山茱萸提取物在制备抑制海洋致病菌药物中的用途

摘要

本发明涉及一种山茱萸提取物的用途，属于中草药在抑制海洋致病菌中的应用技术领域。所述的用途为山茱萸提取物在制备抑制海洋致病菌的药物中的用途；所述的海洋致病菌为哈维氏弧菌、副溶血弧菌。本发明对抑菌效果最好的山茱萸醇提物进行进一步提取分离、检测分析，确定山茱萸中抑制海洋致病菌的有效成分为酚酸类化合物。

权利要求

1.山茱萸提取物的用途，其特征在于，所述的用途为山茱萸提取物在制备抑制海洋致病菌的药物中的用途；所述的海洋致病菌为哈维氏弧菌；

所述的山茱萸提取物是以山茱萸为原料，采用水提取或醇提取所得到的山茱萸提取物。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的山茱萸提取物的制备方法为：称取中药粉末，加入溶剂水或乙醇，在一定温度下超声提取10～90min，再在30～90℃下回流提取1～12h，抽滤，同法提取2～5次，收集滤液，浓缩即得。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的山茱萸提取物为从山茱萸中提取得到的主要成分为总酚酸类化合物的提取物。

4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的山茱萸提取物为从山茱萸中提取得到的主要成分为酚酸类化合物的提取物。

5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的山茱萸提取物的提取方法如下：

(1)提取：称取山茱萸粉末，加入乙醇，在一定温度下超声提取40min，再在60℃下回流提取2h，抽滤，同法提取2次，收集滤液，浓缩使生药的最终浓度为1g/mL；

(2)抑菌活性成分分离：对山茱萸醇提物进行分离，利用大孔吸附树脂，分别以水、30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇、90％乙醇洗脱，收集洗脱液，测定不同洗脱液对哈氏弧菌的抑菌活性；将山茱萸大孔吸附树脂的水洗部分使用甲醇进行溶解，并在硅胶板进行点样分离，室温下展开，将溶剂挥发后，得到3个组分，待检；

(3)抑菌活性成分化学定性检测：使用化学定性的方法对分离出的3个组分进行检测，用盐酸+镁粉、溴甲酚绿溶液及三氯化铁‑铁氰化钾溶液进行化学定性检测；分别确定组分1为黄酮类化合物，组分2和组分3为酚酸类化合物；确定酚酸类化合物为抑制海洋致病菌的有效成分。

说明书

山茱萸提取物在制备抑制海洋致病菌药物中的用途

技术领域

[0001] 本发明涉及中草药提取物技术领域，特别涉及山茱萸提取物在制备抑制海洋致病菌药物中的用途。

背景技术

[0002] 近年来，我国水产养殖业迅速发展，渔业产量大幅增长，稳居世界前列。但随着养殖规模与集约化程度的不断提高，养殖水域污染逐渐加重，水产致病菌引起的病害频发，严重阻碍了海水鱼类的养殖和发展。海洋致病菌主要包括副溶血弧菌、鳗弧菌、溶藻弧菌、哈氏弧菌等。这些致病菌不仅给海水养殖业造成巨大经济损失，而且威胁海洋自然生物资源。

[0003] 目前，对于海洋致病菌多采用化学药物防治的方法，主要包括青霉素，诺氟沙星，新诺明等，但长期单一使用一种药物会产生抗性，出现耐药性菌株。中草药具有成分丰富、不易产生耐药性、绿色环保及功效多样等优点，在病毒性、细菌性等各类鱼病防治中均拥有独到的作用及良好的效果。

[0004] 现有对中草药进行筛选来抑制海洋致病菌的研究，但是关于本发明的中草药在抑制海洋致病菌中的应用目前尚缺乏报道。因此，筛选中草药，寻找具有较好抑制海洋致病菌有效的中草药具有重要的意义。

发明内容

[0005] 本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种山茱萸提取物在制备抑制海洋致病菌药物中的用途。

[0006] 本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是山茱萸提取物的用途，所述的用途为山茱萸提取物在制备抑制海洋致病菌的药物中的用途；所述的海洋致病菌为哈维氏弧菌、副溶血弧菌。

[0007] 本发明优选的技术方案是：所述的山茱萸提取物是以山茱萸为原料，采用水提取、醇提取或石油醚提所得到的山茱萸提取物。

[0008] 本发明优选的技术方案是：所述的山茱萸提取物的制备方法为：称取中药粉末，加入溶剂水、乙醇或石油醚，在一定温度下超声提取10～90min，再在30～90℃下回流提取1～12h，抽滤，同法提取2～5次，收集滤液，浓缩即得。

[0009] 进一步地：所述的山茱萸提取物为从山茱萸中提取得到的主要成分 为总酚酸类化合物的提取物。

[0010] 进一步地：所述的山茱萸提取物为从山茱萸中提取得到的主要成分 为酚酸类化合物的提取物。

[0011] 本发明优选的技术方案是：所述的山茱萸提取物的提取方法如下：

[0012] (1)提取：称取山茱萸粉末，加入乙醇，在一定温度下超声提取40min，再在60℃下回流提取2h，抽滤，同法提取2次，收集滤液，浓缩使生药的最终浓度为1g/mL；

[0013] (2)抑菌活性成分分离：对山茱萸醇提物进行分离，利用大孔吸附树脂，分别以水、30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇、90％乙醇洗脱，收集洗脱液，测定不同洗脱液对哈氏弧菌的抑菌活性；将山茱萸大孔吸附树脂的水洗部分使用甲醇进行溶解，并在硅胶板进行点样分离，室温下展开，将溶剂挥发后，得到3个组分，待检；

[0014] (3)抑菌活性成分化学定性检测：使用化学定性的方法对分离出的3个组分进行检测，用盐酸+镁粉、溴甲酚绿溶液及三氯化铁‑铁氰化钾溶液进行化学定性检测；分别确定组分1为黄酮类化合物，组分2和组分3为酚酸类化合物；确定酚酸类化合物为抑制海洋致病菌的有效成分。

[0015] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明将山茱萸提取物用于制备抑制海洋致病菌的药物，山茱萸醇提物对哈维氏弧菌和副溶血弧菌均有较好的抑制作用，MIC值分别为31.25mg/mL和15.63mg/mL。

具体实施方式

[0016] 下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

[0017] 实施例1，具有抑制海洋致病菌作用的中草药筛选，确定山茱萸为抑制海洋致病菌活性

[0018] 1、抑制海洋致病菌中草药的筛选

[0019] 初步选出小蓟、紫苏、南酸枣、大叶桉叶、桂枝、茯苓、藿香、佩兰、山茱萸、白蔹、何首乌、制何首乌、沙棘或老鹤草14种中草药。称取中药粉末，加入溶剂(水、乙醇或石油醚)，超声提取40min，再在60℃下回流提取2h，抽滤，同法提取2次，收集滤液，浓缩使生药的最终浓度为1g/mL。

[0020] 选取哈维氏弧菌、副溶血弧菌为目标菌株，采用牛津杯法，在无菌环境下，向平板中倒入约20mL已灭菌的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，凝固后，加入200μL的菌悬液，涂布棒涂布均匀，静置10min。将牛津杯垂直均匀放置于培养基上，在杯中加入200μL的提取物样品，每个样品进行3次平行实验，移至37℃恒温培养箱培养18h后，用电子数显卡尺测定抑菌圈直径，结果取三次测量结果的平均值。抑菌圈直径大于20mm为极敏，15～19mm为高敏，10～14mm为中敏，小于10mm为低敏(无活性)。

[0021] 通过上述体外抑菌实验筛选出对哈维氏弧菌、副溶血弧菌抑制作用较强的中草药作为进一步实验对象。

[0022] 表1 14种中草药提取物对两种弧菌的抑菌效果

[0023]

[0024] 注：“+++”表示极敏、“++”表示高敏、“+”表示中敏、“‑”表示低敏(无活性)。

[0025] 实验结果如表1所示，大叶桉叶石油醚提取物、桂枝水提取及石油醚提取物、藿香石油醚提取物、佩兰醇提物及石油醚提取物、山茱萸水提物及醇提物、白蔹醇提物、何首乌醇提物、制何首乌醇提物均对副溶血弧菌有抑制作用；大叶桉叶醇提物、南酸枣醇提物、桂枝水提物、茯苓水提物、藿香三种提取物、佩兰醇提物及石油醚提取物、山茱萸水提物及醇提物、白蔹醇提物、何首乌醇提物、制何首乌醇提物均对哈维氏弧菌有抑制作用。其中，山茱萸水提物及醇提物对两种弧菌的抑菌圈直径均达到15mm以上；何首乌醇提物、制何首乌醇提物对哈维氏弧菌的抑菌圈也达到15mm以上。山茱萸醇提物抑制两种弧菌活性最强，抑菌圈直径最大，分别为(18.6±0.1)mm、(29.9±0.3) mm。

[0026] 根据上述实验结果，选择抑制哈维氏弧菌、副溶血弧菌活性最好的山茱萸醇提物作为进一步实验对象，测定其最小抑菌浓度(MIC)。

[0027] 2山茱萸醇提物对两种弧菌的MIC测定

[0028] 采用二倍稀释法测定山茱萸醇提物对两种弧菌的MIC，即将1g/mL的山茱萸醇提液分别稀释至生药浓度为500mg/mL、250mg/mL、125mg/mL、62.5 mg/mL、31.25mg/mL、15.63mg/mL、7.82mg/mL。于30℃200r/min摇床振荡恒温培养24h后观察结果，把无菌生长稀释度最大的药液浓度作为MIC 值。

[0029] 表2山茱萸醇提物对两种弧菌的最低抑菌浓度实验结果

[0030]

[0031]

[0032] 注：“‑”表示无活性。

[0033] 实验结果如表2所示，山茱萸醇提物对哈维氏弧菌和副溶血弧菌均有较好的抑制作用，MIC值分别为31.25mg/mL和15.63mg/mL。

[0034] 实施例2山茱萸抑制海洋致病菌有效成分的提取分离、检测分析。

[0035] 1抑菌活性成分提取

[0036] 称取山茱萸粉末，加入乙醇，在一定温度下超声提取40min，再在60℃下回流提取2h，抽滤，同法提取2次，收集滤液，浓缩使生药的最终浓度为1g/mL。

[0037] 2抑菌活性成分分离

[0038] 对山茱萸醇提物进行分离，利用大孔吸附树脂，分别以水、30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇、90％乙醇洗脱，收集洗脱液，测定不同洗脱液对哈维氏弧菌的抑菌活性。将山茱萸大孔吸附树脂的水洗部分使用甲醇进行溶解，并在硅胶板进行点样分离，室温下展开，将溶剂挥发后，得到3个组分。选取哈维氏弧菌为目标菌株，采用牛津杯法，在无菌环境下，向平板中倒入约20 mL已灭菌的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，凝固后，加入200μL的菌悬液，涂布棒涂布均匀，静置10min。将牛津杯垂直均匀放置于培养基上，分别在杯中加入200μL的组分
1、组分2、组分3溶液，每个样品进行3次平行实验，移至37℃恒温培养箱培养18h后，用电子数显卡尺测定抑菌圈直径，结果取三次测量结果的平均值。抑菌圈直径大于20mm为极敏，15～19mm为高敏，10～14mm为中敏，小于10mm为低敏(无活性)。

[0039] 表3山茱萸各组分抑制哈维氏弧菌结果

[0040]

[0041] 注：“+++”表示极敏、“++”表示高敏、“+”表示中敏、“‑”表示低敏(无活性)。

[0042] 通过薄层层析分离，得到组分1、组分2、组分3三个组分。将三个组分进行抑菌实验，实验结果如表3所示，组分1对哈维氏弧菌没有抑制活性，组分2与组分3对哈维氏弧菌均有较好的抑制作用。

[0043] 3抑菌活性成分化学定性检测

[0044] 使用化学定性的方法对分离出的3个组分进行检测，用盐酸+镁粉、溴甲酚绿溶液及三氯化铁‑铁氰化钾溶液进行化学定性检测。

[0045] 表4山茱萸抑制哈维氏弧菌活性成分的检测

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[0047] 实验结果如表4所示，组分1与盐酸+镁粉呈现阳性反应，表明其为黄酮类化合物；组分2、组分3与溴甲酚绿溶液呈现阳性反应，说明两者为羧酸类化合物；组分2、组分3又与三氯化铁‑铁氰化钾溶液呈现阳性反应，说明组分2和组分3是酚酸类化合物。

[0048] 通过上述分离、化学定性检测，初步确定山茱萸抑制海洋致病菌的有效成分为酚酸类化合物。

[0049] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。