一种检测绵羊FASN基因单核苷酸多态性的方法及其在肉质性状早期筛选中的应用

摘要

本发明公开了一种检测绵羊FASN基因单核苷酸多态性的方法及其在肉质性状早期筛选中的应用，包括以下步骤：提取湖羊组织DNA样品、FASN基因突变位点g.5157A＞G和g.9413T＞C的单核苷酸多态性分型；通过对湖羊FASN基因单核苷酸多态性与肌内脂肪含量的关联分析，表明对湖羊FASN基因单核苷酸多态性位点的分型检测可以获得用于湖羊肌内脂肪含量性状早期筛选的分子标记。

权利要求

1.一种检测绵羊FASN基因单核苷酸多态性的方法在绵羊肉质性状早期筛选和/或标记辅助选择中的应用，其特征在于：检测绵羊FASN基因单核苷酸多态性的方法，包括以下步骤：提取绵羊基因组DNA进行分析，确定FASN基因单核苷酸多态性位点的基因型，所述单核苷酸多态性位点包括FASN基因突变位点g.9413 T＞C；

FASN基因突变位点g.9413 T＞C的基因型为TT的个体在肉质性状上较优；

所述肉质性状较优是指肌内脂肪含量高；

所述绵羊选自湖羊。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述FASN基因单核苷酸多态性位点的基因型采用DNA测序法或imLDR技术确定。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述FASN基因突变位点是通过将提取自不同绵羊个体的DNA混合，并对混合形成的DNA池进行目的片段扩增和测序而确定的。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述DNA的提取方法为高盐法。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述目的片段扩增采用的引物为引物对P2；

所述引物对P2为：

上游引物F2：5’‑ GTCTAGGGGAGACGGGTTGA‑3’下游引物R2：5’‑ GCCAAGGTCCATCCAGAGAC‑3’。

6.绵羊FASN基因突变位点g.9413 T＞C在绵羊肉质性状早期筛选、绵羊标记辅助选择中的应用，其特征在于：FASN基因突变位点g.9413 T＞C的基因型为TT的个体在肉质性状上较优；

所述肉质性状较优是指肌内脂肪含量高；

所述绵羊选自湖羊。

说明书

一种检测绵羊FASN基因单核苷酸多态性的方法及其在肉质性

状早期筛选中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及单核苷酸多态性(SNP)分子标记的筛选与检测，具体涉及一种将DNA池和改进的多重高温连接酶检测反应(imLDR)技术相结合，检测绵羊脂肪酸合成酶(FASN)基
因单核苷酸多态性的方法及其应用。

背景技术

[0002] 形态学标记、细胞学标记、生化标记和分子标记是目前常见的四种遗传标记类型。通过遗传标记可以对基因座在家系中的传递进行追踪，其本身具有可识别性和遗传性。分
子标记是DNA水平的遗传变异。单核苷酸多态性(SNP)主要是指在基因组水平上由单个核苷
酸的变异所引起的DNA序列多态性，是基因组中分布较为广泛的遗传标记。SNP可由单个碱
基的转换或颠换所引起，也可由碱基的插入、缺失所导致。根据SNP在基因中所处的位置不
同可分为编码区SNP和非编码区SNP。其中，位于基因编码区的SNP(coding SNP，cSNP)可以
分为同义突变(碱基改变前后基因编码氨基酸相同，不会改变蛋白质的序列，但可能导致翻
译效率改变)和非同义突变(碱基改变前后基因编码氨基酸发生改变，从而影响蛋白质的结
构和生物学功能)。因此对由编码区核苷酸的突变产生的SNP进行检测和分析对育种工作具
有重要意义。

[0003] 目前，SNPs的检测方法主要有以下几种：DNA测序法、聚合酶链式反应—单链构象多态(Polymerase Chain Reaction‑Single Strand Conformation Polymorphism，PCR‑
SSCP)与DNA测序结合法、等位特异性PCR(Allele Specific PCR，AS‑PCR)法、引物延伸法和
寡核苷酸连接反应等。其中，DNA测序法结果准确，但对仪器设备、人员技术的要求较严格，
且检测费用较高；PCR‑SSCP存在操作繁琐、耗时长等问题；在SNP位点检测中AS‑PCR需针对
特定基因位点设计引物，而利用引物延伸法和寡核苷酸连接反应技术对仪器和人员条件要
求较高，目前并未得到普遍应用。

[0004] 改进的多重高温连接酶检测反应(improved multiple ligase detection reaction，imLDR)技术，是经由连接酶检测反应(ligase detection reaction，LDR)技术改
良后的基因分型技术，其成本低、速度快、准确性高、仅一次反应就可同时检测16～30个位
点。imLDR进行分型检测的原理是先将目标SNPs位点所在区段采用多重PCR反应在一个体系
内进行扩增，产物经外切核酸酶和虾碱酶(Exol/SAP)纯化后作为后续连接酶反应的模板；
在一个连接反应中，每个位点包含两个5’端等位基因特异探针以及紧随其后的一条Y端位
点的荧光标记的特异探针；连接产物通过ABI3730XL的毛细管电泳区分，原始数据文件用
GeneMapper4.1软件分析。相比于LDR技术，imLDR技术提高了准确性和分型的成功率。

[0005] 肌内脂肪(IMF)主要由磷脂、三酰甘油酯、半磷酸、二磷酸甘油酯、胆固醇和固醇酯以及脂肪酸(fatty acid，FA)组成，其沉积于肌束、肌内外膜，使肌肉表面形成大理石花纹，
是肉质评价中重要的表观含量性状。基因、品种、管理和营养都不同程度的影响着IMF沉积。
IMF与肉的嫩度、多汁性、香味、大理石花纹评分、眼肌面积大小呈显著正相关，在一定范围
内随着IMF含量的增加，肉质口感、嫩度与风味都得到提升。IMF的沉积出现在个体发育的较
晚阶段，并晚于机体其他部位脂肪的沉积，其组成与机体其它部位脂肪的组成也有较大的
差异。研究表明，IMF含量在4％至5％的羊肉品质最佳，为了改善IMF含量，除了关注品种、性
别、年龄、饲料营养成分以外，利用与IMF含量相关的候选基因从遗传方面进行品种改良和
选育具有重要研究意义。

[0006] 脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，FASN)是脂肪酸合成过程中的必需酶类之一，主要功能是在细胞间质中催化脂肪酸的合成。FASN基因位于羊的11号染色体，全长
18795bp。通过对反刍动物FASN基因的表达量与脂肪含量的关联分析(Sanz等，2015年)，发
现营养(不同营养成分的饲料饲喂时)会刺激FASN基因的表达，从而影响脂肪含量的变化。

[0007] 目前，已有大量研究围绕FASN基因多态性对反刍动物肉质影响的方面开展，但其中与牛有关的报道占大多数，还有一些以山羊作为研究对象，而少有与绵羊有关的报道，同
时，利用分子标记对具有肉质性状优势的绵羊个体进行早期筛选仍属于技术难题。

发明内容

[0008] 本发明的目的在于提供一种检测绵羊FASN基因单核苷酸多态性的方法及其在肉质性状早期筛选中的应用，实现绵羊优良肉质性状早期筛选，并应用于绵羊品种改良和选
育。

[0009] 为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

[0010] 一种检测绵羊FASN基因单核苷酸多态性的方法，包括以下步骤：

[0011] 提取绵羊个体基因组DNA作为核酸样品，通过对提取的核酸样品进行分析，确定个体FASN基因单核苷酸多态性位点的基因型，所述单核苷酸多态性位点为FASN基因突变位点
g.5157A＞G(参考序列为NC_040262.1)和g.9413T＞C(参考序列为NC_040262.1)。

[0012] 优选的，所述核酸样品的分析采用DNA测序法，或者核酸样品的分析采用imLDR技术。

[0013] 优选的，所述FASN基因突变位点是通过将提取自不同绵羊(例如，湖羊)个体睾丸组织的DNA混合，并对混合形成的DNA池进行目的片段扩增和测序而确定。

[0014] 优选的，所述睾丸组织的DNA的提取方法为高盐法，高盐法提取睾丸组织的DNA具有操作简便、耗时较短、提取试剂易得的优点，且所提取出的DNA(基因组DNA)质量能够满足
imLDR技术分型要求。

[0015] 优选的，所述目的片段扩增采用的引物为引物对P1或引物对P2；

[0016] 所述引物对P1具体为(扩增产物包含突变位点g.5157A＞G；即扩增FASN基因单核苷酸多态性位点)：

[0017] 上游引物F1：5’‑GTCAGTAGAGCTGTCGGAGCC‑3’

[0018] 下游引物R1：5’‑CATGGGATGTGGGATGTGAGCA‑3’；

[0019] 所述引物对P2具体为(扩增产物包含突变位点g.9413T＞C；即扩增FASN基因单核苷酸多态性位点)：

[0020] 上游引物F2：5’‑GTCTAGGGGAGACGGGTTGA‑3’

[0021] 下游引物R2：5’‑GCCAAGGTCCATCCAGAGAC‑3’。

[0022] 上述检测绵羊FASN基因单核苷酸多态性的方法在绵羊性状早期筛选及标记辅助选择中的应用。

[0023] 绵羊FASN基因突变位点g.5157A＞G(参考序列为NC_040262.1)和/或g.9413T＞C(参考序列为NC_040262.1)在绵羊性状早期筛选及标记辅助选择中的应用。

[0024] 优选的，在不同绵羊(例如，湖羊)群体中，FASN基因突变位点g.5157A＞G(参考序列为NC_040262.1)的基因型为AA的个体在肉质性状上较优，同时，FASN基因突变位点
g.9413T＞C(参考序列为NC_040262.1)的基因型为TT的个体在肉质性状上较优。

[0025] 优选的，所述肉质性状选自肌内脂肪(IMF)含量。

[0026] 一种检测绵羊FASN基因单核苷酸多态性的试剂盒，该试剂盒包括用于完成上述核酸样品的分析的必要试剂。

[0027] 优选的，所述必要试剂具体包括上述引物对P1和引物对P2。

[0028] 本发明的有益效果体现在：

[0029] 本发明通过对新发现的FASN基因SNP位点(具体为g.5157A＞G、g.9413T＞C)进行分型检测，为绵羊优良肉质性状早期筛选提供了候选分子标记，从而为利用标记辅助选择
进行肉质优良的绵羊品种选育提供了理论研究和实践基础。

[0030] 进一步的，本发明通过采用imLDR技术对FASN基因SNP位点进行有效的基因分型，可以快速建立肉质性状优良的绵羊种群，从而加快绵羊良种选育进程。

附图说明

[0031] 图1为湖羊脂肪酸合成酶(FASN)基因第5157位突变位点(g.5157A＞G)PCR扩增产物(753bp片段)电泳图。

[0032] 图2为湖羊脂肪酸合成酶(FASN)基因第9413位突变位点(g.9413T＞C)PCR扩增产物(749bp片段)电泳图。

[0033] 图3为湖羊不同单核苷酸基因型个体DNA池扩增产物测序峰图(箭头所指为脂肪酸合成酶基因第5157位突变位点)。

[0034] 图4为湖羊不同单核苷酸基因型个体DNA池扩增产物测序峰图(箭头所指为脂肪酸合成酶基因第9413位突变位点)。

具体实施方式

[0035] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细描述。所述实施例仅用于解释本发明的技术方案，而非对本发明的保护范围的限制。

[0036] (一)通过DNA池测序筛选新的湖羊脂肪酸合成酶(FASN)基因单核苷酸突变位点

[0037] S1样品的选取：

[0038] 于2018年8月～2020年1月共采取来自于民勤德福农业科技有限公司相同饲养条件下的921只(四批)6月龄健康湖羊的睾丸组织及背最长肌组织，并测定个体背最长肌的肌
内脂肪含量。

[0039] S2DNA池的构建：

[0040] a)采用高盐法提取921只湖羊睾丸组织中的gDNA，具体步骤如下：

[0041] Ⅰ)液氮下研磨组织样后，取0.1g组织粉末至1.5离心管中；

[0042] Ⅱ)加入20％的SDS(100μL)和DNA抽提液(400μL)作为裂解液，静置5min，漩涡使沉淀(组织粉末)完全溶解于裂解液中，然后加入20μL蛋白酶K，颠倒混匀；

[0043] Ⅲ)将混匀的样品置于56℃水浴锅中，消化过夜；

[0044] Ⅳ)将饱和食盐水(300μL)加入到消化好的样品中，颠倒3min，4℃静置10min；

[0045] Ⅴ)12000r离心10min，转移上清液至新的离心管中；

[0046] Ⅵ)加入预冷的无水乙醇(1mL)后颠倒混匀1min，12000r离心2min，弃上清，保留DNA沉淀；

[0047] Ⅶ)加入75％乙醇(500μL)至离心管中，轻摇混匀，12000r离心1min，弃上清，保留DNA沉淀，再次加入75％乙醇(500μL)至离心管中，轻摇混匀，12000r离心1min，弃上清，保留
DNA沉淀，开盖静置5h，使剩余乙醇完全挥发；

[0048] Ⅷ)加入56℃TE缓冲液(200μL)至离心管中，56℃开盖10min(使乙醇挥发沉淀溶解)，4℃过夜溶解DNA。

[0049] b)对4℃过夜溶解的DNA，使用Nanodrop 2000检测DNA浓度和纯度，浓度大于50ng/μL，且OD＝260/280在1.6～1.8之间的样品判断为合格样品。

[0050] c)921只湖羊的DNA样品经质量检测合格后，从中随机选取100个DNA样品，每10个DNA样品为一组，共制备10组混池(其中一组混池即10个DNA样品混合组成的一个DNA池)。

[0051] S3PCR扩增：参照NCBI中已经公布FASN基因的DNA序列(NC_040262.1)，使用Primer‑Blast设计能扩增出：

[0052] a)FASN基因第5、6、7外显子和第5、6内含子的完整片段，以及第4、7内含子的部分片段的引物对P1：

[0053] 上游引物F1：5’‑GTCAGTAGAGCTGTCGGAGCC‑3’     21nt

[0054] 下游引物R1：5’‑CATGGGATGTGGGATGTGAGCA‑3’    22nt；

[0055] b)FASN基因第16、17、18外显子和第16、17内含子的完整片段，以及第15、18内含子的部分片段的引物对P2：

[0056] 上游引物F2：5’‑GTCTAGGGGAGACGGGTTGA‑3’     20nt

[0057] 下游引物R2：5’‑GCCAAGGTCCATCCAGAGAC‑3’     20nt。

[0058] 以DNA混池为模板，进行PCR扩增；

[0059] 反应体系为：12.5μL的2×EasyTagSuperMix(2.5U/μL)、0.5μL上游引物(10pmol/μL)、0.5μL下游引物(10pmol/μL)、10.5μL灭菌的双蒸水、1.5μL DNA模板(50ng/μL)，PCR总反
应体系为25.5μL。

[0060] 反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，62.6℃退火30s，72℃延伸1min，进行34个循环；72℃再延伸5min。

[0061] 参见图1及图2，通过将利用引物对P1及引物对P2扩增的产物分别进行琼脂糖凝胶电泳，分别获得了753bp及749bp的目的片段，电泳结果表明，以上引物对具有特异性，可以
用于通过PCR扩增方便的获得足够数量的目的DNA片段。

[0062] S4扩增产物测序：

[0063] 将利用步骤S3中混池扩增的PCR产物进行双向测序。参见图3，通过对利用引物对P1扩增的目的片段进行测序，发现湖羊脂肪酸合成酶基因的第5157位单核苷酸位点为突变
位点(g.5157A＞G)。参见图4，通过对利用引物对P2扩增的目的片段进行测序，发现湖羊脂
肪酸合成酶基因的第9413位单核苷酸位点为突变位点(g.9413T＞C)。

[0064] (二)通过imLDR技术对候选SNP位点进行分型

[0065] 将质量检测合格的921份湖羊DNA样品分别稀释至50ng/μL，并分装至1mL的离心管中，将以上突变位点作为FASN基因候选单核苷酸多态性位点，取位点上、下游各15bp DNA序
列信息提供给深圳天昊科技有限公司，并由该公司对稀释分装的DNA样品利用imLDR技术对
两个候选单核苷酸多态性位点同时进行分型。

[0066] (三)湖羊脂肪酸合成酶基因(FASN基因)分型及肌内脂肪含量数据分析

[0067] 3.1湖羊FASN基因突变位点的频率统计

[0068] 基因频率计算公式：

[0069] PB＝(2NBB+NBb1+NBb2+NBb3+NBb4+……+NBbn)/2N，

[0070] 式中，PB表示等位基因B频率，NBB表示群体中具有BB基因型的个体数量，NBbi表示群体中具有Bbi基因型个体数量，b1～bn为等位基因B的n个互不相同的复等位基因，N为检测群
体的总个体数。

[0071] 基因型频率计算公式：

[0072] PBB＝NBB/N

[0073] 式中，PBB代表某一位点的BB基因型频率，NBB表示群体中具有BB基因型的个体数，N为检测群体的总个体数；

[0074] 对不同湖羊个体的等位基因和基因型的分析完成后，按以上公式对湖羊群体FASN基因突变位点的等位基因和基因型的频率进行计算，结果如表1所示：

[0075] 表1.湖羊FASN基因突变位点等位基因频率与基因型频率

[0076]

[0077] 根据表1的结果，可以确定湖羊FASN基因突变位点g.5157A＞G(G为优势等位基因，)和g.9413T＞C(T为优势等位基因)均属于SNP位点。

[0078] 3.2湖羊FASN基因SNP位点与肌内脂肪(IMF)含量的关联分析

[0079] 相关性分析数据：imLDR技术的分型结果；肌内脂肪含量表型数据

[0080] 采用SPSS 25软件分析数据，SNP位点分型结果与肌内脂肪含量表型数据的相关性分析具体采用以下分析模型：

[0081] Yijk＝μ+Gj+Eijk

[0082] 式中，Yijk为个体表型记录；μ为群体均值；Gj为各位点的基因型效应；Eijk为随机误差。进而通过构建的模型推出基因位点，同时佐证湖羊FASN基因的第5157位A＞G及第9413
位T＞C突变在相应位点所产生的单核苷酸多态性对湖羊肌内脂肪含量早期性状的影响。分
析结果如表2所示：

[0083] 表2.湖羊FASN基因单核苷酸多态性与肌内脂肪含量的关联分析

[0084]

[0085] 注：不同肩标字母表示差异显著(P<0.05)，相同肩标字母表示差异不显著标(P>0.05)。

[0086] IMF含量为使用R3.6.0去除批次效应后的数据，负号是由去除批次效应造成。

[0087] 关联分析结果显示(表2)，对于imLDR技术分型的第5157位的单核苷酸多态性位点(即g.5157A＞G)，GG基因型个体的肌内脂肪含量显著低于AA基因型个体；对于imLDR技术分
型的第9413位的单核苷酸多态性位点(即g.9413T＞C)，TT基因型个体的肌内脂肪含量显著
高于CC基因型个体。根据以上分析结果，可以通过选择FASN基因第5157位单核苷酸多态性
位点为AA纯合子，以及第9413位单核苷酸多态性位点为TT纯合子的个体建立具有肉质性状
优势的湖羊群体。

[0088] 综上所述，本发明通过对脂肪酸合成酶基因单核苷酸突变位点进行imLDR技术的分型、基因和基因型频率计算，及与肌内脂肪含量表型数据的关联分析，发现FASN基因对湖
羊肌内脂肪的沉积产生着重要影响，对该基因的基因功能及遗传变异展开进一步的研究，
有利于提高绵羊的肉质性状。同时，本发明还建立起了肌内脂肪含量表型与脂肪酸合成酶
基因第5157位A＞G及第9413位T＞C的突变所产生的单核苷酸多态性的关系，为湖羊肌内脂
肪含量性状早期筛选，以及选育肉质好、风味佳的绵羊品种提供筛选分子标记(SNP标记)，
对于绵羊分子育种具有重要意义。