肿瘤特异性刺激响应的羟烷基淀粉-阿霉素偶联物、其制备和应用

摘要

本发明属于载药系统领域，更具体地，涉及肿瘤特异性刺激响应的羟烷基淀粉‑阿霉素偶联物、其制备和应用。该偶联物为羟烷基淀粉与阿霉素通过连接臂连接得到，其中，所述偶联物具有如下的结构通式：其中，A表示羟烷基淀粉的分子主体结构，B表示阿霉素的分子主体结构，x与z各自独立地为NH或O，y为CH2或S；该偶联物中羟烷基淀粉通过其羟基修饰与连接臂偶联，阿霉素通过其氨基修饰与连接臂偶联。通过采用该类连接臂连接药物与载体，提高了前药型纳米药物递送系统的体内循环稳定性，以及病灶部位内药物的释放速率，从而降低了该前药型纳米药物递送系统的毒副作用，增强了其抗肿瘤活性。

权利要求

1.一种羟烷基淀粉‑连接臂‑阿霉素偶联物，其特征在于，该偶联物为羟烷基淀粉与阿霉素通过连接臂连接得到，其中，所述偶联物具有如下的结构通式：其中，A表示羟烷基淀粉的分子主体结构，B表示阿霉素的分子主体结构，所述A和B之间的分子结构即包含所述连接臂，该连接臂中x与z为O，y为S；该偶联物中羟烷基淀粉通过其羟基修饰与所述连接臂偶联，阿霉素通过其氨基修饰与所述连接臂偶联。

2.如权利要求1所述的偶联物，其特征在于，所述羟烷基淀粉为羟乙基淀粉、羟丙基淀粉或羟丁基淀粉。

3.如权利要求1所述的偶联物，其特征在于，所述羟烷基淀粉为羟乙基淀粉；所述羟乙基淀粉的平均分子量为40～480kDa，其羟乙基的摩尔取代度为0.4～0.5。

4.如权利要求1至3任一项所述的羟烷基淀粉‑连接臂‑阿霉素偶联物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)使用于形成所述连接臂的化合物修饰上易离去的基团，得到修饰有易离去基团的连接臂化合物；所述易离去的基团为对硝基苯磺酸、对甲苯磺酸、三氟磺酸、对硝基苯甲酸中的一种或多种；

(2)将阿霉素与步骤(1)获得的修饰有易离去基团的连接臂化合物进行共轭连接，使易离去基团离去，得到衍生后的阿霉素；

(3)将所述衍生后的阿霉素与羟烷基淀粉混合于有机溶剂中，并加入缚酸剂，得到所述羟烷基淀粉‑连接臂‑阿霉素偶联物；或先采用酰氯试剂活化羟烷基淀粉上的羟基，然后与所述衍生后的阿霉素反应，得到所述羟烷基淀粉‑连接臂‑阿霉素偶联物。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)将用于形成所述连接臂的化合物与酰氯试剂进行反应生成酯，使得该化合物修饰上易离去的基团。

6.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述酰氯试剂为光气、三光气、对甲苯磺酰氯、硝基苯基碳酰氯中的一种或多种；所述有机溶剂为二氯甲烷、水、N,N‑二甲基甲酰胺、二甲亚砜中的一种或多种；所述缚酸剂为4‑二甲氨基吡啶和/或N，N‑二异丙基乙胺。

7.一种肿瘤特异性刺激响应的前药型纳米药物，其特征在于，其为将权利要求1至3任一项所述的羟烷基淀粉‑连接臂‑阿霉素偶联物分散于超纯水中，经自组装得到。

8.如权利要求7所述的纳米药物，其特征在于，所述的纳米药物的粒径为20～300nm；其阿霉素接枝率低于或等于10％。

9.如权利要求7所述的纳米药物，其特征在于，所述的纳米药物的粒径为20～60nm；其阿霉素接枝率低于或等于5％。

10.如权利要求1至3任一项所述的羟烷基淀粉‑连接臂‑阿霉素偶联物或如权利要求7至9任一项所述的纳米药物在制备抗肿瘤药物中的应用。

11.如权利要求10所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为乳腺瘤、肝脏肿瘤、结肠瘤、卵巢瘤或黑色素瘤。

说明书

肿瘤特异性刺激响应的羟烷基淀粉‑阿霉素偶联物、其制备和

应用

技术领域

[0001] 本发明属于载药系统领域，更具体地，涉及肿瘤特异性刺激响应的羟烷基淀粉‑阿霉素偶联物、其制备和应用。

背景技术

[0002] 尽管近二十年来生物类药品迎来了蓬勃发展，但化学治疗仍然在多种癌症治疗中占据主导地位。如何基于现有的化疗药物，在保证其高效性的同时，增加其对肿瘤组织和肿瘤细胞的选择性，降低其毒副作用，一直是科学家们期望实现的目标。随着纳米技术的发展，越来越丰富的纳米药物递送系统得以涌现，其因可有效提高治疗效率，降低副作用而受到了人们的广泛关注。例如上市药物盐酸阿霉素脂质体，白蛋白紫杉醇等。

[0003] 与传统的载药型纳米制剂相比，基于前药策略的纳米药物递送系统是将药物以共价键缀合至载体，这样的优势在于很大程度上规避了药物的提前泄露，大大降低了药物在正常组织和细胞的蓄积，扩大了药物的治疗窗口；另外，利用具备肿瘤特异性刺激反应性能的连接臂缀合药物与载体，可进一步增加药物在病灶部位的特异性蓄积，提高药物的选择性。

[0004] 连接子(或称连接臂)是前药型纳米药物递送系统的重要组件，然而现有已报道连接子往往只具备单重响应能力，过度依赖单一响应条件会造成药物的释放量不足以及释放不及时，产生的后果就是疗效不佳，且因药物达不到有效杀伤浓度，易引发耐药；另外，连接子的断裂后，分为原药结构和非原药结构的释放，非原药的结构释放容易导致药物无法到达特定的亚细胞器，造成效能的大大降低。以上两者因素共同制约着前药型纳米药物的临床转化。

发明内容

[0005] 针对现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种肿瘤特异性刺激响应的羟烷基淀粉‑阿霉素偶联物、其制备和应用，通过设计多种刺激响应连接子，连接药物与载体，使纳米药物递送系统具备很好的病灶部位外循环稳定性，病灶部位内药物的快速的释放行为，旨在解决现有的前药型纳米药物递送系统依赖单一刺激响应，药物释放量不足，抑制肿瘤活性不佳等的技术问题。

[0006] 为实现上述目的，本发明提供了一种羟烷基淀粉‑连接臂‑阿霉素偶联物，该偶联物为羟烷基淀粉与阿霉素通过连接臂连接得到，其中，所述偶联物具有如下的结构通式：

[0007]

[0008] 其中，A表示羟烷基淀粉的分子主体结构，B表示阿霉素的分子主体结构，所述A和B之间的分子结构即包含所述连接臂，该连接臂中x与z各自独立地为NH或O，y为CH2或S；该偶联物中羟烷基淀粉通过其羟基修饰与所述连接臂偶联，阿霉素通过其氨基修饰与所述连接臂偶联。

[0009] 一些优选实施例中，所述羟烷基淀粉为羟乙基淀粉、羟丙基淀粉或羟丁基淀粉，优选为羟乙基淀粉。所述羟乙基淀粉的平均分子量优选为40～480kDa，其羟乙基的摩尔取代度为0.4～0.5。

[0010] 在本发明优选实施方式中，羟乙基淀粉的规格可以为480/0.7，200/0.5，200/0.6，130/0.4，70/0.5，优选130/0.4，其中130表示羟乙基淀粉的分子量，单位为kDa，0.4为羟乙基的摩尔取代度。

[0011] 优选地，式(一)中x为O，y为S，z为O。

[0012] 本发明一个优选实施方式中，该羟烷基淀粉偶联物‑连接臂‑药物为羟乙基淀粉‑碳酸酯‑二硫‑氨基酸酯‑阿霉素(HES‑CN‑SS‑CM‑DOX)，其结构式如式(二)所示：

[0013]

[0014] 本发明的另一个目的是提供一种羟烷基淀粉‑连接臂‑药物偶联物的制备方法，包括如下步骤：

[0015] (1)将用于形成所述连接臂的化合物修饰上易离去的基团，得到修饰有易离去基团的连接臂化合物；所述易离去的基团为对硝基苯磺酸、对甲苯磺酸、三氟磺酸、对硝基苯甲酸中的一种或多种；

[0016] (2)将阿霉素与步骤(1)获得的修饰有易离去基团的连接臂化合物进行共轭连接，使易离去基团离去，得到衍生后的阿霉素；

[0017] (3)将所述衍生后的阿霉素与羟烷基淀粉混合于有机溶剂中，并加入缚酸剂，得到所述羟烷基淀粉‑连接臂‑阿霉素偶联物；或先采用酰氯试剂活化羟烷基淀粉上的羟基，然后与所述衍生后的阿霉素反应，得到所述羟烷基淀粉‑连接臂‑阿霉素偶联物。

[0018] 在一些具体实施方式中，步骤(1)将用于形成所述连接臂的化合物与酰氯试剂进行反应生成酯，使得该化合物修饰上易离去的基团。

[0019] 在一些具体实施方式中，所述酰氯试剂为光气、三光气、对甲苯磺酰氯、硝基苯基碳酰氯中的一种或多种；所述有机溶剂为二氯甲烷、水、N,N‑二甲基甲酰胺、二甲亚砜中的一种或多种；所述缚酸剂为4‑二甲氨基吡啶和/或N，N‑二异丙基乙胺。

[0020] 在一些具体实施方式中，步骤(1)与步骤(2)的产物依次采用萃取、浓缩、拌样、柱层析、结晶方法分离与纯化；步骤(3)所述目标羟烷基淀粉‑连接臂‑药物偶联物通过透析的方法纯化。

[0021] 本发明的第三目的是提供所述的羟烷基淀粉‑连接臂‑阿霉素偶联物或所述的制备方法在制备抗肿瘤药物中的应用。

[0022] 本发明的第四目的是提供一种肿瘤特异性刺激响应的前药型纳米药物，其为将所述的羟烷基淀粉‑连接臂‑阿霉素偶联物分散于超纯水中，经自组装得到的纳米药物。将本发明提供的羟烷基淀粉‑连接臂‑阿霉素偶联物分散于超纯水中，该偶联物在超纯水中可以自组装成纳米簇，得到该偶联物对应的前药型纳米药物。其中，组装成的纳米药物的平均直径20～300nm,优选为20～60nm，其阿霉素接枝率低于或等于10％，优选低于或等于5％。实验发现阿霉素接枝率低于或等于5％，比如接枝率为3％左右时，其制备的纳米药物活性较接枝率为8％左右时的纳米药物略高。

[0023] 本发明优选实施例中提供的羟烷基淀粉‑连接臂‑阿霉素偶联物连接臂特殊的结构，其在肿瘤细胞溶酶体中，低的pH环境下，导致氨基酸酯和碳酸酯的水解，释放药物；同时该偶联物的二硫键使其具备氧化还原能力。本发明式(二)中采用碳酸酯‑二硫‑氨基酸酯(CN‑SS‑CM)作为连接臂，使得式(二)所示的偶联物具备三重刺激响应性，且经实验证明具备原药释放能力。

[0024] 本发明一些实施方式中，提出了如式(三)和式(四)所示的偶联物，式(三)中采用碳酸酯‑烷烃链‑氨基酸酯(CN‑CC‑CM)作为连接臂，该偶联物具有pH敏感性，经实验证实具备原药释放能力。本发明式(四)中采用氨基酸酯‑二硫‑脲基(CM‑SS‑UR)作为连接臂，该偶联物经实验证实具有氧化还原敏感性和pH敏感性，但不具备原药释放能力。

[0025] 本发明一些优选实施方式中，该偶联物能够应用的肿瘤为乳腺瘤、肝脏肿瘤、结肠瘤、卵巢瘤或黑色素瘤。

[0026] 总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：

[0027] (1)本发明提供的一类肿瘤特异性刺激响应的羟烷基淀粉‑阿霉素偶联物，其为低pH和/或氧化还原的单重或多重刺激响应的羟烷基淀粉‑药物偶联物。实验表明，本发明提供的三重刺激响应的羟烷基淀粉阿霉素偶联物具备更快的药物释放速率；另外，本发明提供的单重或多重肿瘤特异性刺激响应的羟烷基淀粉阿霉素偶联物之间的抗肿瘤活性有较大差异，但均具有相较于阿霉素同等或更优的抗肿瘤活性。

[0028] (2)本发明优选实施方式中提供的单重或多重刺激响应的羟烷基淀粉阿霉素偶联物为一种原药释放偶联物。实验表明，与非原药释放相比(释放结构为阿霉素‑巯基衍生物)，本发明提供的原药释放行为的羟烷基淀粉阿霉素偶联物的抗肿瘤活性显著提高。

[0029] (3)本发明通过4T1原位瘤小鼠模型，评价不同连接臂的羟乙基淀粉‑阿霉素偶联物的抑瘤能力。结果显示：同时具备低pH、氧化以及还原三重刺激响应的，且具有原药释放行为的羟乙基淀粉‑阿霉素偶联物，肿瘤生长速率最慢，抗肿瘤效果最强。

[0030] (4)本发明提供的带有不同连接臂的前药纳米药物递送系统显著减少了阿霉素的毒性。

[0031] (5)本发明提供的具有肿瘤特异性刺激响应的羟烷基淀粉‑连接臂‑阿霉素偶联物的合成路线具有原料廉价易得，反应条件温和，操作简单，室温即可反应等优点。

附图说明

[0032] 图1为本发明实施例1、实施例2、实施例3和对比例1中不同的刺激响应的羟乙基淀粉‑阿霉素偶联物合成路线图；

[0033] 图2为本发明实施例1、实施例2、实施例3和对比例1中不同的刺激响应的羟乙基淀粉‑阿霉素偶联物的核磁共振氢谱；

[0034] 图3为本发明实施例1、实施例2、实施例3和对比例1中不同的刺激响应的羟乙基淀粉‑阿霉素偶联物与阿霉素的紫外吸收图谱；

[0035] 图4为本发明实施例1、实施例2、实施例3和对比例1中不同的刺激响应的羟乙基淀粉‑阿霉素偶联物的体外药物释放速率；

[0036] 图5为本发明实施例1、实施例3和对比例1中不同的刺激响应的羟乙基淀粉‑阿霉素偶联物的体外药物释放产物质谱图；

[0037] 图6为本发明实施例1、实施例2、实施例3和对比例1中不同的刺激响应的羟乙基淀粉‑阿霉素偶联物与羟乙基淀粉的粒径分布图；

[0038] 图7为本发明实施例1、实施例2、实施例3和对比例1中不同的刺激响应的羟乙基淀粉‑阿霉素偶联物和阿霉素对4T1肿瘤细胞杀伤作用；

[0039] 图8为本发明实施例1、对比例、实施例3和对比例1中不同的刺激响应的羟乙基淀粉‑阿霉素偶联物和阿霉素对应的肿瘤体积‑时间曲线；

[0040] 图9为本发明实施例1、实施例2、实施例3和对比例1中不同的刺激响应的羟乙基淀粉‑阿霉素偶联物和阿霉素对应的各组剥离瘤重；

[0041] 图10为本发明实施例1、实施例2、实施例3和对比例1中不同的刺激响应的羟乙基淀粉‑阿霉素偶联物和阿霉素对应的肿瘤照片；

[0042] 图11为本发明实施例1、实施例2、实施例3和对比例1中不同的刺激响应的羟乙基淀粉‑阿霉素偶联物和阿霉素对应的小鼠体重‑时间曲线；

[0043] 图12为发明实施例1、实施例2、实施例3和对比例1中不同的刺激响应的羟乙基淀粉‑阿霉素偶联物和阿霉素对小鼠血细胞和血生化的影响。

具体实施方式

[0044] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

[0045] 鉴于现有的基于前药策略的纳米药物递送系统中往往只具备单重响应能力，过度依赖单一响应条件会造成药物的释放量不足以及释放不及时，产生的后果就是疗效不佳，且因药物达不到有效杀伤浓度，易引发耐药。本发明尝试对载药系统中连接子的结构进行改进，连接药物与载体，使得前药型纳米药物具备多重肿瘤特异响应性，比如低pH响应性、氧化响应性和还原响应性，使纳米药物递送系统具备很好的病灶部位外循环稳定性，并优化病灶部位内药物的快速释放行为，提高抗肿瘤活性。本发明通过对肿瘤微环境的考察，引入了四种不同的连接臂，以控制阿霉素的响应性释放速率以及是否具备原药释放行为，进一步通过体内外抗肿瘤活性评价实验，考察带有不同连接臂羟乙基淀粉‑连接臂‑阿霉素偶联物抗肿瘤活性差异。得出结论：不同连接子的羟乙基淀粉‑连接臂‑阿霉素偶联物均能降低阿霉素毒副作用，然而抗肿瘤活性差异较大。本发明具有肿瘤微环境三重刺激响应、且能释放阿霉素原药的羟乙基淀粉‑阿霉素偶联物制备的前药型纳米药物具备最优的抗肿瘤疗效，在4T1原位瘤小鼠模型上，其肿瘤抑制率达50.3％，详见如下实施例和对比例。

[0046] 实施例1

[0047] 具有pH敏感的氨基酸酯与碳酸酯，以及氧化还原敏感的二硫键的羟乙基淀粉‑阿霉素偶联物HES‑CN‑SS‑CM‑DOX(式(二))如下：

[0048]

[0049] 如图1内容a所示，合成步骤包括：

[0050] (1)碳酸2‑((2‑羟乙基)二硫烷基)乙酯(4‑硝基苯基)酯的合成(中间体1‑1)：将原料2,2'‑二硫代二基双(乙烷‑1‑醇)(1.5g，10mmol)加入反应瓶中，加入无水二氯甲烷20mL，冰浴，加入N，N‑二异丙基乙胺(1.3g，10mmol)，缓慢滴加溶于10ml无水二氯甲烷的4‑硝基苯基碳酰氯(1.0g，5mmol)，待滴加完毕，移除冰浴，室温搅拌5h，停止反应。反应后处理：50ml二氯甲烷萃取两遍后，用饱和食盐水洗涤，浓缩，硅胶拌样，无水硫酸钠干燥，浓缩，拌样，闪柱(P:E＝4:1→1:1),得油状物。

[0051] (2)羟乙基淀粉‑碳酸酯‑二硫‑4‑硝基苯基碳酸酯的合成(中间体1‑2)：将上一步所得中间体1‑1(159.5mg，0.5mmol)溶于5mL无水二氯甲烷，加入至反应瓶，加入N，N‑二异丙基乙胺(129.4mg，1mmol),冰浴，三光气(148mg，0.5mmol)溶于3mL无水二氯甲烷后缓慢滴加至反应瓶，搅拌10min后，浓缩除掉二氯甲烷，将上述反应体系溶于2mL二甲亚砜，滴加至溶有500mg的羟乙基淀粉二甲亚砜溶液中，室温搅拌过夜。反应后处理：异丙醇沉淀产物，洗涤2‑3遍，得中间体1‑2。

[0052] (3)羟乙基淀粉‑碳酸酯‑二硫‑碳酸酯‑阿霉素的合成(HES‑CN‑SS‑CN‑DOX)：于反应瓶中一次加入中间体1‑2(200mg)，N，N‑二异丙基乙胺(12.9mg，0.1mmol),盐酸阿霉素(0.015mmol，8.7mg)，室温搅拌过夜。反应后处理：异丙醇沉淀产物，离心，沉淀用3500Da透析袋透析3天后，冷冻干燥，得目标产物，其核磁共振氢谱如图2内容a所示。

[0053] 实施例2

[0054] 具有pH敏感的氨基酸酯与碳酸酯键的羟乙基淀粉‑阿霉素偶联物HES‑CN‑CC‑CM‑DOX(式(三))如下：

[0055]

[0056] 如图1内容b所示，其合成方法与HES‑CN‑SS‑CM‑DOX(式二)的合成方法相同，只是原料替换为不带二硫键的己二醇，制备得到的目标产物其核磁共振氢谱如图2内容b所示。

[0057] 实施例3

[0058] 具有氧化还原敏感的二硫键，pH敏感的碳酸酯键，但阿霉素采用稳定脲键与羟乙基淀粉偶联的的羟乙基淀粉‑阿霉素偶联物HES‑CM‑CC‑UR‑DOX(式(四))如下：

[0059]

[0060] 如图1内容c所示，其合成步骤包括：

[0061] (1)(2‑((2‑氨基乙基)二硫烷基)乙基)氨基甲酸叔丁酯的合成(中间体3‑1)：于反应瓶中依次加入胱胺二盐酸盐(3.0g，13.3mmol)，二碳酸二叔丁酯(2.9g，13.3mmol)，无水甲醇150mL，三乙胺(5.0g，50mmol)，室温搅拌，薄层层析监测反应。反应后处理：浓缩除去甲醇，依次加入60mL1M磷酸二氢钠，60mL乙醚沉淀产物，水层用约50mL1M氢氧化钠调至pH约等于9，乙酸乙酯萃取，浓缩，得油状产物。

[0062] (2)叔丁基(2‑((2‑((((4‑硝基苯氧基)羰基)氨基)乙基)二硫烷基)乙基)氨基甲酸酯的合成(中间体3‑2)：将上一步所得中间体3‑1(504mg，2mmol)加入反应瓶中，加入无水四氢呋喃10mL，冰浴，加入三乙胺(220mg，2.2mmol)，缓慢滴加溶于5ml无水二氯甲烷的4‑硝基苯基碳酰氯(400mg，2mmol)，待滴加完毕，移除冰浴，室温搅拌，薄层层析监测反应。反应后处理：乙酸乙酯萃取两遍后，用饱和食盐水洗涤，浓缩，硅胶拌样，无水硫酸钠干燥，浓缩，拌样，闪柱(石油醚:乙酸乙酯＝3:1)。

[0063] (3)阿霉素‑脲基‑二硫‑叔丁基氨基甲酸酯的合成(中间体3‑3)：于反应瓶中依次加入中间体3‑2(70.9mg,0.17mmol),盐酸阿霉素(100mg,0.17mmol)，三乙胺(40mg，0.4mmol)，2mL N,N‑二甲基甲酰胺,室温搅拌1h。反应后处理：二氯甲烷萃取两遍后，用饱和食盐水洗涤，浓缩，硅胶拌样，无水硫酸钠干燥，浓缩，拌样，闪柱(二氯甲烷:甲醇＝10:1)。

[0064] (4)阿霉素‑脲基‑二硫‑氨基甲酸酯的合成(中间体3‑4)：于反应瓶中依次加入中间体3‑3(20mg)，二氯甲烷5mL，三氟乙酸50μL，回流，薄层层析监测反应。反应后处理：二氯甲烷萃取两遍后，用饱和食盐水洗涤，浓缩，硅胶拌样，无水硫酸钠干燥，浓缩，拌样，闪柱(二氯甲烷:甲醇＝50:1→20:1)。

[0065] (5)羟乙基淀粉‑4‑硝基苯基碳酸酯的合成(中间体3‑5)：称取1g羟乙基淀粉溶于24mL水，加入2N氢氧化钠溶液2mL，冰浴，缓慢滴加溶于10mL二氯甲烷的4‑硝基苯基碳酰氯(1.0g，5mmol)溶液，滴加完毕后移除冰浴，室温搅拌2h，停止反应。反应后处理：异丙醇沉淀产物，洗涤2‑3遍，得中间体3‑5。

[0066] (6)羟乙基淀粉‑氨基甲酸酯‑二硫‑脲基‑阿霉素偶联物的合成(HES‑CM‑SS‑UR‑DOX)：向反应瓶中依次加入中间体3‑5(200mg)，4mL N,N‑二甲基甲酰胺,三乙胺(10mg，0.1mmol)，中间体3‑4(7.2mg，0.01mmol)，室温搅拌过夜。反应后处理：异丙醇沉淀产物，离心，沉淀用3500Da透析袋透析3天后，冷冻干燥，得目标产物，其核磁共振氢谱如图2内容c所示。

[0067] 对比例1

[0068] 只具有氧化还原敏感的二硫键，且阿霉素采用较稳定的酰胺键衍生的羟乙基淀粉‑阿霉素偶联物HES‑SS‑DOX(式(五))如下：

[0069]

[0070] 如图1内容d所示，其合成步骤包括：

[0071] (1)羟乙基淀粉‑二硫代二丙酸偶联物(中间体4‑1)的合成：将二硫代而丙酸(2.96g，14.08mmol)溶于20mLDMSO，加入二环己基碳二亚胺(580.0mg，2.82mmol)和4‑二甲氨基吡啶(172.4mg，1.41mmol)，室温搅拌30min后，加入预先干燥的羟乙基淀粉(1.0g)，室温搅拌24h后停止反应。反应后处理：异丙醇沉淀产物，洗涤2‑3遍，得中间体4‑1。

[0072] (2)羟乙基淀粉‑二硫‑阿霉素(HES‑SS‑DOX)的合成：将中间体4‑1(500mg)溶于10mLDMSO，依次加入1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐(84.2mg，0.44mmol)、N‑羟基琥珀酰亚胺(101.3mg，0.88mmol)、盐酸阿霉素(50mg,0.08mmol)和三乙胺(11.1mg，
0.1mmol)，室温搅拌24h后停止反应。异丙醇沉淀产物，离心，沉淀用3500Da透析袋透析3天后，冷冻干燥，得目标产物。

[0073] 对羟乙基淀粉‑阿霉素偶联物(式二、式三、式四和式五)采用核磁工作氢谱1
(HNMR)确证结构，数据如图2内容a、b、c和d所示，在化学位移7.0‑8.0范围内出现阿霉素的特征峰，且通过高效液相证明样品中无游离的阿霉素，该结果证明阿霉素已偶联至羟乙基淀粉。

[0074] 实施例1、实施例2、实施例3和对比例1制备得到的产物的紫外‑可见吸收图谱如图3所示，通过500nm处的吸收强度，定量各羟乙基淀粉‑阿霉素偶联物的接枝率，实施例1(式二)阿霉素接枝率为2.6％，实施例2(式三)阿霉素接枝率为2.5％，实施例3(式四)阿霉素接枝率为3.0％，对比例1(式五)阿霉素接枝率为3.2％。

[0075] 实施例2

[0076] 多重刺激响应的羟乙基淀粉‑阿霉素偶联物的体外多重响应性研究。

[0077] 分别采用pH等于7.4模拟体内循环环境，采用pH等于7.4+谷胱甘肽(缩写GSH)等于10mmol、pH等于7.4+双氧水(缩写H2O2)等于5mmol以及pH等于5.0三种不同释放液模拟肿瘤微环境。将1mL实施例1、实施例2、实施例3或对比例1的水溶液(1.0mg/mL)加入至透析袋(MWCO：3500Da)，密封，然后将其浸没在30mL不同释放液中，于摇床中震荡。在预定的时间点，取1mL释放液，再补充等体积的磷酸缓冲液。通过荧光光度计定量DOX及其衍生物的释放量(激发波长：485nm，发射波长：550nm)。

[0078] 图4表示不同连接子的前药型纳米药物释放动力学。32小时内，在pH等于7.4、氧化、还原以及pH等于5.0释放液体中，实施例1(式二)药物累计释放占比分别为20％，49％，44％，69％；实施例2(式三)药物累计释放占比分别为25％，29％，29％，64％；实施例3(式四)药物累计释放占比分别为20％，54％，58％，53％；对比例1(式五)药物累计释放占比分别为18％，85％，44％，21％。另外，实施例1(式二)模拟体内药物循环途径，分别处于体内血液循环环境(pH＝7.4)→肿瘤基质高氧化环境(H2O2＝5mM)→肿瘤细胞溶酶体(pH＝5.0)→肿瘤细胞胞质高GSH环境(GSH＝10mM)，16小时内累计释放量高达70％(内容e)。这些实验结果表明：实施例1(式二)与实施例3(式四)具备低pH、氧化以及还原三重刺激响应性，实施例
2(式三)只具备低pH响应能力，对比例1(式五)具备氧化以及还原刺激响应能力；另外，模拟体内循环条件下，实施例1(式二)16小时内累计释放量达到70％，表明多重刺激响应连接子的串联可促进药物的快速释放。

[0079] 实施例1、实施例3与对比例1目标产物对应的释放产物的结构确证采用液质联用(LC‑MS)检测，其结果如内容图5内容a、内容b和内容c所示，从图中可以得到结论：实施例1(式二)释放的为母体药物阿霉素，而实施例3(式四)和对比例1(式五)释放的为阿霉素的衍生物。

[0080] 实施例3

[0081] 多重刺激响应的羟乙基淀粉‑阿霉素偶联物的纳米药物的制备。

[0082] 称取实施例1中得到的羟乙基淀粉‑阿霉素偶联物的偶联物(10mg)溶解于4mL的双蒸水中，超声溶解，得到羟乙基淀粉接枝阿霉素的偶联物的纳米药物，其平均水合直径在43nm。如图6所示，实施例2、实施例3和对比例1纳米制剂的制备方法与实施例1一致，其平均水合直径分别为33nm、31nm、28nm。所得不同连接子的羟乙基淀粉接枝阿霉素的偶联物水合粒径相近，规避了由于粒径差异引起不同前药型纳米制剂的药代动力学差异，为后续的抗肿瘤活性差异的研究减少了变量。

[0083] 实施例4

[0084] 多重刺激响应的羟乙基淀粉‑阿霉素偶联物的体外抑制肿瘤细胞增殖活性评价。

[0085] 将4T1(小鼠乳腺癌细胞)接种于96孔板中，接种密度为5×103个细胞/孔，培养液体积为100μL，于37℃，5％CO2恒温培养箱中培养。12小时后，吸去培养基，分别加入100μL不同浓度游离阿霉素以及多重刺激响应的羟乙基淀粉‑阿霉素偶联物的纳米药物的培养液。孵育48小时。后采用氮唑溴盐(MTT)法，计算细胞存活率。

[0086] 图7表示不同浓度下阿霉素以及多重刺激响应的羟乙基淀粉‑阿霉素偶联物的纳米药物对4T1的抑制作用。活性比较：游离阿霉素>HES‑CN‑SS‑CM‑DOX(式二)>HES‑CM‑SS‑UR‑DOX(式四)>HES‑CN‑CC‑CM‑DOX(式三)>HES‑SS‑DOX(式五)。实施例1(式二)的对4T1的抑制能力强于实施例3(式四)，表明是否为原药释放对羟乙基淀粉‑阿霉素偶联物的抗肿瘤活性影响较大，具有原药型药物释放的实施例1(式二)具有更强的4T1抑制能力。另外，药物释放速率也对羟乙基淀粉‑阿霉素偶联物的活性有较大的影响，实施例2(式三)虽为原药释放，但只具备单一响应，其抗肿瘤活性低于具备多重响应但不具备原药释放的HES‑CM‑SS‑UR‑DOX(式四)。阿霉素的体外4T1抑制能力最强，可能是即使多重刺激响应的羟乙基淀粉‑阿霉素偶联物也不能在胞内完全释放阿霉素，造成其活性有一定的降低。

[0087] 实施例5

[0088] 多重刺激响应的羟乙基淀粉‑阿霉素偶联物的体内抗肿瘤活性评价与毒性评价。

[0089] 本实施例采用4T1原位瘤小鼠模型评价羟乙基淀粉‑阿霉素偶联物的体内抗肿瘤活性。实验流程：选取6周龄雌性BALB/c小鼠，经麻醉后，在其右侧的第四乳腺脂肪垫下面种5 3
植5×10个细胞。当瘤体积生长至60～80mm时，将小鼠随机分为5组，每组各6只，并记为第0天。在第0，3，6，9天分别经尾静脉注射给予生理盐水、游离阿霉素和羟乙基淀粉‑阿霉素纳米药物，给药剂量为4mg/kg。

[0090] 图8至图11为实施例1、实施例2、实施例3和对比例1制备的羟乙基淀粉接枝阿霉素的偶联物的纳米药物和阿霉素盐酸盐及生理盐水组肿瘤体积‑时间曲线(图8)、肿瘤剥离后体重(图9)、剥离后肿瘤照片(图10)以及各组小鼠平均体重‑时间曲线(图11)。阿霉素盐酸盐和羟乙基淀粉接枝阿霉素的偶联物的纳米药物与生理盐水组相比，可以显著抑制肿瘤的生长。其中，多重响应、且具有原药释放行为的实施例1(式二)制备成的前药型纳米药物具有最佳的抗肿瘤疗效，在4T1原位瘤小鼠模型上，其肿瘤抑制率达50.3％。

[0091] 图12为各组小鼠的血生化与血细胞检测，其中图12内容a、内容b、内容c、内容d、内容e、内容f和内容g分别对应尿素氮、肌酸磷酸激酶、谷草转氨酶、谷丙转氨酶、白细胞、红细胞、血小板。可以看出，游离阿霉素组会显著升高肌酸磷酸激酶的浓度，而各羟乙基淀粉‑阿霉素偶联物组肌酸磷酸激酶浓度未升高，表明市售游离阿霉素具有一定的心脏毒性(图12内容b)。另外，游离阿霉素可显著降低小鼠体内白细胞数量，产生严重的骨髓抑制毒性(图12内容e)。综上所述，阿霉素通过不同刺激响应连接子缀合至羟乙基淀粉后，可显著降低阿霉素的毒副作用。

[0092] 本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。