一种基于量子点免疫荧光检测试剂盒制备方法

摘要

本发明涉及生物技术相关技术领域，通过在玻璃纤维膜的上表面从左到右依次设置有KIM‑检测线、NGAL检测线、mALB检测线和质控线；玻璃纤维膜的外部套接设置有卡壳；卡壳的左侧上表面开设加工有加样孔；KIM‑检测线和NGAL检测线、NGAL检测线和mALB检测线之间的距离为4至6毫米；mALB检测线和质控线之间的距离为3至4毫米；在玻璃纤维膜正上方的所述卡壳上表面位置开设加工有观测口；制备过程经过溶液配制以及微球活化处理并进行不同抗体偶联液配制再将其附着到对应检测线上等处理步骤，本发明能够提供一种稳定性好、量子点的荧光寿命长、特异性强以及灵敏度高的基于量子点免疫荧光检测试剂盒及其制备方法。

权利要求

1.一种基于量子点免疫荧光检测试剂盒制备方法，试剂盒 包括玻璃纤维膜（ 1）、KIM‑

1检测线（2）、NGAL检测线（3）、mALB检测线（4）、质控线（5）、卡壳（6）和加样孔（7）；所述玻璃纤维膜（1）的上表面从左到右依次设置有KIM‑1检测线（2）、NGAL检测线（3）、mALB检测线（4）和质控线（5）；所述玻璃纤维膜（1）的外部套接设置有卡壳（6）；所述卡壳（6）的左侧上表面开设加工有加样孔（7）；所述KIM‑1检测线（2）和NGAL检测线（3）、所述NGAL检测线（3）和mALB检测线（4）之间的距离为4至6毫米；所述mALB检测线（4）和质控线（5）之间的距离为3至4毫米；在所述玻璃纤维膜（1）正上方的所述卡壳（6）上表面位置开设加工有观测口；其特征在于，制备具体包括如下步骤：

步骤S1：首先进行活化液的配制，称量10.66g活化剂MES于烧杯中，加入纯化水1L，搅拌均匀后，用NaOH溶液调整pH至6.0，定温到4℃，保存备用；

步骤S2：再进行偶联液的配制，称量1.066g活化剂MES于烧杯中，加入纯化水1L，搅拌混匀后，用NaOH溶液调整pH至6.5，定温到4℃，保存备用；

步骤S3：然后进行微球保存液配制，称量0.718g硼酸、0.798g四硼酸钠、10g牛血清蛋白、5g月桂醇聚氧乙烯醚‑23、1g吐温‑20和50g的蔗糖于烧杯中，加入纯化水1L，搅拌混匀后，用NaOH溶液调整pH至8.0，定温到4℃，保存备用；

步骤S4：微球液配制，取1ml浓度为1umol/L，粒径为100nm，发射波长为614nm的量子点微球加入到所述步骤S1调配好的活化液中，活化液取5ml，搅拌混匀溶解；

步骤S5：微球活化，在所述步骤S4配制好的微球溶解液中加入4mg EDC和40mg NHS，然后放入振荡器中控制温度25℃且转速180rpm，活化30min，活化好后取出放入离心机控制温度4℃且转速15000rpm，离心30min，弃上清，再加入所述步骤S2配制好的偶联液重悬，得到活化的荧光微球溶液；

步骤S6：KIM‑1抗体偶联液配制，将2mg KIM‑1标记抗体加入到所述步骤S5配制好的荧光微球溶液当中，在振荡器中控制温度25℃且转速180rpm，偶联2h；再加入30ul的乙醇胺涡旋混匀后放入振荡器中控制温度25℃且转速180rpm，振荡1h；取出放入离心机控制温度4℃且转速15000rpm，离心30min，弃上清，再加入5ml含10%BSA的所述步骤S3的微球保存液，再放入振荡器中控制温度25℃且转速180rpm，封闭1h；取出放入离心机控制温度4℃且转速

15000rpm，离心30min，弃上清，再加入1ml所述步骤S3的微球保存液，即可得到KIM‑1抗体标记荧光微球；

步骤S7：NGAL抗体偶联液配制，将1.5mg NGAL标记抗体加入到所述步骤S5配制好的荧光微球溶液当中，在振荡器中控制温度25℃且转速180rpm，偶联2h；再加入30ul的乙醇胺涡旋混匀后放入振荡器中控制温度25℃且转速180rpm，振荡1h；取出放入离心机控制温度4℃且转速15000rpm，离心30min，弃上清，再加入5ml含10%BSA的所述步骤S3的微球保存液，再放入振荡器中控制温度25℃且转速180rpm，封闭1h；取出放入离心机控制温度4℃且转速

15000rpm，离心30min，弃上清，加入1ml所述步骤S3的微球保存液，即可得到NGAL抗体标记荧光微球；

步骤S8：mALB抗体偶联液配制，将3mg的NGAL标记抗体加入到所述步骤S5配制好的荧光微球溶液当中，在振荡器中控制温度25℃且转速180rpm，偶联2h；再加入30ul的乙醇胺涡旋混匀后放入振荡器中控制温度25℃且转速180rpm，振荡1h；取出放入离心机控制温度4℃且转速15000rpm，离心30min，弃上清，再加入5ml含10%BSA的所述步骤S3的微球保存液，再放入振荡器中控制温度25℃且转速180rpm，封闭1h；取出放入离心机控制温度4℃且转速

15000rpm，离心30min，弃上清，加入1ml所述步骤S3的微球保存液，即可得到mALB抗体标记荧光微球；

步骤S9：将步骤S6、步骤S7与步骤S8所得到的各个荧光微球溶液分别按体积比值2：4：3进行混合调配，并且搅拌均匀待用；

步骤S10：玻璃纤维膜制备，将玻璃纤维膜裁成20mm*30mm的尺寸，浸泡于20mM的PB处理液中，室温浸泡1h，然后放置在37℃的烘箱中，干燥12小时；

步骤S11：将步骤S10制备好的玻璃纤维膜放在喷金仪器上，然后将所述步骤S9混合调配的三种抗体量子点免疫荧光微球溶液喷到玻璃纤维膜上，再放入37℃烘箱干燥2小时后，即可制得成品玻璃纤维膜待后续步骤使用；

步骤S12：将步骤S6、步骤S7与步骤S8所得到的各个荧光微球溶液分别稀释至1mg/ml、

2mg/ml和1.5mg/ml的浓度，再通过喷金仪器，用0.5ul/cm的喷量依次喷划在所述步骤S11制备的玻璃纤维膜已划好分割线的不同区域形成KIM‑1检测线（2）、NGAL检测线（3）和mALB检测线（4）；将兔抗鸡稀释液稀释至1mg/ml，再通过喷金仪器以1.5ul/cm的划量划在所述步骤S11制备的玻璃纤维膜已划好分割线的区域形成质控线（5）；

步骤S13：将所述步骤S12处理后的玻璃纤维膜（1）装入卡壳（6）内即得量子点免疫荧光检测三联试剂盒。

2.根据权利要求1所述的一种基于量子点免疫荧光检测试剂盒制备方法，其特征在于：所述KIM‑1抗体标记荧光微球是通过EDC和NHS使KIM‑1抗体上N端氨基与荧光微球上的羧基通过化学键连接。

3.根据权利要求1所述的一种基于量子点免疫荧光检测试剂盒制备方法，其特征在于：所述NGAL抗体标记荧光微球是通过EDC和NHS使NGAL抗体上N端氨基与荧光微球上的羧基通过化学键连接。

4.根据权利要求1所述的一种基于量子点免疫荧光检测试剂盒制备方法，其特征在于：所述mALB抗体标记荧光微球是通过EDC和NHS使mALB抗体上N端氨基与荧光微球上的羧基通过化学键连接。

5.根据权利要求1所述的一种基于量子点免疫荧光检测试剂盒制备方法，其特征在于：所述卡壳（6）的外部设置有干燥剂。

6.根据权利要求1所述的一种基于量子点免疫荧光检测试剂盒制备方法，其特征在于：所述KIM‑1检测线（2）的线性检测范围为30‑2000pg/mL。

7.根据权利要求1所述的一种基于量子点免疫荧光检测试剂盒制备方法，其特征在于：所述NGAL检测线（3）的线性检测范围为50‑5000ng/ml。

8.根据权利要求1所述的一种基于量子点免疫荧光检测试剂盒制备方法，其特征在于：所述mALB检测线（4）的线性检测范围为5‑1000ug/ml。

9.根据权利要求1所述的一种基于量子点免疫荧光检测试剂盒制备方法，其特征在于：所述步骤S10中的PB处理液调配成分中包含有0.5%的casein、1.5%的S21、1%的S14和1%的PVP‑30，调配PH值为7.5。

说明书

一种基于量子点免疫荧光检测试剂盒制备方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术相关技术领域，具体涉及一种基于量子点免疫荧光检测试剂盒制备方法。

背景技术

[0002] 肾损伤疾病如急性肾功能衰竭或慢性肾功能衰竭，可由各种不同的原因如疾病，损伤等引起，急性肾损伤（英文简称AKI）是指肾功能的快速丧失，目前临床上通过尿量减
少，血清肌酐上升和尿素氮升高来诊断急性肾损伤，但有一定的延迟性，急性肾损伤（英文
简称AKI）的人群发病率高，全球每年约有两百万人死于AKI，危重症患者，尤其是老年人近
年AKI的发生率日益增加，主要原因在于无法早期诊断AKI，错过了最佳的治疗“时间窗”，为
了提高诊断水平，早期发现急性肾损伤的生物标志物如肾损伤分子‑1(KIM‑1)，中性粒细胞
明胶酶脂质相关运载蛋白（NGAL），尿微量白蛋白（mALB）最近被引入临床实验。

[0003] 肾损伤分子‑1（kidneyinjurymolecule‑1，KIM‑1）是1型跨膜糖蛋白，属于免疫球蛋白基因超家族；在正常的肾组织中检测不到KIM‑1，而在人类和啮齿类动物发生肾损伤
（缺血或中毒）时，其高表达于近端肾小管；KIM‑1的胞外域非常稳定，能在尿液中保存较久，
因此在肾损伤时，可以在病理组织以及尿液中检测到；KIM‑1对于缺血性或肾毒性肾损伤更
为特异，不受氮质血症、尿路感染或慢性肾病的影响；KIM‑1可作为一种检测早期肾损伤的
可靠分子标志物，在临床上具有广阔的应用前景。

[0004] 中性粒细胞明胶酶脂质相关运载蛋白（NGAL）是1993年在研究中性粒细胞明胶酶时发现的一种相对分子量为25000的蛋白质，在正常情况下表达较低，但在各种原因导致的
肾损伤时，NGAL大量表达于缺血的近端肾小管上皮细胞；研究发现，对于心脏手术后出现
AKI的患者，血液和尿液中的NGAL和术前相比明显升高，并且和患者肾损伤程度直接相关；
不仅如此，在肾毒性的相关性研究中也发现，NGAL可以早期预测肾损伤的程度。

[0005] 尿中出现了微量蛋白，称尿微量白蛋白（mALB）；肾脏每天需要将血液中的代谢物过滤掉，肾脏滤过膜的孔径为5.5nm，只允许小分子物质水、电解质（钾、钠、氯）和代谢废物
（肌酐、尿素氮、尿酸等）通过；而血液中的白蛋白直径为7.2nm，不能通过滤过孔，所以尿中
没有蛋白质。

[0006] 目前早期诊断AKI面临的挑战是缺乏敏感性高、特异性好，在肾损伤的早期阶段能准确诊断AKI的标志物；现有临床实践中用于诊断AKI的标志物是血肌酐和尿量，但上述两
个指标存在局限性：血肌酐水平要待肾功能丧失超过一大半时才出现升高，且受诸多非肾
损伤因素（如药物、病人营养状态、机体肌肉量等）影响，不是AKI早期敏感指标；每小时尿量
的精确测定只有在留置导尿管的病人中才能进行，且受利尿剂用量和血容量波动等因素影
响大，普适性低且特异性不高。

发明内容

[0007] 本发明的目的在于提供一种稳定性好、抗漂白能力强、量子点的荧光寿命长、特异性强以及灵敏度高的基于量子点免疫荧光检测试剂盒及其制备方法。

[0008] 下面关于后续技术方案表述中涉及的专业名词解释如下：

[0009] KIM‑1：肾损伤分子‑1；

[0010] NGAL：中性粒细胞明胶酶相关性脂质运载蛋白；

[0011] mALB：尿微量白蛋白；

[0012] AKI：急性肾损伤；

[0013] PB：磷酸缓冲液；

[0014] casein：酪蛋白；

[0015] S21：月桂醇聚氧乙烯醚‑23；

[0016] S14：曲拉通‑100；

[0017] PVP‑30：聚乙烯吡咯烷酮k30；

[0018] EDC：碳化二亚胺；

[0019] NHS：N羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐；

[0020] MES：吗啉乙磺酸；

[0021] BSA：牛血清蛋白；

[0022] BB：硼酸缓冲溶液；

[0023] T20：吐温‑20；

[0024] NaOH：氢氧化钠；

[0025] 兔抗鸡稀释液是指兔抗鸡IGY溶液，通过用鸡卵清蛋白对无菌家兔进行系统免疫后在其血液中制得的免疫血清。

[0026] 为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种基于量子点免疫荧光检测试剂盒，包括玻璃纤维膜、KIM‑检测线、NGAL检测线、mALB检测线、质控线、卡壳和加样孔；所述玻
璃纤维膜的上表面从左到右依次设置有KIM‑检测线、NGAL检测线、mALB检测线和质控线；所
述玻璃纤维膜的外部套接设置有卡壳；所述卡壳的左侧上表面开设加工有加样孔；所述
KIM‑检测线和NGAL检测线、所述NGAL检测线和mALB检测线之间的距离为3至6毫米；所述
mALB检测线和质控线之间的距离为3至4毫米；在所述玻璃纤维膜正上方的所述卡壳上表面
位置开设加工有观测口。

[0027] 一种基于量子点免疫荧光检测试剂盒制备方法，具体包括如下步骤：

[0028] 步骤S1：首先进行活化液的配制，称量10.66g活化剂MES于烧杯中，加入纯化水1L，搅拌均匀后，用NaOH溶液调整pH至6.0，定温到4℃，保存备用；

[0029] 步骤S2：再进行偶联液的配制，称量1.066g活化剂MES于烧杯中，加入纯化水1L，搅拌混匀后，用NaOH溶液调整pH至6.5，定温到4℃，保存备用；

[0030] 步骤S3：然后进行微球保存液配制，称量0.718g硼酸、0.798g四硼酸钠、10g牛血清蛋白、5g月桂醇聚氧乙烯醚‑23、1g吐温‑20和50g的蔗糖于烧杯中，加入纯化水1L，搅拌混匀
后，用NaOH溶液调整pH至8.0，定温到4℃，保存备用；

[0031] 步骤S4：微球液配制，取1ml浓度为1umol/L，粒径为100nm，发射波长为614nm的量子点微球加入到所述步骤S1调配好的活化液中，活化液取5ml，搅拌混匀溶解；

[0032] 步骤S5：微球活化，在所述步骤S4配制好的微球溶解液中加入4mg EDC和40mg NHS，然后放入振荡器中控制温度25℃且转速180rpm，活化30min，活化好后取出放入离心机
控制温度4℃且转速15000rpm，离心30min，弃上清，再加入所述步骤S2配制好的偶联液重
悬，得到活化的荧光微球溶液；

[0033] 步骤S6：KIM‑1抗体偶联液配制，将2mg KIM‑1标记抗体加入到所述步骤S5配制好的荧光微球溶液当中，在振荡器中控制温度25℃且转速180rpm，偶联2h；再加入30ul的乙醇
胺涡旋混匀后放入振荡器中控制温度25℃且转速180rpm，振荡1h；取出放入离心机控制温
度4℃且转速15000rpm，离心30min，弃上清，再加入5ml含10%BSA的所述步骤S3的微球保存
液，再放入振荡器中控制温度25℃且转速180rpm，封闭1h；取出放入离心机控制温度4℃且
转速15000rpm，离心30min，弃上清，再加入1ml所述步骤S3的微球保存液，即可得到KIM‑1抗
体标记荧光微球；

[0034] 步骤S7：NGAL抗体偶联液配制，将1.5mg NGAL标记抗体加入到所述步骤S5配制好的荧光微球溶液当中，在振荡器中控制温度25℃且转速180rpm，偶联2h；再加入30ul的乙醇
胺涡旋混匀后放入振荡器中控制温度25℃且转速180rpm，振荡1h；取出放入离心机控制温
度4℃且转速15000rpm，离心30min，弃上清，再加入5ml含10%BSA的所述步骤S3的微球保存
液，再放入振荡器中控制温度25℃且转速180rpm，封闭1h；取出放入离心机控制温度4℃且
转速15000rpm，离心30min，弃上清，加入1ml所述步骤S3的微球保存液，即可得到NGAL抗体
标记荧光微球；

[0035] 步骤S8：mALB抗体偶联液配制，将3mg的NGAL标记抗体加入到所述步骤S5配制好的荧光微球溶液当中，在振荡器中控制温度25℃且转速180rpm，偶联2h；再加入30ul的乙醇胺
涡旋混匀后放入振荡器中控制温度25℃且转速180rpm，振荡1h；取出放入离心机控制温度4
℃且转速15000rpm，离心30min，弃上清，再加入5ml含10%BSA的所述步骤S3的微球保存液，
再放入振荡器中控制温度25℃且转速180rpm，封闭1h；取出放入离心机控制温度4℃且转速
15000rpm，离心30min，弃上清，加入1ml所述步骤S3的微球保存液，即可得到mALB抗体标记
荧光微球；

[0036] 步骤S9：将步骤S6、步骤S7与步骤S8所得到的各个微球溶液分别按体积比值2：4：3进行混合调配，并且搅拌均匀待用；

[0037] 步骤S10：玻璃纤维膜制备，将玻璃纤维膜裁成20mm*30mm的尺寸，浸泡于20mM的PB处理液中（0.5%casein+1.5%S21+1%S14+1%PVP‑30，PH：7.5），室温浸泡1h，然后放置在37℃
的烘箱中，干燥12小时；

[0038] 步骤S11：将步骤S10制备好的玻璃纤维膜放在喷金仪器上，然后将所述步骤S9混合调配的三种抗体量子点免疫荧光微球喷到玻璃纤维膜上，再放入37℃烘箱干燥2小时后，
即可制得成品玻璃纤维膜待后续步骤使用；

[0039] 步骤S12：将步骤S6、步骤S7与步骤S8所得到的各个微球溶液分别稀释至1mg/ml、2mg/ml和1.5mg/ml的浓度，再通过喷金仪器，用0.5ul/cm的喷量依次喷划在所述步骤S11制
备的玻璃纤维膜已划好分割线的不同区域，形成KIM‑1检测线、NGAL检测线和mALB检测线；
将兔抗鸡稀释液稀释至1mg/ml，再通过喷金仪器以1.5ul/cm的划量划在所述步骤S11制备
的玻璃纤维膜已划好分割线的区域形成质控线；

[0040] 步骤S13：将所述步骤S12处理后的玻璃纤维膜装入卡壳内即得量子点免疫荧光检测三联试剂盒。

[0041] 作为本发明的进一步改进，所述KIM‑1抗体标记荧光微球是通过EDC和NHS使KIM‑1抗体上N端氨基与荧光微球上的羧基通过化学键连接。

[0042] 作为本发明的进一步改进，所述NGAL抗体标记荧光微球是通过EDC和NHS使NGAL抗体上N端氨基与荧光微球上的羧基通过化学键连接。

[0043] 作为本发明的进一步改进，所述mALB抗体标记荧光微球是通过EDC和NHS使mALB抗体上N端氨基与荧光微球上的羧基通过化学键连接。

[0044] 作为本发明的进一步改进，所述卡壳的外部设置有干燥剂。

[0045] 作为本发明的进一步改进，所述KIM‑1检测线的线性检测范围为30‑2000pg/mL。

[0046] 作为本发明的进一步改进，所述NGAL检测线的线性检测范围为50‑5000ng/ml。

[0047] 作为本发明的进一步改进，所述mALB检测线的线性检测范围为5‑1000ug/ml。

[0048] 作为本发明的进一步改进，所述步骤S10中的PB处理液调配成分中包含有0.5%的casein、1.5%的S21、1%的S14和1%的PVP‑30，调配PH值为7.5。

[0049] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：本技术方案将NGAL抗体标记荧光微球、mALB抗体标记荧光微球和mALB抗体标记荧光微球同时设置在同一个玻璃纤维膜上，这样可
以实现一份检测剂同时检测KIM‑1、NGAL以及mALB三个项目，相较单个项目分开检测的样
本，这样可以达到用量少、简化检测步骤以及节约检测时间的技术效果；本技术方案相比其
它常规检测方法而言，实现了可检样本种类多，可检测的包含血清、血浆、全血和末梢血的
样本，且无需对样本进行前处理，可有效提高设备的适用范围；本技术方案KIM‑1的线性检
测范围为30‑2000pg/mL，NGAL的线性检测范围为50‑5000ng/ml，mALB的线性检测范围为5‑
1000ug/ml，这就使得检测具备检测灵敏度高以及检测范围大的技术效果；本技术方案的检
测基于双抗夹心免疫反应，荧光免疫层析属于微量分析方式，具有操作简便、灵敏度高以及
成本低等优点。

附图说明

[0050] 图1为本发明的检测试剂盒整体结构示意图。

[0051] 图2为本发明对KIM‑1检测数值与实际数值对比坐标示意图。

[0052] 图3为本发明对NAGL检测数值与实际数值对比坐标示意图。

[0053] 图4为本发明对mALB检测数值与实际数值对比坐标示意图。

[0054] 图中：1、玻璃纤维膜；2、KIM‑1检测线；3、NGAL检测线；4、mALB检测线；5、质控线；6、卡壳；7、加样孔。

具体实施方式

[0055] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于
本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他
实施例，都属于本发明保护的范围。

[0056] 结合附图1所示，本发明提供一种技术方案：一种基于量子点免疫荧光检测试剂盒，包括玻璃纤维膜1、KIM‑1检测线2、NGAL检测线3、mALB检测线4、质控线5、卡壳6和加样孔
7；玻璃纤维膜1的上表面从左到右依次设置有KIM‑1检测线2、NGAL检测线3、mALB检测线4和
质控线5；玻璃纤维膜1的外部套接设置有卡壳6；卡壳6的左侧上表面开设加工有加样孔7；
KIM‑1检测线2和NGAL检测线3、NGAL检测线3和mALB检测线4之间的距离为4至6毫米；mALB检
测线4和质控线5之间的距离为3至4毫米；在所述玻璃纤维膜1正上方的所述卡壳6上表面位
置开设加工有观测口。

[0057] 一种基于量子点免疫荧光检测试剂盒制备方法，具体包括如下步骤：

[0058] 步骤S1：首先进行活化液的配制，称量10.66g活化剂MES于烧杯中，加入纯化水1L，搅拌均匀后，用NaOH溶液调整pH至6.0，定温到4℃，保存备用；

[0059] 步骤S2：再进行偶联液的配制，称量1.066g活化剂MES于烧杯中，加入纯化水1L，搅拌混匀后，用NaOH溶液调整pH至6.5，定温到4℃，保存备用；

[0060] 步骤S3：然后进行微球保存液配制，称量0.718g硼酸、0.798g四硼酸钠、10g牛血清蛋白、5g月桂醇聚氧乙烯醚‑23、1g吐温‑20和50g的蔗糖于烧杯中，加入纯化水1L，搅拌混匀
后，用NaOH溶液调整pH至8.0，定温到4℃，保存备用；

[0061] 步骤S4：微球液配制，取1ml浓度为1umol/L，粒径为100nm，发射波长为614nm的量子点微球加入到步骤S1调配好的活化液中，活化液取5ml，搅拌混匀溶解；

[0062] 步骤S5：微球活化，在步骤S4配制好的微球溶解液中加入4mg EDC和40mg NHS，然后放入振荡器中控制温度25℃且转速180rpm，活化30min，活化好后取出放入离心机控制温
度4℃且转速15000rpm，离心30min，弃上清，再加入步骤S2配制好的偶联液重悬，得到活化
的荧光微球溶液；

[0063] 步骤S6：KIM‑1抗体偶联液配制，将2mg KIM‑1标记抗体加入到步骤S5配制好的荧光微球溶液当中，在振荡器中控制温度25℃且转速180rpm，偶联2h；再加入30ul的乙醇胺涡
旋混匀后放入振荡器中控制温度25℃且转速180rpm，振荡1h；取出放入离心机控制温度4℃
且转速15000rpm，离心30min，弃上清，再加入5ml含10%BSA的步骤S3的微球保存液，再放入
振荡器中控制温度25℃且转速180rpm，封闭1h；取出放入离心机控制温度4℃且转速
15000rpm，离心30min，弃上清，再加入1ml步骤S3的微球保存液，即可得到KIM‑1抗体标记荧
光微球；

[0064] 步骤S7：NGAL抗体偶联液配制，将1.5mg NGAL标记抗体加入到步骤S5配制好的荧光微球溶液当中，在振荡器中控制温度25℃且转速180rpm，偶联2h；再加入30ul的乙醇胺涡
旋混匀后放入振荡器中控制温度25℃且转速180rpm，振荡1h；取出放入离心机控制温度4℃
且转速15000rpm，离心30min，弃上清，再加入5ml含10%BSA的步骤S3的微球保存液，再放入
振荡器中控制温度25℃且转速180rpm，封闭1h；取出放入离心机控制温度4℃且转速
15000rpm，离心30min，弃上清，加入1ml步骤S3的微球保存液，即可得到NGAL抗体标记荧光
微球；

[0065] 步骤S8：mALB抗体偶联液配制，将3mg的NGAL标记抗体加入到步骤S5配制好的荧光微球溶液当中，在振荡器中控制温度25℃且转速180rpm，偶联2h；再加入30ul的乙醇胺涡旋
混匀后放入振荡器中控制温度25℃且转速180rpm，振荡1h；取出放入离心机控制温度4℃且
转速15000rpm，离心30min，弃上清，再加入5ml含10%BSA的步骤S3的微球保存液，再放入振
荡器中控制温度25℃且转速180rpm，封闭1h；取出放入离心机控制温度4℃且转速
15000rpm，离心30min，弃上清，加入1ml步骤S3的微球保存液，即可得到mALB抗体标记荧光
微球；

[0066] 步骤S9：将步骤S6、步骤S7与步骤S8所得到的各个微球溶液分别按体积比值2：4：3进行混合调配，并且搅拌均匀待用；

[0067] 步骤S10：玻璃纤维膜制备，将玻璃纤维膜裁成20mm*30mm的尺寸，浸泡于20mM的PB处理液中（0.5%casein+1.5%S21+1%S14+1%PVP‑30，PH：7.5），室温浸泡1h，然后放置在37℃
的烘箱中，干燥12小时；

[0068] 步骤S11：将步骤S10制备好的玻璃纤维膜放在喷金仪器上，然后将步骤S9混合调配的三种抗体量子点免疫荧光微球喷到玻璃纤维膜上，再放入37℃烘箱干燥2小时后，即可
制得成品玻璃纤维膜待后续步骤使用；

[0069] 步骤S12：将步骤S6、步骤S7与步骤S8所得到的各个微球溶液分别稀释至1mg/ml、2mg/ml和1.5mg/ml的浓度，再通过喷金仪器，用0.5ul/cm的喷量依次喷划在步骤S11制备的
玻璃纤维膜已划好分割线的不同区域，形成KIM‑1检测线2、NGAL检测线3和mALB检测线4；将
兔抗鸡稀释液稀释至1mg/ml，再通过喷金仪器以1.5ul/cm的划量划在步骤S11制备的玻璃
纤维膜已划好分割线的区域形成质控线5；

[0070] 步骤S13：将所述步骤S12处理后的玻璃纤维膜1装入卡壳6内即得量子点免疫荧光检测三联试剂盒。

[0071] KIM‑1抗体标记荧光微球是通过EDC和NHS使KIM‑1抗体上N端氨基与荧光微球上的羧基通过化学键连接；NGAL抗体标记荧光微球是通过EDC和NHS使NGAL抗体上N端氨基与荧
光微球上的羧基通过化学键连接；mALB抗体标记荧光微球是通过EDC和NHS使mALB抗体上N
端氨基与荧光微球上的羧基通过化学键连接；卡壳6的外部设置有干燥剂；KIM‑1检测线的
线性检测范围为30‑2000pg/mL；NGAL检测线的线性检测范围为50‑5000ng/ml；mALB检测线
的线性检测范围为5‑1000ug/ml；步骤S10中的PB处理液调配成分中包含有0.5%的casein、
1.5%的S21、1%的S14和1%的PVP‑30，调配PH值为7.5。

[0072] 关于KIM‑1/NGAL/mALB三联检试剂盒的性能评估试验分析：

[0073] 1、线性的评估采用新生牛血清作为稀释液，将KIM‑1标准品配制成浓度为30pg/ml、60pg/ml、100pg/ml、500pg/ml、1000pg/ml、1500pg/ml、2000pg/mL的标准品溶液，取80μL
加样进行检测，10min后将试纸条置于荧光免疫分析仪下，检测T线(检测线)和C线(质控线)
的荧光强度，根据T线与C线的荧光强度的比值分别绘制反映KIM‑1含量的标准曲线，每个浓
度重复检测3次，取平均值为检测浓度，用配制浓度与检测浓度做线性方程计算相关系数。
结果表明：线性的相关系数r＞0  .99，曲线方程y = 0.9805x ‑ 23.609，KIM‑1的线性检测
范围为30‑2000pg/mL，检测下限为30pg/mL。

[0074] 2、采用新生牛血清作为稀释液，将NGAL标准品配制成浓度为50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml、2000ng/ml、5000ng/ml的标准品溶液，取80μL加样进行检
测，10min后将试纸条置于荧光免疫分析仪下，检测T线(检测线)和C线(质控线)的荧光强
度，根据T线与C线的荧光强度的比值分别绘制反映NGAL含量的标准曲线，每个浓度重复检
测3次，取平均值为检测浓度，用配制浓度与检测浓度做线性方程计算相关系数。结果表明：
线性的相关系数r＞0  .99，曲线方 程y = 0.95720 x + 11.35679，NGAL的线性检测范围为
50‑5000ng/ml，检测下限为50ng/ml。

[0075]  3、采用新生牛血清作为稀释液，将mALB标准品配制成浓度为5ug/ml、10ug/ml、50ug/ml、100ug/ml、500ug/ml、1000ug/ml的标准品溶液，取80μL加样进行检测，10min后将
试纸条置于荧光免疫分析仪下，检测T线(检测线)和C线(质控线)的荧光强度，根据T线与C
线的荧光强度的比值分别绘制反映NGAL含量的标准曲线，每个浓度重复检测3次，取平均值
为检测浓度，用配制浓度与检测浓度做线性方程计算相关系数。结果表明：线性的相关系数
r＞0 .99，曲线方程y = 0.95989 x ‑ 0.85600，mALB的线性检测范围为5‑1000ug/ml，检测
下限为5ug/ml。

[0076] 4、重复性的评估将浓度为100pg/ml、500pg/ml的KIM‑1蛋白溶液，每个浓度重复检测10次，计算变异系数CV。结果表明：CV小于10％。将浓度为100ng/ml、500ng/ml的NGAL溶
液，每个浓度重复检测10次，计算变 异系数CV。结果表明：CV小于10％。 将浓度为100ug/
ml、500ug/ml的mALB白溶液，每个浓度重复检测10次，计算变异系数CV。结果表明：CV小于
10％。

[0077] 关于对本发明所述的三联试剂盒的检测准确性验证分析如下：

[0078] 取临床确诊的肾衰病人血样12例，进行患病情况的定量检测。取出试纸条平衡于室温，备用；取血样80ul，撕开试纸条外铝箔袋，在上样窗口内加入血样，等待10min后，将试
纸条插入免疫定量分析仪中，开始读数。具体检测结果见表1。如下表为肾衰病人的KIM‑1、
NAGL、mALB荧光试剂盒检测结果，并根据检测数据绘制对比坐标图，如附图2到附图4所示检
测数据与实际读数情况对比后可知本试剂盒所检测数据值与实际读数结果的波动差异较
小且差值均在可控合理范围内，对比数值如下表1所示。

[0079]

[0080] 以上所述仅为本发明的优选实例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例
所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神
和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。