一种高效的外泌体分离纯化方法

摘要

本发明涉及分子生物技术领域，特别涉及一种高效的外泌体分离纯化方法，包括分离血浆，加入阳离子聚合物孵育；滤膜截留与阳离子聚合物结合的外泌体并漂洗外泌体；离液剂洗脱外泌体；加入磁珠吸附并富集外泌体；洗脱获得外泌体浓缩液。与现有技术相比，本发明不借助大型离心设备，采用阳离子聚合物对外泌体进行包覆后，采用离液剂解除阳离子聚合物与外泌体作用，通过简单的过滤，实现外泌体回收，然后通过磁性吸附剂对回收的外泌体进行浓缩，纯化。本发明有效缩短分离时间、提高外泌体回收效率、提高处理样本通量、提升外泌体分离纯度、降低外泌体分离所需试剂及耗材成本，分离得到的高纯度外泌体可用于核酸提取Westernblot、粒径分析、电镜检测等实验。

权利要求

1.一种高效的外泌体分离纯化方法，其特征在于包括以下步骤：S1. 向体液中加入阳离子多聚物，在2‑10℃孵育5‑30 min；所述阳离子多聚物为多聚赖氨酸；

S2. 将体液混合物过滤后，截留物依次加入低浓度离液剂、高浓度离液剂进行洗脱，得到外泌体初分离物；

S3. 将外泌体初分离物中加入磁性吸附剂，在15‑35℃孵育2‑20 min后，去除清液，取出磁性吸附剂；其中，磁性吸附剂为包裹有二氧化钛的磁珠；所述低浓度离液剂为0.5‑2.5M异硫氰酸胍，所述高浓度离液剂为4‑6M异硫氰酸胍；

S4. 向磁性吸附剂加入洗脱剂重悬，在15‑35℃孵育2‑20 min后，取出清液，得到高纯度外泌体。

2.根据权利要求1所述的一种高效的外泌体分离纯化方法，其特征在于：所述体液包括非人新生体的血液、血浆或血清。

3. 根据权利要求1或2所述的一种高效的外泌体分离纯化方法，其特征在于：S2中采用孔径为0.1‑0.3 μm滤膜过滤。

4.根据权利要求1所述的一种高效的外泌体分离纯化方法，其特征在于：S4中所述洗脱剂为浓度为5‑25%氨水。

5.根据权利要求1所述的一种高效的外泌体分离纯化方法，其特征在于：S4中磁性吸附剂重悬前先用PBS漂洗。

说明书

一种高效的外泌体分离纯化方法

技术领域

[0001] 本发明涉及分子生物技术领域，特别涉及一种高效的外泌体分离纯化方法。

背景技术

[0002] 外泌体(Exosomes)是细胞经过"内吞‑融合‑外排"等一系列调控过程而形成的直径在30～150nm的圆形单层膜结构的细胞外小囊泡。外泌体由机体众多类型细胞释放，并广
泛分布于唾液、血浆、乳汁、尿液等体液当中，可以携带蛋白，运送RNA，在细胞间物质和信息
转导中起重要作用。外泌体的发现丰富了研究者们对细胞间通讯方式的认识，加深了对机
体生理、病理过程的理解，2013年诺贝尔生物/医学奖授予了三位在细胞囊泡方面贡献突出
的科学家，使外泌体的研究达到全新的高度。

[0003] 近年来，随着人们对外泌体的研究和认识加深，外泌体检测作为一种新型的液体活检热点技术已被许多临床科研机构广泛地应用于肿瘤和疾病的无创诊断、治疗和监测；
如何高效地提取外泌体是实现这项新兴液体活检技术临床常规化应用的关键。外泌体作为
液体活检的三大领域之一，其潜在的生物靶标众多，但能同时将微量核酸和蛋白，通常，为
获取纯度高的外泌体，需要应用到外泌的分离技术。

[0004] 目前外泌体的分离技术有超速离心法、分子排阻法、免疫捕获法、PEG沉淀等方法。超速离心一般需要7小时以上，且耗时耗力、所需仪器设备昂贵，很难获得足够量的外泌体
用于后续的实验分析；分子排阻法即免疫捕获法所收集的外泌体量少，且费用高昂；PEG沉
淀法虽然可以大规模分离外泌体，但是在收集到大量外泌体的同时不可避免的引入脂蛋
白，造成分离所得外泌体纯度低的问题。由于国内有关外泌体提取试剂的缺乏，我国对外泌
体的研究还基本依赖于过程繁琐的超速离心和进口提取试剂盒，因此，严重阻碍了我国在
外泌体的研究和临床应用上的发展。如何寻求一种能够高效分离外泌体并保证外泌体纯度
的方式是本技术领域迫切需要解决问题。

发明内容

[0005] 针对以上述背景技术的不足，本发明提供一种高效的外泌体分离纯化方法。

[0006] 本发明采用的技术方案如下：一种高效的外泌体分离纯化方法，关键在于包括以下步骤：

[0007] S1. 向体液中加入阳离子多聚物，在2‑10℃孵育5‑30 min；

[0008] S2. 将体液混合物过滤后，截留物依次加入低浓度离液剂、高浓度离液剂进行洗脱，得到外泌体初分离物；

[0009] S3. 将外泌体初分离物中加入磁性吸附剂，在15‑35℃孵育2‑20 min后，去除清液，取出磁性吸附剂；

[0010] S4. 向磁性吸附剂加入氨水重悬，在15‑35℃孵育2‑20 min后，取出清液，得到高纯度外泌体。

[0011] 优选的，所述生理性流体包括以下的流体：鼻咽、口腔、食道、胃、胰腺、肝、胸膜、心包、腹膜、肠、前列腺、精液、阴道分泌物、眼泪、唾液、粘液、胆汁、血液、淋巴、血浆、血清、滑
液、脑脊液、宫腔及附件、尿，以及间隙、细胞内和细胞外的流体；优选是血液、血浆和血清。

[0012] 优选的，S1中所述阳离子多聚物为多聚赖氨酸。

[0013] 优选的，S2中采用孔径为0.1‑0.3 μm滤膜过滤。

[0014] 优选的，S2中所述低浓度离液剂为0.5‑2.5M异硫氰酸胍。

[0015] 优选的，S2中所述高浓度离液剂为4‑6M异硫氰酸胍。

[0016] 优选的，S3中所述磁性吸附剂为包裹有二氧化钛的磁珠。

[0017] 优选的，S4中所述氨水为浓度为5‑25%氨水。

[0018] 优选的，S4中磁性吸附剂重悬前先用PBS漂洗。

[0019] 有益效果：与现有技术相比，本发明提供的一种高效的外泌体分离纯化方法，不借助大型离心设备，采用阳离子聚合物对外泌体进行包覆后，采用低浓度离液剂对外泌体漂
洗后，采用高浓度离液剂解除阳离子聚合物与外泌体作用，再通过简单的过滤，实现外泌体
回收，然后通过磁性吸附剂对回收的外泌体进行浓缩，纯化。本发明有效缩短分离时间、提
高外泌体回收效率、提高处理样本通量、提升外泌体分离纯度、降低外泌体分离所需试剂及
耗材成本，本发明分离得到的高纯度外泌体可用于核酸提取Westernblot，粒径分析，电镜
检测等多种实验。

附图说明

[0020] 图1为各外泌体分离方法得到外泌体纯化后总蛋白浓度对比图；

[0021] 图2为各外泌体分离方法的回收效率对比图；

[0022] 图3为各外泌体分离方法得到外泌体纯化后蛋白总量对比图；

[0023] 图4为各外泌体分离方法得到外泌体纯度对比图；

[0024] 图5为各外泌体分离方法的分离时长对比图。

具体实施方式

[0025] 为使本领域技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合附图和具体实施方式对本发明作详细说明。

[0026] 实施例1 一种高效的外泌体分离纯化方法，包括以下步骤：

[0027] S1. 向血浆中加入阳离子多聚物，在2℃孵育5 min；

[0028] S2. 用注射器抽取血浆混合物，连接孔径为0.1的滤膜，推压注射器过滤，滤膜截留与阳离子聚合物结合的外泌体，断开注射器，并吸取0.5M异硫氰酸胍，连接孔径为0.1的
滤膜，推压注射器过滤，断开注射器，并吸取4M异硫氰酸胍，连接孔径为0.1的滤膜，推压注
射器过滤，收集滤液，得到外泌体初分离物；

[0029] S3. 将外泌体初分离物中加入包裹有二氧化钛的磁珠，在15℃，1000rpm振荡孵育2min后，置于磁力架上，使磁珠沉降1min，去除上清液；

[0030] S4. 将磁珠用PBS漂洗后，加入5%氨水重悬，在15℃，1000rpm振荡孵育5min后，置于磁力架上，使磁珠沉降1min，转移上清液至新管，得到高纯度外泌体。

[0031] 实施例2 一种高效的外泌体分离纯化方法，包括以下步骤：

[0032] S1. 向血浆中加入阳离子多聚物，在10℃孵育30 min；

[0033] S2. 用注射器抽取血浆混合物，连接孔径为0.3的滤膜，推压注射器过滤，滤膜截留与阳离子聚合物结合的外泌体，断开注射器，并吸取2.5M异硫氰酸胍，连接孔径为0.3的
滤膜，推压注射器过滤，断开注射器，并吸取4M异硫氰酸胍，连接孔径为0.3的滤膜，推压注
射器过滤，收集滤液，得到外泌体初分离物；

[0034] S3. 将外泌体初分离物中加入包裹有二氧化钛的磁珠，在35℃，1000rpm振荡孵育20min后，置于磁力架上，使磁珠沉降1min，去除上清液；

[0035] S4. 将磁珠用PBS漂洗后，加入5%氨水重悬，在35℃，1000rpm振荡孵育20min后，置于磁力架上，使磁珠沉降1min，转移上清液至新管，得到高纯度外泌体。

[0036] 实施例3 一种高效的外泌体分离纯化方法，包括以下步骤：

[0037] S1. 向血浆中加入阳离子多聚物，在4℃孵育20 min；

[0038] S2. 用注射器抽取血浆混合物，连接孔径为0.2的滤膜，推压注射器过滤，滤膜截留与阳离子聚合物结合的外泌体，断开注射器，并吸取2M异硫氰酸胍，连接孔径为0.2的滤
膜，推压注射器过滤，断开注射器，并吸取5M异硫氰酸胍，连接孔径为0.2的滤膜，推压注射
器过滤，收集滤液，得到外泌体初分离物；

[0039] S3. 将外泌体初分离物中加入包裹有二氧化钛的磁珠，在25℃，1000rpm振荡孵育10min后，置于磁力架上，使磁珠沉降1min，去除上清液；

[0040] S4. 将磁珠用PBS漂洗后，加入5%氨水重悬，在25℃，1000rpm振荡孵育10min后，置于磁力架上，使磁珠沉降1min，转移上清液至新管，得到高纯度外泌体。

[0041] 对比例1 采用UC法分离

[0042] 取血浆300 g  ,4℃,10 min离心，转移上清至新管；10000 g，4℃，20 min离心，将上清用0.22 μm滤膜过滤；100000 g, 4℃, 90 min, 移去上清；1mL冷PBS重悬沉淀，再次
100000 g, 4℃, 90 min, 100 μL 冷PBS重悬沉淀获得外泌体。

[0043] 对比例2 采用FC法分离

[0044] 取血浆300 g  , 4℃, 10 min离心，转移上清至新管；10000 g，4℃，20 min离心，将上清用0.22μm滤膜过滤；将过滤后液体加入到Amicon Ultra 100KD超滤管中，加入4mL 
PBS，混匀，3000 g，离心至剩余200μL液体停止，再次加入4mL PBS离心至剩余200μL液体停
止，将液体转移至新管，即为分离后外泌体。

[0045] 对比例3 采用IP法分离

[0046] 取浆300 g  , 4℃, 10 min离心，转移上清至新管；10000 g，4℃，20 min离心，将上清用0.22 μm滤膜过滤；向溶液中加入10 μL已用PBS平衡耦联CD9/CD63/CD81磁珠，4℃振
荡混匀60 min，将离心管置于磁力架上1min，去除上清；将离心管从磁力架上取下，加入1mL 
PBS重悬磁珠，再次将离心管置于磁力架上1min，去除上清；将离心管从磁力架上取下，加入
100 μL 0.1 M GlysinepH3.0, 吹打混匀，室温孵育5min；将离心管置于磁力架上1min，转
移上清至新管，加入400 μLPBS，获得外泌体。

[0047] 对比例4 采用PEG法分离

[0048] 取200μL血浆300 g  , 4℃, 10 min离心，转移上清至新管；10000 g，4℃，20 min离心，将上清用0.22 μm滤膜过滤；向溶液中加入100 μLPBS与60 μL沉淀剂（invitrogen），4
℃孵育30 min；10000 g，5min离心，去除上清；向沉淀中加入100 μL PBS，移液器重悬外泌
体。

[0049] 测定采用实施例3及对比例1‑4的方法分离的外泌体的回收率、总蛋白浓度及含量。

[0050] 蛋白浓度测定：将外泌体溶液统一稀释到500μL后Bradford法测定分离后外泌体溶液蛋白浓度。图1中显示，本发明所分离的外泌体的总蛋白浓度高于对比例1‑3，低于对比
例4采用的PEG法。

[0051] 回收率测试：采用Bradford法测定分离后外泌体溶液蛋白浓度，根据测定浓度取50μg蛋白总量溶液，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，分别用CD9/CD63/TSG101抗体杂交检测。图2
中显示，本发明对外泌体回收率远远高于对比例1‑3，略高于对比例4采用的PEG法。

[0052] 外泌体总量测定：利用zetaview粒径检测仪，测定溶液中颗粒含量。图3中显示，本发明所分离的外泌体总量高于对比例1‑4。

[0053] 外泌体纯度测定：将囊泡数除以总蛋白含量，并用UC法比值作为1进行均一化，得到分离纯度比值。图4中显示，本发明所分离的外泌体纯度高于对比例1、2、4，略低于对比例
3采用的IP法。

[0054] 图5中显示，采用本发明方法分离外泌体，全程用时不到40 min，低于对比例1‑4的分离时间，操作便捷。

[0055] 最后需要说明，上述描述仅为本发明的优选实施例，本领域的技术人员在本发明的启示下，在不违背本发明宗旨及权利要求的前提下，可以做出多种类似的表示，这样的变
换均落入本发明的保护范围之内。