一种CRISPR/Cas9特异性敲除大豆SOC1基因的方法及其应用

摘要

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种CRISPR/Cas9特异性敲除大豆SOC1基因的方法及其应用。通过构建得到同时靶向编辑大豆中同源基因SOC1a和SOC1b编码区的CRISPR/Cas9敲除载体，将该敲除载体利用农杆菌介导法进行稳定遗传转化，获得纯合soc1a1b双突变体大豆植株。与对照大豆植株相比，soc1a1b双突变体植株表现出明显的开花期和成熟期延迟、节数增加的表型，显著提高了大豆产量和品种的区域适应性。

权利要求

1.CRISPR/Cas9特异性敲除大豆SOC1基因的方法在创制高产大豆种质资源中的应用，其特征在于，CRISPR/Cas9特异性敲除大豆SOC1基因的方法包括如下步骤：利用CRISPR/Cas9系统对大豆中同源基因SOC1a和SOC1b进行基因编辑，获得同时靶向编辑SOC1a和SOC1b编码区的CRISPR/Cas9敲除载体；

所述CRISPR/Cas9系统对大豆中同源基因SOC1a和SOC1b进行靶向编辑时涉及如下四个编辑靶点：靶点1：位于SOC1b基因第二外显子上；所述靶点1的接头引物序列如SEQ ID. NO.1和SEQ ID. NO.2所示；

靶点2：位于SOC1a基因第二外显子上；所述靶点2的接头引物序列如SEQ ID. NO.3和SEQ ID. NO.4所示；

靶点3：位于SOC1b基因第一外显子上；所述靶点3的接头引物序列如SEQ ID. NO.5和SEQ ID. NO.6所示；

靶点4：位于SOC1a基因、SOC1b基因第三外显子上；所述靶点4的接头引物序列如SEQ ID. NO.7和SEQ ID. NO.8所示；

通过将所述靶点1、靶点2、靶点3、靶点4的接头引物分别组装到相对应的四个sgRNA载体上，所述四个sgRNA载体分别由拟南芥U3d、U3b、U6‑1和U6‑29启动子串联启动后与pYLCRISPR/Cas9‑DB载体连接，创制获得pYLCRISPR/Cas9‑SOC1s‑sgRNA敲除载体。

2.一种培育高产大豆品种的方法，其特征在于，将权利要求1所述pYLCRISPR/Cas9‑SOC1s‑sgRNA敲除载体转化农杆菌，并侵染大豆子叶节进行稳定遗传转化，获得纯合soc1a1b双突变体大豆植株。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述纯合soc1a1b双突变体大豆植株中SOC1a突变基因和SOC1b突变基因的编码区相对于原始基因均有1bp缺失，导致SOC1a突变基因和SOC1b突变基因编码蛋白质的翻译被提前终止。

4.用于鉴定含有权利要求3所述SOC1a突变基因和SOC1b突变基因材料的分子标记物，其特征在于，所述分子标记物为分别基于SOC1a突变基因和SOC1b突变基因构建的两个dCAPs标记，用于鉴定SOC1b突变基因的dCAPs标记的引物如SEQ ID. NO.35～SEQ ID. NO.37所示；用于鉴定SOC1a突变基因的dCAPs标记的引物如SEQ ID. NO.38～SEQ ID. NO.41所示。

说明书

一种CRISPR/Cas9特异性敲除大豆SOC1基因的方法及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物工程领域，涉及植物基因工程领域，具体涉及一种CRISPR/Cas9特异性敲除大豆SOC1基因的方法及其应用。

背景技术

[0002] 大豆[Glycine max(L.)Merr.]为人类提供植物蛋白和植物油，提供工业原料，与人类生活紧密相关。大约5000多年前栽培大豆在中国黄淮海地区被驯化，素有“豆中之王”的美誉。大豆是典型的短日照双子叶植物，对光周期极其敏感。开花时间决定了大豆的地域适应性、播种时间和收获时间。SOC1在拟南芥中是一个重要的开花诱导基因，普遍存在于多种被子植物中。尽管SOC1‑like基因在拟南芥及其他物种中调控开花及植物发育的功能和分子调控途径已有初步研究，但其在大豆中的具体功能尚不明确。

发明内容

[0003] 本发明旨在探究大豆SOC1基因是否参与调控开花以及其他功能，本发明提供利用CRISPR/Cas9特异性敲除大豆SOC1基因的方法及其应用，具体利用CRISPR/Cas9系统对大豆同源基因SOC1a(Glyma.18G224500)和SOC1b(Glyma.09G266200)进行靶向编辑并成功构建大豆soc1a1b纯合双突变体，并对大豆SOC1a和SOC1b调控大豆开花和提高产量方面的功能进行验证，本发明对于通过CRISPR/Cas9技术创制种质资源改变大豆品种的区域适应性和提高大豆产量具有重要的意义。

[0004] 基于上述目的，本发明采用的技术方案如下：

[0005] 第一方面，本发明提供一种CRISPR/Cas9特异性敲除大豆SOC1基因的方法，包括如下步骤：

[0006] 利用CRISPR/Cas9系统对大豆中同源基因SOC1a和SOC1b进行基因编辑，获得同时靶向编辑SOC1a和SOC1b编码区的CRISPR/Cas9敲除载体；

[0007] CRISPR/Cas9系统对大豆中同源基因SOC1a和SOC1b进行靶向编辑时涉及如下四个编辑靶点：

[0008] 靶点1：位于SOC1b基因第二外显子上；所述靶点1的接头引物序列如SEQ ID.NO.1和SEQ ID.NO.2所示；

[0009] 靶点2：位于SOC1a基因第二外显子上；所述靶点2的接头引物序列如SEQ ID.NO.3和SEQ ID.NO.4所示；

[0010] 靶点3：位于SOC1b基因第一外显子上；所述靶点3的接头引物序列如SEQ ID.NO.5和SEQ ID.NO.6所示；

[0011] 靶点4：位于SOC1a基因、SOC1b基因第三外显子上；所述靶点4的接头引物序列如SEQ ID.NO.7和SEQ ID.NO.8所示。

[0012] 进一步地，将靶点1、靶点2、靶点3、靶点4的接头引物分别组装到相对应的四个sgRNA载体上，分别由拟南芥U3d、U3b、U6‑1和U6‑29启动子串联启动后与pYLCRISPR/Cas9‑DB载体连接，构建得到pYLCRISPR/Cas9‑SOC1s‑sgRNA敲除载体。

[0013] 第二方面，本发明提供上述CRISPR/Cas9特异性敲除大豆SOC1基因的方法在创制高产大豆种质资源中的应用。

[0014] 第三方面，本发明提供一种培育高产大豆的方法，将上述CRISPR/Cas9敲除载体转化农杆菌，并侵染大豆子叶节进行稳定遗传转化，获得纯合soc1a1b双突变体大豆植株。

[0015] 进一步地，在纯合soc1a1b双突变体大豆植株中，SOC1a突变基因和SOC1b突变基因的编码区相对于原始基因均有1bp缺失，导致SOC1a突变基因和SOC1b突变基因编码蛋白质的翻译被提前终止。

[0016] 与对照大豆植株相比，纯合soc1a1b双突变体大豆植株表现出明显的开花期和成熟期延迟、节数增加的表型，显著提高了大豆产量和品种的区域适应性。

[0017] 第四方面，本发明提供一种用于鉴定含有上述SOC1a突变基因、SOC1b突变基因材料的分子标记物，所述分子标记物为分别基于SOC1a突变基因和SOC1b突变基因构建的两个dCAPs标记，两个dCAPs标记的引物如SEQ ID.NO.35～SEQ ID.NO.41所示。

[0018] 通过构建用于鉴定SOC1a突变基因、SOC1b突变基因的分子标记物，在大豆分子设计育种工作中具有重要意义。

[0019] 与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

[0020] (1)本发明通过将靶向编辑SOC1a和SOC1b编码区的CRISPR/Cas9敲除载体经农杆菌介导法进行遗传转化后获得转基因大豆植株(纯合soc1a1b双突变体大豆植株)。该转基因植株的SOC1a和SOC1b基因被编辑，导致SOC1a和SOC1b蛋白翻译提前终止，不能行使正常功能。相较于大豆对照植株，转基因植株具有明显的开花期和成熟期延迟、节数增加的表型，并且单株产量提高了66％以上。

[0021] (2)本发明根据SOC1a突变基因和SOC1b突变基因编辑位点，分别设计了用限制性内切酶PstⅠ进行酶切的dCAPs分子标记，能够用于区分SOC1a和SOC1b突变型植株和正常型植株，在分子育种研究中具有广阔的应用前景。

[0022] 综上所述，本发明基于CRISPR/Cas9基因编辑系统构建纯合soc1a1b双突变体大豆植株的基因工程方法，在大豆育种中具有重要作用，所构建的纯合soc1a1b双突变体大豆植株，具有延迟转基因大豆开花、成熟时间，增加主茎节数，提高产量的效果；并且基于SOC1a突变基因和SOC1b突变基因编辑位点构建用于基因分型检测的dCAPs分子标记，在大豆分子育种研究中具有重要应用前景。

附图说明

[0023] 图1为pYLCRISPR/Cas9‑SOC1s‑sgRNA敲除载体和SOC1a、SOC1b敲除靶点接头引物序列示意图；

[0024] 图2为CRISPR/Cas9转基因大豆植株的鉴定结果图；

[0025] 图3为SOC1a和SOC1b敲除靶点位置及编辑方式测序图；

[0026] 图4为soc1a1b纯合双突变体大豆植株和对照大豆植株的表型图；

[0027] 图5为顶端分生组织中，开花相关基因在soc1a1b双突变体植株和对照植株中的表达图；

[0028] 图6为dCAPs特异性分子标记应用示意图。

具体实施方式

[0029] 为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。本领域技术人员应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

[0030] 实施例中所用的敲除载体(sgRNA和pLYCRISPR/Cas9)由华南农业大学刘耀光教授实验室提供(均在“A robust CRISPR/Cas9 System for Convenient,High‑Efficiency Multiplex Genome Editing in Monocot and Dicot Plants”中公开)；所用实验试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到；未详细描述的实验过程和方法是本领域中公知的常规方法；引物合成和测序由北京擎科生物技术有限公司完成。

[0031] 实施例1 CRISPR/Cas9载体设计与构建

[0032] 本实施例基于CRISPR/Cas9基因编辑系统对大豆同源基因SOC1a和SOC1b进行编辑，创制获得同时靶向编辑SOC1a和SOC1b编码区的CRISPR/Cas9敲除载体，具体创制方法如下：

[0033] 1、靶点引物设计

[0034] 根据NCBI(National  center  for  biotechnology,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和Phytozome(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/
portal.html)两个数据库提供的SOC1a(Glyma.18G224500)和SOC1b(Glyma.09G266200)基因序列，利用CRISPR direct网站(http://crispr.dbcls.jp/)设计靶位点接头引物。点击Specificity check‑Soybean(Glycine max)genome,v2.0(Nov，2015)‑design，选择合适的PAM sequence(NGG)前20bp作为靶点引物，分别包括位于SOC1b的1/3/4靶点和位于SOC1a的
2/4靶点。

[0035] 其中靶点1位于SOC1b基因的第二外显子上，靶点1的接头引物序列如SEQ ID.NO.1和SEQ ID.NO.2所示。

[0036] 靶点2位于SOC1a的第二外显子上，靶点2的接头引物序列如SEQ ID.NO.3和SEQ ID.NO.4所示。

[0037] 靶点3存在于SOC1b的第一个外显子上，靶点3的接头引物序列如SEQ ID.NO.5和SEQ ID.NO.6所示。

[0038] 靶点4位于SOC1a和SOC1b的第三外显子，靶点4的接头引物序列如SEQ ID.NO.7和SEQ ID.NO.8所示。

[0039] 2、将四个靶点组装到四个不同的sgRNA载体上

[0040] 具体步骤如下：

[0041] 1)sgRNA重组载体构建

[0042] 分别将四个靶点的正向引物序列和反向互补引物序列退火成双链引物二聚体，通过边切边连分别将引物二聚体连接到用BsaI酶切后对应的sgRNA载体上(At3d，At3b，AtU6‑1，AtU‑29)。

[0043] 反应体系为：sgRNA载体(20ng)2μL、10×Cutsmart 1μL、引物二聚体0.5μL、T4 Buffer 1μL、T4连接酶0.1μL、BsaI 0.5μL、ddH2O 4.9μL。反应程序为：37℃5分钟，20℃5分钟，5个循环。反应后放入冰盒。

[0044] 2)sgRNA载体PCR扩增及回收

[0045] 分别在sgRNA载体两端添加顺序引物，使四个sgRNA载体能够通过引物同源重组按一定的顺序连接。每个sgRNA载体进行两轮PCR扩增。

[0046] 反应体系为：上一步连接产物1μL，引物组合(顺序引物组合)0.4μL、10×KOD Buffer 1μL、dNTPs 1μL、MgSO4 0.6g、KOD 0.2μL、ddH2O 5.8μL。反应程序为：95℃2分钟，98℃10秒，68℃15秒，68℃10秒，25个循环，15℃+∞。

[0047] 对上述四个sgRNA载体琼脂糖凝胶电泳纯化回收(TransGen BiotechQuick Gel Extraction Kit)，回收时四个sgRNA载体混合回收。

[0048] 3、将回收的四个sgRNA载体混合物与pYLCRISPR/Cas9‑DB载体连接，构建CRISPR/Cas9敲除载体。

[0049] 将四个sgRNA载体混合物与pYLCRISPR/Cas9‑DB载体连接的反应体系为：4个sgRNA载体(60‑70ng)1μL、Cas9(100ng)1.5μL、10×Cutsmart 1.5μL、BsaI 1μL、ddH2O 10μL。37℃反应10分钟后，加入T4连接酶0.1μL、T4 Buffer 1μL，充分混匀。反应程序为：37℃，2min，10℃，3min，20℃，5min，15个循环；37℃，2min；15℃+∞。

[0050] 其中，CRISPR载体编码Cas9蛋白由CaMV35S启动子启动，四个sgRNA载体分别由拟南芥U3d、U3b、U6‑1和U6‑29启动子串联启动，如图1所示，将连接好的载体转化大肠杆菌DH5α感受态细胞并进行测序，获得具有四个串联靶点的CRISPR/Cas9敲除载体，即pYLCRISPR/Cas9‑SOC1s‑sgRNA重组载体。

[0051] 实施例2 CRISPR/Cas9敲除载体遗传转化大豆及转基因大豆的鉴定

[0052] 1、CRISPR/Cas9敲除载体稳定遗传转化大豆

[0053] 1)毛根转化及靶点编辑效果检测

[0054] 将实施例1构建的含有四个串联靶点的CRISPR/Cas9敲除载体，转化农杆菌K599，28℃培养36h后，挑选阳性克隆侵染Willimas82大豆子叶诱导发根。取25℃光照培养生长15天后的毛根，进行DNA提取(CWBIO DNA Kit)。利用Cas9特异引物(SEQ ID.NO.9和SEQ ID.NO.10)检测阳性毛根，并用靶点编辑检测引物(SEQ ID.NO.11～SEQ ID NO.20)对阳性毛根进行PCR扩增和测序，统计靶点的编辑效率。测序结果显示，从靶点处往后都是双峰，说明设计的靶点可有效编辑SOC1基因编码区，载体靶点的编辑效率为53％。

[0055] 2)稳定转化大豆Willimas82

[0056] 将验证后的CRISPR/Cas9敲除载体转化农杆菌EHA101，28℃培养36h后，挑选阳性克隆。以大豆Willimas82材料为受体，筛选抗性为草丁膦(Basta)，进行农杆菌侵染子叶节法稳定转化大豆。具体过程为：将氯气灭菌后的大豆种子播种于培养基中，28℃光照培养3天后取子叶节作为外植体进行农杆菌侵染，经历共培养，幼芽诱导、幼芽伸长、生根培养等过程，获得T0代稳定转化植株。

[0057] 2、soc1a1b纯合双突变体的筛选和鉴定

[0058] 通过如下方式筛选转基因阳性植株：

[0059] 1)T0代转基因植株Basta抗感检测

[0060] CRISPR/Cas9载体携带Bar基因，可利用植株有无Basta的抗性，初步筛选阳性植株。将浓度为100mg/L的Basta溶液涂抹于再生大豆植株顶端幼嫩叶片上查看其抗性。5天后观察植株叶片的颜色，结果如图2所示，假阳性植株叶片萎蔫变黄(图2A)，而转基因阳性植株叶片保持绿色(图2B)。

[0061] 2)PCR检测

[0062] 取转基因大豆新鲜叶片，提取基因组DNA。利用Cas9特异引物扩增检测，序列如SEQ ID.NO.9和SEQ ID.NO.10所示。

[0063] 以pYLCRISPR/Cas9‑SOC1s‑sgRNA重组质粒为阳性对照(P)，以H2O为阴性对照(‑)，并以Willimas82植株作为阴性对照(WT)，对14种不同的转基因株系进行PCR检测，检测结果如图2C所示，在转基因植株1、2、5、6、7、9、11、14中检测到Cas9蛋白，表明转基因植株1、2、5、6、7、9、11、14为转基因阳性植株，而转基因植株3、4、8、10、12、13为假阳性植株。

[0064] 3)基因编辑方式检测

[0065] 将上述阳性T0代植株收获种子之后，进行T1代繁种，提取T1代植株幼嫩叶片DNA，利用Cas9特异引物(SEQ ID.NO.9和SEQ ID.NO.10)进行PCR扩增鉴定Cas9骨架，利用编辑检测引物(SEQ ID.NO.11～SEQ ID NO.20)进行PCR扩增并将产物送测序检测靶点编辑情况。结果显示，已获得无cas9骨架的大豆soc1a1b纯合双突变体，SOC1a基因和SOC1b基因的编码区均有1bp缺失(图3)。

[0066] 图3A为SOC1a和SOC1b基因结构和用于基因编辑的4个靶点分布图，其中靶点1位于SOC1b基因的第二外显子上，靶点1的接头引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。靶点2位于SOC1a的第二外显子上，靶点2的接头引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。靶点3存在于SOC1b的第一个外显子上，靶点3的接头引物序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。靶点4位于SOC1a和SOC1b的第三外显子，靶点4的接头引物序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。图3B中下划线的核苷酸表示目标靶点，红色框表示Cas9核酸内切酶特异识别的PAM序列，红色竖线指示基因编辑位点，W82为基因参考序列，Mutant为基因编辑序列，彩色序列和峰图是测序结果展示。左侧是位于SOC1b基因上靶点1示意图，右侧是位于SOC1a基因上靶点2示意图。图3C为SOC1a和SOC1b突变体中突变区域DNA序列和氨基酸序列的变化(红色标注)；下划线的核苷酸表示目标靶点，红色方框表示PAM；星号表示蛋白翻译终止；Bar＝1500bp。

[0067] 实施例3soc1a1b双突变体植株的表型鉴定

[0068] 将纯合soc1a1b双突变体植株及对照Willimas82(W82)植株种植在中国科学院东北地理与农业生态研究所盆栽场，条件为自然长日照(光照16小时/黑暗8小时)和人工设置短日照(光照12小时/黑暗12小时)。观察它们的开花期和成熟期，成熟时统计节数和单株产量。突变体植株及W82植株的花期、成熟期、节数和单株产量如图4所示。

[0069] 其中，图4A为2019年短日照条件下，W82和soc1a1b双突变体植株的花期、成熟期、节数和单株产量的表型；图4B为2020年短日照条件下，W82和soc1a1b双突变体植株的花期、成熟期、节数和单株产量的表型；图4C为2019年长日照条件下，W82和soc1a1b双突变体植株的花期、成熟期和节数的表型；图4D为2020年长日照条件下，W82和soc1a1b双突变体植株的花期、成熟期和节数的表型。

[0070] 2019年和2020年突变体植株在长短日照条件下与W82相比，均表现出明显的开花期和成熟期延迟及节数增加的表型。短日照条件下，突变体植株单株产量分别较W82增加了66％(图4A)和76％(图4B)。表明SOC1a和SOC1b基因突变后具有延长大豆开花期和成熟期的功能，并具有提高大豆产量的潜力。

[0071] 实施例4顶端分生组织中开花相关基因的表达分析

[0072] 将突变体植株soc1a1b及W82种植于人工培养箱内，人工培养箱分别设定为长日照(光照16小时/黑暗8小时)和短日照(光照12小时/黑暗12小时)，温度25℃，湿度为70％。出苗后20天，取植株顶端分生组织，一个样品三次重复。采用植物总RNA提取试剂盒(CWBIO RNA Kit)进行总RNA提取。以获得的总RNA为模板，按照Takara公司提供的反转录试剂盒的说明书进行反转录，合成cDNA第一链，进行qRT‑PCR反应。qRT‑PCR反应在Roche LightCycler 480系统上进行，以GmTubulin(Glyma.05G157300)基因为内参。

[0073] qRT‑PCR反应体系为10μL、cDNA模板2μL、正向引物0.2μL、反向引物0.2μL、TBTMPremix Ex Taq  5μL、ddH2O 2.6μL。反应程序为预变性95℃10min；变性95℃5s，退火/延伸60℃30s，40个循环；95℃15s。涉及到基因的特异性引物如SEQ ID NO.21～SEQ ID NO.34所示。

[0074] 结果如图5所示，其中，图5A为短日照条件下，开花相关基因在soc1a1b双突变体植株和对照W82植株中的表达分析；图5B为长日照条件下，开花相关基因在soc1a1b双突变体和W82植株中的表达分析，图中**表示P<0.01水平下极显著差异。图5结果显示，无论在长日照条件下还是短日照条件下，突变体植株中SOC1a、SOC1b、AP1a、LFY1和LFY2的表达量显著降低；而Dt1的表达量显著增加；推测SOC1a和SOC1b在顶端分生组织中通过上调AP1和LFY，下调Dt1的表达促进开花；而且可能通过下调Dt1的表达调控主茎节数。

[0075] 实施例5 soc1a1b双突变体的检测标记物在育种中的应用

[0076] 设计两个dCAPs标记鉴定soc1a1b突变等位基因(图6)。由于两个SOC1基因序列高度相似，进行两轮PCR扩增。其中，涉及到的引物如SEQ ID NO.35～41所示，含有突变等位基因片段的SOC1a和SOC1b的产物可以用限制性内切酶Pst Ⅰ进行酶切，并可用于区分soc1a1b双突变体植株和W82植株(图6)。结果证明SOC1的两个dCAPs标记可用于soc1a1b双突变体的基因分型，并在分子育种研究中具有应用前景。

[0077] 最后所应当说明的是，以上所述是本发明的较佳实施方式，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。