产周期短，易纯化且纯度较高。本发明利用BSA‑peptide免疫小鼠，并经过纯化获得的多抗来作为阳性对照样品，生产周期短，易纯化且性能稳定。与现有的核酸诊断相比，灭活病毒抗原或基因表达抗原技术相比，本发明检测中使用灭活血清样品(56℃，30分钟)，检测过程不涉及菌种和毒株，工艺安全有保障，不会对环境造成污染。

附图说明

[0020] 图1是ORF1ab表位分析。

[0021] 图2是Spike表位分析。

[0022] 图3是ORF3表位分析。

[0023] 图4是ORF4表位分析。

[0024] 图5是ORF5表位分析。

[0025] 图6是ORF6表位分析。

[0026] 图7是ORF7表位分析。

[0027] 图8是ORF8表位分析。

[0028] 图9是nucleocapsidphosphoprotein表位分析。

[0029] 图10是BSA‑Pep16多抗DEAE纯化图，泳道1，蛋白质marker，泳道2为硫酸铵沉淀后多抗(anti‑peptide‑BSA)，泳道3为DEAE层析穿透液，泳道4为DEAE层析洗脱液。

[0030] 图11是表位肽磁化学发光酶免疫法(MCLIA)检测抗体的特异性结果，通过磁化学发光酶免疫法(MCLIA)检测抗SARS‑CoV‑2的免疫球蛋白(Ig)G和IgM；采集200例健康献血者、167例其他呼吸道病原体感染者和276例确诊SARS‑CoV‑2感染患者血清样本，用 MCLIA检测血清IgG(A)和IgM(B)。

[0031] 图12是测定方法的重复性：(A)反复检测高抗体效价血清样本(10次)；(B)重复检测中效价血清样本(10重复)；(C)低抗体效价血清样本重复检测(10次)；(D)重复检测来自健康对照的样本；CV，变异系数；Ig,免疫球蛋白；S/co,signal‑to‑cutoff。

[0032] 图13是序列稀释比和计算的信号截止值(S/co)值之间的相关性：(A)3个血清样本中免疫球蛋白(Ig)G检测的序列稀释比与S/co值的相关性(n＝每个样本在每种稀释倍数中重复)；(B)3份血清样本中IgM检测序列稀释率与S/co值的相关性(n＝每个样本每种稀释度重复3次)。

[0033] 图14是表位肽磁化学发光酶免疫法(MCLIA)批量检测SRAS‑CoV‑2抗体。

具体实施方式

[0034] 为了使本发明的目的和技术方案更加清楚，下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。要说明的是：以下实施例只用于对本发明进行进一步的说明，而不能理解为对本发明保护范围的限制。本领域的技术人员根据本发明的上述内容做出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。

[0035] 实施例1：新型冠状病毒(2019‑nCoV)编码的多个病毒蛋白质的抗原表位的制备：

[0036] 1.利用生物信息学，根据病毒的基因组(NC_045512.1)编码的9个ORF，并结合二级结构预测，利用多种抗原表位预测软件(包括：

[0037] http://www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred/；http://www.epitope‑informatics.com/Links.htm；http://www.detaibio.com/tools/epitope‑prediction.html；

[0038] http://bio.dfci.harvard.edu/Tools/index.html；http://bio.dfci.harvard.edu/Tools/antigenic.pl 等)，具体的表位肽序列和位点见附表1。

[0039] 表1.新型冠状病毒(2019‑nCoV)的抗原表位序列

[0040]

[0041] 2.合成表位肽时候，在表位适当的端头位置增加Cys(氨基端或者羧基端)。

[0042] 3.利用末端的Cys偶联牛血清白蛋白BSA(BSA‑peptide)，然后进行小鼠免疫，获得多克隆抗体。

[0043] 4.利用溴化氰活化溴化氰活化琼脂糖凝胶4B(Sepharose 4B)，然后将其与BSA进行偶联，制备BSA的亲和层析柱(BSA‑Sepharose)。

[0044] 5.将获得的多克隆抗体血清先后分别利用DEAE、Protein A(ProteinA Sepharose FF)和 BSA‑Sepharose等进行层析纯化，获得特异性的表位肽多克隆抗体。

[0045] ORF1ab表位分析如图1所示；Spike表位分析如图2所示；ORF3表位分析如图3 所示；ORF4表位分析如图4所示；ORF5表位分析如图5所示；ORF6表位分析如图6 所示；ORF7表位分析如图7所示；ORF8表位分析如图8所示；nucleocapsid phosphoprotein表位分析如图9所示。

[0046] 实施例2：抗原肽的合成与BSA偶联

[0047] 1.多肽合成

[0048] 估计表位肽的设计，将序列按照多肽合成常规操作，合成来源于生工生物工程(上海)股份有限公司HPLC检测纯度为95％。多肽末端端增加的半胱氨酸残基用于以其巯基连接偶联剂(BSA)。

[0049] 2.合成多肽与载体的偶联

[0050] 载体蛋白选择BSA(Sigma‑Aldrich公司)，用丙酸盐SPDP(succinimidyl 3‑(2‑pyridyldithio)propionate，PIERCE公司)连接法将合成的多肽与BSA进行偶联：9.2mg SPDP溶解于1480ul DMSO，终浓度为20mM。0.2gBSA溶解于4ml PBS‑EDTA溶液中，室温静置1h；然后利用HiTrapTM脱盐柱洗脱多余的SPDP。8mg多肽加入偶联好的BSA‑SPDP体系中室温过夜。

[0051] 实施例3：多克隆抗体的制备

[0052] 1.鼠多抗的制备

[0053] 用生理盐水将抗原稀释到2倍终浓度(每只小鼠按照100ul计算，抗原为40ug)，按照1:1充分混匀佐剂(QuickAntibody‑Mouse2W，Biodragon公司)。选取6周龄健康雌性BALB/c小鼠，通过后退小腿肌肉注射免疫小鼠，每只小鼠左、右各注射1针 (100ul/针)。14天后可以采集微量尾血进行Elisa测定，抗体滴度可以达到 1:1000‑1:10000或更高，随即采取全血。

[0054] 2.兔多抗的制备

[0055] 用生理盐水将抗原稀释到2倍终浓度(每只家兔按照200ul计算，抗原为50ug)，按照1:1充分混匀佐剂(QuickAntibody‑Rabbit8W，Biodragon公司)。选取1.5‑2.0kg 左右的家兔(每个抗原免疫两只家兔)，通过后退小腿肌肉注射免疫家兔，每只左、右各注射1针(200ul/针)。三周和六周后分别加强免疫一次。第七周采取微量血进行Elisa 测定，抗体滴度约1:10000‑1:1000000，随即采取全血。

[0056] 实施例4：兔多克隆抗体的纯化

[0057] 1.将兔抗血清放入冰水或4℃冰箱中缓慢解冻以避免蛋白质的聚集，然后利用低温(4℃)高速离心机(15,000xg)离心5‑10分钟，弃沉淀取上清再经过滤器过滤除去多余的脂。将收集的兔多抗血清采用辛酸‑硫酸铵分级沉淀除去兔血清中大多数非免疫球蛋白，随后通过DEAE离子层析(GE Healthare)进一步纯化除去白蛋白。SDS‑PAGE 电泳结果所示(图10为BSA‑pep15纯化图)，兔多抗血清辛酸‑硫酸沉淀后得到纯度较高抗体，DEAE离子交换层析进一步纯化后抗体纯度达90％。

[0058] 2.如果需要可以DEAE纯化的多克隆抗体以低速度(约0.5ml/min)将抗血清上到柱上(Protein A sepharose CL‑4B，GE Healtcare)，并进行洗脱杂蛋白质，最后以pH2.7 缓冲溶液洗脱目的蛋白质，收集目的蛋白质备进一步纯化。

[0059] 3.制备BSA亲和层析柱(去除BSA产生的抗体)。取BSA 100mg溶解于10ml 的0.1M碳酸钠缓冲液中(pH8.5)。称量活化填料1g(CNBr‑activitiedsephrose‑4B,GE Healthcare)，在抽滤瓶中用3倍体积1mM HCl清洗填料，或用5倍体积浸泡填料后丢弃上清，尽量吸干液体。将清洗后的填料加入BSA溶液中混合，在摇床上振荡，室温偶联3小时以上或者4℃过夜。加用Tris‑HCl缓冲液或者加入50mg甘氨酸，室温反应 2小时以上以封闭剩余的基团。将偶联后的BSA的填料(BSA‑Sephrose‑4B)装层析柱，用5‑10倍体积的0.5M NaCl溶液洗柱，备用。

[0060] 4.取经过ProteinA亲和层析的样品，上样至经过缓冲液平衡后的BSA层析柱 (BSA‑Sephrose‑4B)(约0.5ml/min),将样品中的抗BSA抗体吸附，而抗peptide抗体穿透层析柱，取穿透样保存，经过SDS‑PAGE电泳鉴定并测定蛋白质浓度后分装保存。

[0061] 实施例5：抗原表位肽的活性初步检测

[0062] 将获得BSA‑peptide作为抗原，用包被液(0.05M碳酸盐缓冲液，pH9.6)稀释 (0.5mg/ml)，然后依次按照1:1000、1:5000、1:10000、1:20000、1:40000、1:80000、 1:160000和1:320000稀释，各稀释度按100ul/孔滴加到Elisa板条中，4℃包被过夜。弃液，用洗涤液洗三次(200ul/孔，每次3‑5分钟)。用封闭液(洗涤液中加终浓度为 5％的脱脂奶粉)封闭1小时(每孔200ul)，弃封闭液后按上述洗涤方法再次洗涤3次。然后利用纯化后的多抗为阳性对照，阴性对照为未免疫家兔血清。结果显示，经过DEAE 纯化后，BSA‑pep15兔多抗效价近80000。

[0063] 应用本发明的多条肽进行验证发现，可以用于nCoV阳性血清的抗体检测。我们进行了初步试验，利用其中某条肽检测核酸检测为阳性的病毒感染者血清和正常人血清，利用Elisa免疫检测技术，结果显示nCoV感染病人血清中的抗体含量显著高于正常人。

[0064] 实施例6：抗原表位肽的筛选与临床样本性能评价

[0065] 为了筛选这些多肽，发明人分别用5份确诊的COVID‑19患者血清和10份正常血清与这些多肽反应。在检测的肽中，从S蛋白设计的(pep7,pep8,pep9,pep10,pep11, pep12,pep13,pep14,pep15,pep16,pep17,pep18,pep19,pep20,pep21)中的多条表位肽具有良好的抗体检测性。

[0066] 以上述Pep15肽为例，进行后续实验。

[0067] 为了确定该检测方法的截止值，发明人首先检测了来自COVID‑19疫情爆发前1‑2 年献血的200名健康献血者的血清样本。IgG和IgM的平均信号截止值(S/co)分别为 0.152±0.109和0.151±0.107(图11)，IgG和IgM检测的阈值值分别为0.7和0.7。

[0068] 为检测检测方法的特异性，对167例感染其他呼吸道病原体(A型流感病毒、B型流感病毒、副流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、支原体、肺炎链球菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌等)的患者血清进行检测。非SARS‑CoV‑2感染患者IgG和IgM的平均 CL值分别为0.121±0.062和0.120±0.065(图11)。结果表明，这20种病原体没有交叉反应，特异性高。

[0069] 为了检验基于磁微粒化学发光法的血清学诊断方法的稳定性，对不同浓度的血清样本进行了10次测定(图12A‑D)。不同浓度样品IgG、IgM检测的变异系数均在6％以下(图 12)，表明该表位肽可以有用于COVID‑19患者的IgG/IgM抗体检测。此外，对6份血清(IgG 3份，IgM 3份)进行系列稀释，并收集S/co值。回归分析显示，S/co值在1‑200 之间线性反映
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血清抗体浓度(IgG,R＝‑0.902,P<0.001[图13A]；IgM,R＝‑0.946,P <0.001[图13B])，保证了进一步基于S/co值进行定量比较的合理性。

[0070] 对276例SARS‑CoV‑2感染者进行RT‑PCR确认后，采用磁微粒化学发光法检测血清抗体IgG和IgM。这些患者的中位年龄为48岁(范围:0.66‑84岁)，276人中有151人 (54.71％)是男性。IgG的置信水平均值为18.62±32.87，范围为0.05‑194.56；IgM为 5.50±22.60，范围为0.04‑318.16。其中71.4％(276中197阳性)的患者对SARS‑CoV‑2抗体为IgG阳性，而57.2％(276人中158人阳性)的患者对SARS‑CoV‑2抗体为IgM阳性。共有225例患者IgM或IgG检测阳性，总阳性率达81.52％(276人中225例)(图14)。

[0071] 综上，本发明提供新型冠状病毒(2019‑nCoV)抗原表位用于新型冠状病毒免疫检测，尤其是隐性感染即无症状感染者的筛查，特异性高，稳定性好，具有重要的临床应用价值。本发明提供的包含上述新型冠状病毒(2019‑nCoV)抗原表位的中和性抗体可以用于新型冠状病毒(2019‑nCoV)感染的检测。本发明提供的包含上述新型冠状病毒 (2019‑nCoV)的抗原表位可以用于制备治疗新型冠状病毒(2019‑nCoV)药物，比如疫苗组合物.疫苗组合物还包含可药用佐剂。