一款利用肺泡灌洗液中ND1预测急性呼吸窘迫综合征预后的试剂盒

摘要

本发明属于急性呼吸窘迫综合征检测领域。本发明提供了一款利用肺泡灌洗液中ND1预测急性呼吸窘迫综合征预后的试剂盒，以及检测肺泡灌洗液中ND1蛋白的试剂在制备急性呼吸窘迫综合征预后评价试剂盒中的用途。实验表明，肺泡灌洗液中ND1含量越高，急性呼吸窘迫综合征患者的死亡风险越高。通过检测ND1蛋白在肺泡灌洗液中的含量，实现急性呼吸窘迫综合征的快速预后评估，应用前景良好。

权利要求

1.检测肺泡灌洗液中ND1蛋白含量的试剂在制备急性呼吸窘迫综合征预后评价试剂盒中的用途，其特征在于，当肺泡灌洗液中ND1蛋白的检测值为0.5095ng/mL以下时，认为急性呼吸窘迫综合征患者死亡风险低。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述检测肺泡灌洗液中ND1蛋白含量的试剂为酶联免疫吸附检测试剂。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述检测肺泡灌洗液中ND1蛋白含量的试剂为液相色谱方法用试剂。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述检测肺泡灌洗液中ND1蛋白含量的试剂为胶体金检测试剂。

5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述检测肺泡灌洗液中ND1蛋白含量的试剂为液相芯片检测用试剂。

说明书

一款利用肺泡灌洗液中ND1预测急性呼吸窘迫综合征预后的

试剂盒

技术领域

[0001] 本发明属于急性呼吸窘迫综合征预后评估领域。

背景技术

[0002] 急性呼吸窘迫综合征(ARDS)是由肺内原因和/或肺外原因引起的，以顽固性低氧血症为显著特征的临床综合征，因高病死率而倍受关注。

[0003] 及时评价ARDS患者预后，进而尽早发现和识别高危患者，对降低患者死亡风险至关重要。急性病理生理和慢性健康(Acute  Physiology and Chronic Health EvaluationII，APACHE II)评分可用于ARDS预后评价，包括急性生理评分、年龄评分及慢性健康评分。APACHE II评分的缺点是涉及评估项目较多，耗时繁琐，且具有一定的主观性。

[0004] 生物标志物是一种评价ARDS预后的新兴手段。目前已经报道了若干血浆内的生物标志物，例如：降钙素原、sRAGE、Ang‑2、vWF、SP‑D、TNFR‑1、IL‑6、IL‑8等等，但是血浆中标志物往往不具有肺部病变特异性。同时，ARDS患者需要行气管插管机械通气，在治疗过程中，纤支镜检查是评估呼吸道及肺部病变的常规检查，而检查中留取的肺泡灌洗液标本可以行微生物培养、细胞染色等检查。肺泡灌洗液来源于肺部，更能准确地反映肺部病变的特点，在评估患者肺部病变时优于血液标本(García‑Laorden MI，et al.Biomarkers for the acute respiratory distress syndrome：how to make the diagnosis more precise.Ann Transl Med.2017；5：283.)。既往研究发现，相较于血浆，肺泡灌洗液中的IL‑
8更能够准确地预测ARDS的发生(Donnelly SC，et al.Interleukin‑8 and development of adult respiratory distress syndrome in aa‑risk patient groups.Lancet Lond Engl.1993；341：643‑7.)。但目前，针对肺泡灌洗液中的生物标志物在ARDS预后评估中的作用相关研究数量远低于针对血浆标志物的相关研究。

[0005] ND1(UniProtKB中编号为P03886)，也叫MT‑ND1，是一种线粒体编码的NADH脱氢酶。细胞损伤后，可以释放ND1等线粒体蛋白及核酸，作为损伤相关分子，参与各类疾病发生发展。而作为标志物，血浆中ND1 RNA水平可用于非小细胞肺癌诊断(Wang L，et al..Plasma RNA sequencing of extracellular RNAs reveals potential biomarkers for non‑small cell lung cancer.Clin Biochem.2020Sep；83：65‑73.)，血浆中ND1在内的线粒体DNA损伤模式可以用于评估输血相关的急性肺损伤(Lee YL，et al..Blood transfusion products contain mitochondrial DNA damage‑associated molecular patterns：a potential effector of transfusion‑related acute lung injury.J  Surg 
Res.2014Oct；191(2)：286‑9.)。但目前尚未见将ND1蛋白尤其是肺泡灌洗液中ND1蛋白作为ARDS预后评价的客观标志物。

发明内容

[0006] 本发明的目的是提供另一种新的ARDS预后标志物，并将其用于制备ARDS预后评价试剂盒。

[0007] 本发明的技术方案包括：

[0008] 检测肺泡灌洗液中ND1蛋白含量的试剂在制备ARDS预后评价试剂盒中的用途。

[0009] 如前述的用途，所述检测肺泡灌洗液中ND1蛋白含量的试剂为酶联免疫吸附检测(ELISA)试剂。

[0010] 如前述的用途，所述检测肺泡灌洗液中ND1蛋白含量的试剂为液相色谱方法用试剂或胶体金检测试剂。

[0011] 如前述的用途，所述检测肺泡灌洗液中ND1蛋白含量的试剂为液相芯片检测试剂。

[0012] 一种ARDS预后评价试剂盒，它包括检测肺泡灌洗液中ND1蛋白含量的试剂。

[0013] 如前述的预后评价试剂盒，所述检测肺泡灌洗液中ND1蛋白含量的试剂为酶联免疫吸附检测试剂。

[0014] 如前述的预后评价试剂盒，所述检测肺泡灌洗液中ND1蛋白含量的试剂为液相色谱方法用试剂或胶体金检测试剂。

[0015] 如前述的预后评价试剂盒，所述检测肺泡灌洗液中ND1蛋白含量的试剂为液相芯片检测试剂。

[0016] 实验发现，ARDS患者的预后与其肺泡灌洗液中ND1蛋白的含量存在显著性区别，ARDS危重患者(容易在28天内死亡)肺泡灌洗液中ND1蛋白含量远高于非危重患者。根据该发现，本发明的试剂盒可快速对ARDS患者预后进行评估，进而识别其中的危重患者。

[0017] 本发明的核心构思是借助肺泡灌洗液中ND1蛋白的浓度来评估ARDS患者预后，而不是借助何种技术手段进行检测。因此，利用常规蛋白检测方法例如液相色谱(比如高效液相色谱、超高效液相色谱)、液相芯片Luminex、酶联免疫吸附检测、胶体金均可对ND1蛋白进行检测，进而对ARDS患者预后评估的技术均在本发明的范围内。

[0018] 显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

[0019] 以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

[0020] 图1：不同组患者肺泡灌洗液中ND1蛋白的含量；

[0021] 图2：肺泡灌洗液中ND1蛋白含量及APACH II和氧合指数预测ARDS患者28天内死亡的ROC曲线；

[0022] 图3：根据肺泡灌洗液中ND1最佳预测临界值分组后患者28天生存曲线。

具体实施方式

[0023] 实施例1 ARDS患者肺泡灌洗液和血浆中ND1蛋白检测与生存分析

[0024] 1.被检对象

[0025] 募集ARDS患者51人，随访28天后死亡的ARDS患者为20人，28天后存活的患者为31人。被检对象人群在实验前均已经知情并同意。

[0026] 2.方法

[0027] 2.1ND1蛋白检测

[0028] 采集被检对象的肺泡灌洗液(BALF)，针对肺泡灌洗液中ND1蛋白进行ELISA检测，具体地，包括如下步骤：

[0029] (1)向96孔板(已包被ND1抗体)内加入100μL标准品或样本，封膜后，37度摇晃孵育2小时；

[0030] (2)300μL洗板液洗板3次；

[0031] (3)每孔内加入100μL生物素标记的二抗，封膜后37度摇晃孵育1小时；

[0032] (4)300μL洗板液洗板3次；

[0033] (5)向每孔中加入50μL显色液，室温摇晃混匀20min；

[0034] (6)向每孔内加入50μL终止液，室温摇晃混匀；

[0035] (7)30min内读板(Bio‑Rad)。

[0036] 2.2PaO2和FiO2检测

[0037] 经桡动脉抽取患者动脉血液，立即将样本送入血气分析仪(罗氏)进行血气分析检测，获得动脉血氧分压(PaO2)，同时记录患者抽取动脉血标本时的给氧浓度(FiO2)，根据检测结果计算获得氧合指数(PaO2/FiO2)。

[0038] 2.3APACHE II评分

[0039] 根据Knaus等(Knaus WA，et al.APACHE II：a severity of disease classification system.Crit Care Med.1985，13：818‑829.)所规定的方法，得出被检对象的APACHE II评分。简单来说，APACHII评分主要包括急性生理评分、年龄评分以及慢性健康评分。

[0040] 2.4组间比较、ROC分析和生存分析

[0041] 利用t检验，分析存活组与未存活组之间，肺泡灌洗液中ND1含量的差异；根据ND1水平与患者28天内生存情况，进行ROC分析，同时，利用ROC曲线分析APACH II评分及氧合指数在ARDS预后评估中的价值；之后，根据ROC分析确定的最佳预测临界值，将ARDS患者分为高ND1水平和低ND1水平组，比较两组在28天内的生存率。

[0042] 2.5单因素COX比例风险模型分析和多因素COX模型分析

[0043] 针对ND1含量、APACH II评分以及氧合指数对患者死亡的影响，利用SPSS软件进行单因素COX比例风险模型分析；之后将上述指标带入SPSS软件中多因素COX比例风险模型中进行进一步分析，进一步确定各指标对患者预后评估的价值。

[0044] 3.结果

[0045] 3.1组间比较、ROC分析和生存率比较结果

[0046] (1)死亡组患者BALF中的ND1蛋白含量显著增加

[0047] 相较于存活患者，28天内死亡患者BALF中的ND1蛋白的含量显著增加(如图1所示)；

[0048] (2)BLAF中ND1蛋白含量预测28天内死亡的ROC曲线

[0049] ROC曲线分析发现，BALF中ND1蛋白的含量预测患者28天内死亡的曲线下面积(AUC)为0.7226(如图2所示)，显著优于APACH II评分(AUC＝0.6266)及氧合指数(AUC＝0.5266)，表明BALF中ND1蛋白水平可以较准确地预测ARDS患者28天内的生存情况，且优于传统指标APACH II评分及氧合指数。

[0050] (3)生存分析

[0051] 根据ROC曲线，确定用于预后评价的BALF中ND1的最佳预测临界值为0.5095ng/mL，将ARDS患者分为高ND1水平组和低ND1水平组，如图3所示，低ND1水平组死亡率为0％，高ND1水平组死亡率显著升高。

[0052] 3.2单因素COX比例风险模型分析和多因素COX模型分析结果

[0053] 风险比例HR大于1表示预测因素会增加风险，小于1表示会预测因素会减小风险。

[0054] 如表1所示，用单因素COX比例风险模型分析发现，BALF中ND1多肽的释放量，与ARDS患者预后相关，同时APACH II评分也与预后相关，但是氧合指数与患者预后无关。进一步的多因素COX模型分析发现，BALF ND1及APACHEII评分与预后相关，且BALF ND1每增加1ng/mL，患者死亡风险增高1.2倍，预测能力高于APACH II评分的1.1倍。

[0055] 表1 COX比例风险模型分析结果

[0056]

[0057] 上述结果表明，利用肺泡灌洗液中ND1蛋白的浓度，可有效评估ARDS患者的预后，便于及时分辨高危患者。

[0058] 实施例2本发明的试剂盒

[0059] 1.本发明试剂盒的组成

[0060] 试剂盒的组成如表2所示。

[0061] 表2试剂盒组成

[0062]

[0063]

[0064] ND1特异性抗体为Santa Cruz厂家生产的ND1抗体(3H3)，货号：sc‑293243。

[0065] 2.试剂盒使用方法

[0066] (1)向96孔板(已包被ND‑1抗体)内加入100μL标准品或样本，封膜后，37度摇晃孵育2小时；

[0067] (2)300μL洗板液洗板3次；

[0068] (3)每孔内加入100μL生物素标记的二抗，封膜后37度摇晃孵育1小时；

[0069] (4)300μL洗板液洗板3次；

[0070] (5)向每孔中加入50μL显色液，37度摇晃混匀20min；

[0071] (6)向每孔内加入50μL终止液，室温摇晃混匀；

[0072] (7)30min内读板(Bio‑Rad)。

[0073] 当肺泡灌洗液中ND1蛋白的检测值为0.5095ng/mL(即cut‑off值)以下时，可认为ARDS患者死亡风险低，而在0.5095ng/mL以上时，可认为ARDS患者为危重患者，死亡风险较高。

[0074] 综上，本发明的试剂盒通过对ND1蛋白的定量检测，可实现对ARDS预后进行快速判断，为危重病患提供有效预警。