一种利用酶修饰电极检测尿液中同型半胱氨酸的方法

摘要

本发明公开了一种利用酶修饰电极检测尿液中同型半胱氨酸的方法，步骤是1)纳米多孔金电极的制备及其表征；2)酶修饰电极的制备；3)以蛋氨酸裂解酶修饰电极或胱硫醚合成酶修饰电极检测不同浓度Hcy产生的电流响应值，做出Hcy线性标准曲线；4)用蛋氨酸裂解酶修饰电极或胱硫醚合成酶修饰电极检测含Hcy的尿液稀释样品。本发明的方法与其他检测方法相比，不需要昂贵的仪器和试剂，极大地降低了检测成本，且不需要复杂的样品前处理过程，操作简单，检测迅速。具有广阔的应用前景。

权利要求

1.一种利用酶修饰电极检测尿液中同型半胱氨酸的方法，步骤是：(1)纳米多孔金电极的制备及其表征；

其中，所述电极的制备方法是：将厚度为100±10nm的金银合金薄膜置于30±2℃的浓硝酸中，腐蚀30～60min，制得NPG，将制得的NPG贴在玻碳电极表面，并在NPG表面滴加2～5μL 0.05％的Nafion，待晾干后，用红外灯烘烤10min，制得纳米多孔金电极NPG/GCE；

(2)酶修饰电极的制备；

(3)以蛋氨酸裂解酶修饰电极或胱硫醚合成酶修饰电极检测不同浓度同型半胱氨酸产生的电流响应值，做出同型半胱氨酸线性标准曲线；

(4)用蛋氨酸裂解酶修饰电极或胱硫醚合成酶修饰电极检测含同型半胱氨酸的尿液稀释样品；

其特征在于：

步骤(1)所述纳米多孔金电极表征的方法是：以制得纳米多孔金电极NPG/GCE为工作电极，铂电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极组成三电极体系，在0.5M H2SO4中用循环伏安法扫描20圈，扫描低电位范围为+0.3～+

0.4V，扫描高电位范围为+1.5～+1.6V，以NPG/GCE电极表面氧化物形成的电量表征NPG/GCE电极的有效面积；

步骤(2)所述酶修饰电极的制备方法是：‑1

将制备及表征好的NPG/GCE电极浸泡于浓度为2±1mg mL 的蛋氨酸裂解酶液中，4℃冰箱放置72h完成酶固定化，制得蛋氨酸裂解酶修饰电极；或者将制备及表征好的NPG/GCE电‑1

极浸泡于浓度为2±1mg mL 的胱硫醚合成酶液中，4℃冰箱放置72h完成酶固定化，制得胱硫醚合成酶修饰电极；

步骤(3)所述以蛋氨酸裂解酶修饰电极或胱硫醚合成酶修饰电极检测不同浓度同型半胱氨酸产生的电流响应值，做出同型半胱氨酸线性标准曲线的方法是：在50mM，pH 8.0的磷酸盐缓冲溶液中分别加入5μM、10μM、30μM、50μM、100μM的同型半胱氨酸，采用蛋氨酸裂解酶修饰电极或胱硫醚合成酶修饰电极，利用时间电流法检测，测试电位范围为‑0.2～0.0V，检测时间为150～300s，电流响应值取电流稳定后的电流值；将检测得到的电流响应值对同型半胱氨酸的浓度作图，分别得到两种酶修饰电极检测同型半胱氨酸的线性标准曲线；

步骤(4)所述用蛋氨酸裂解酶修饰电极或胱硫醚合成酶修饰电极检测含同型半胱氨酸的尿液稀释样品的方法是：

取尿液样品，用50mM、pH 8.0的磷酸盐缓冲溶液和尿液样品以9:1的配比体积混合成尿液稀释样品，在尿液稀释样品中加入设定浓度的同型半胱氨酸，采用蛋氨酸裂解酶修饰电极或胱硫醚合成酶修饰电极，利用时间电流法检测并验证测试结果；测试电位范围为‑0.2～0.0V，检测时间范围为150～300s，电流响应值取电流稳定后的电流值，将得到的电流响应值代入同型半胱氨酸线性标准曲线中即可得到尿液稀释样品中同型半胱氨酸的浓度；验证结果显示得到的同型半胱氨酸浓度与加入的同型半胱氨酸浓度值相比离差率均小于

5％，证明利用酶修饰电极检测尿液中同型半胱氨酸的方法可行。

2.根据权利要求1所述利用酶修饰电极检测尿液中同型半胱氨酸的方法，其特征在于，步骤(1)所述纳米多孔金电极表征方法是：以制得纳米多孔金电极NPG/GCE为工作电极，铂电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极组成三电极体系，在0.5M H2SO4中用循环伏安法扫描20圈，扫描低电位为+0.35V，扫描高电位为+1.55V，以纳米多孔金电极表面氧化物形成的电量表征纳米多孔金电极NPG/GCE的有效面积。

3.根据权利要求1所述利用酶修饰电极检测尿液中同型半胱氨酸的方法，其特征在于，步骤(2)所述酶修饰电极的制备方法是：‑1

将制备及表征好的NPG/GCE电极浸泡于浓度为2mg mL 的蛋氨酸裂解酶液中，4℃冰箱放置72h完成酶固定化，制得蛋氨酸裂解酶修饰电极；或者将制备及表征好的NPG/GCE电极‑1

浸泡于浓度为2mg mL 的胱硫醚合成酶液中，4℃冰箱放置72h完成酶固定化，制得胱硫醚合成酶修饰电极。

4.根据权利要求1所述利用酶修饰电极检测尿液中同型半胱氨酸的方法，其特征在于，步骤(3)所述测试电位选‑0.1V，检测时间为200s。

5.根据权利要求1所述利用酶修饰电极检测尿液中同型半胱氨酸的方法，其特征在于，步骤(4)所述测试电位选‑0.1V，检测时间为200s。

说明书

一种利用酶修饰电极检测尿液中同型半胱氨酸的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种同型半胱氨酸(Homocysteine，Hcy)的检测方法，尤其涉及一种利用酶修饰电极检测尿液中同型半胱氨酸的方法。属于电化学分析测试领域。

背景技术

[0002] 同型半胱氨酸(Homocysteine，Hcy)在人体血浆中主要以结合态形式存在，仅有约5％的Hcy以游离态的形式存在。结合态和游离态的Hcy量的总和即为总同型半胱氨酸
(Total homocysteine，tHcy)。血浆中tHcy的正常含量在5‑15μM范围内，血浆中tHcy水平异
常升高即为高同型半胱氨酸血症。根据血浆中tHcy水平可分为轻、中度和重度高同型半胱
氨酸血症。目前很多临床研究表明，血浆中异常水平的tHcy与心血管疾病、妊娠并发症、糖
尿病、阿尔兹海默病、肾衰竭、抑郁症等多种疾病相关，并且tHcy水平越高，患病风险越高。
检测血浆中tHcy可作为临床诊断和人体健康评估的一项重要参考指标。因此，tHcy的检测
具有重大意义。

[0003] 目前已经有较多检测Hcy的报道，如高效液相色谱法、循环酶法和免疫荧光偏振法，这些方法需要昂贵的仪器和试剂，操作过程较为复杂且耗时长，无法广泛应用于Hcy的
检测。因此，需要一种成本较低、操作简单和检测迅速的替代检测方法，以满足临床低成本
快速准确检测Hcy的需求。

[0004] 近年来，电化学传感器技术因其检测耗时较短、易于上手操作、便于携带、成本较低等优势得到了研究者的广泛关注。纳米多孔金(Nanoporous gold，NPG)具有较高的比表
面积、优异的导电性和催化性能、生物相容性、孔径可调、双连续开放结构和易于制备等优
点，可作为良好的电极构建材料。为了进一步提高传感器的特异性，可利用特异性较强的酶
与兼具结构和功能的纳米多孔金构建酶修饰电极。目前已有文献报道利用酶修饰电极检测
葡萄糖、甘油三酯等物质。但通过在纳米多孔金上负载对Hcy特异性的酶，达到特异性的检
测Hcy目的利用酶修饰电极检测尿液中同型半胱氨酸的方法还未见报道。

发明内容

[0005] 针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种利用酶修饰电极检测尿液中同型半胱氨酸的方法。

[0006] 本发明所述利用酶修饰电极检测尿液中同型半胱氨酸的方法，步骤是：

[0007] (1)纳米多孔金电极的制备及其表征；

[0008] 其中，所述电极的制备方法是：将厚度为100±10nm的金银合金薄膜置于30±2℃的浓硝酸中，腐蚀30～60min，制得NPG，将制得的NPG贴在玻碳电极表面，并在NPG表面滴加2
～5μL 0.05％的Nafion，待晾干后，用红外灯烘烤10min，制得纳米多孔金电极NPG/GCE；

[0009] (2)酶修饰电极的制备；

[0010] (3)以蛋氨酸裂解酶修饰电极或胱硫醚合成酶修饰电极检测不同浓度同型半胱氨酸(Hcy)产生的电流响应值，做出同型半胱氨酸(Hcy)线性标准曲线；

[0011] (4)用蛋氨酸裂解酶修饰电极或胱硫醚合成酶修饰电极检测含同型半胱氨酸(Hcy)的尿液稀释样品；

[0012] 其特征在于：

[0013] 步骤(1)所述纳米多孔金电极表征的方法是：

[0014] 以制得纳米多孔金电极NPG/GCE为工作电极，铂电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极组成三电极体系，在0.5M H2SO4中用循环伏安法扫描20圈，扫描低电位范围为+0.3～
+0.4V，扫描高电位范围为+1.5～+1.6V，以NPG/GCE电极表面氧化物形成的电量表征NPG/
GCE电极的有效面积；

[0015] 步骤(2)所述酶修饰电极的制备方法是：

[0016] 将制备及表征好的NPG/GCE电极浸泡于浓度为2±1mg mL‑1的蛋氨酸裂解酶液中，4℃冰箱放置72h完成酶固定化，制得蛋氨酸裂解酶修饰电极；或者将制备及表征好的NPG/
‑1
GCE电极浸泡于浓度为2±1mg mL 的胱硫醚合成酶液中，4℃冰箱放置72h完成酶固定化，制
得胱硫醚合成酶修饰电极；

[0017] 步骤(3)所述以蛋氨酸裂解酶修饰电极或胱硫醚合成酶修饰电极检测不同浓度Hcy产生的电流响应值，做出Hcy线性标准曲线的方法是：

[0018] 在50mM，pH 8.0的磷酸盐缓冲溶液中分别加入5μM、10μM、30μM、50μM、100μM的同型半胱氨酸，采用蛋氨酸裂解酶修饰电极或胱硫醚合成酶修饰电极，利用时间电流法检测，测
试电位范围为‑0.2～0.0V，检测时间为150～300s，电流响应值取电流稳定后的电流值；将
检测得到的电流响应值对Hcy的浓度作图，分别得到两种酶修饰电极检测Hcy的线性标准曲
线；

[0019] 步骤(4)所述用蛋氨酸裂解酶修饰电极或胱硫醚合成酶修饰电极检测含Hcy的尿液稀释样品的方法是：

[0020] 取尿液样品，用50mM、pH 8.0的磷酸盐缓冲溶液和尿液样品以9:1的配比体积混合成尿液稀释样品，在尿液稀释样品中加入设定浓度的Hcy，采用蛋氨酸裂解酶修饰电极或胱
硫醚合成酶修饰电极，利用时间电流法检测并验证测试结果；测试电位范围为‑0.2～0.0V，
检测时间范围为150～300s，电流响应值取电流稳定后的电流值，将得到的电流响应值代入
Hcy线性标准曲线中即可得到尿液稀释样品中Hcy的浓度；验证结果显示得到的同型半胱氨
酸浓度与加入的同型半胱氨酸浓度值相比离差率均小于5％，证明利用酶修饰电极检测尿
液中同型半胱氨酸的方法可行。

[0021] 上述利用酶修饰电极检测尿液中同型半胱氨酸的方法中，步骤(1)所述纳米多孔金电极表征方法优选是：

[0022] 以制得纳米多孔金电极NPG/GCE为工作电极，铂电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极组成三电极体系，在0.5M H2SO4中用循环伏安法扫描20圈，扫描低电位为+0.35V，扫
描高电位为+1.55V，以纳米多孔金电极表面氧化物形成的电量表征纳米多孔金电极NPG/
GCE的有效面积。

[0023] 上述利用酶修饰电极检测尿液中同型半胱氨酸的方法中，步骤(2)所述酶修饰电极的制备方法优选是：

[0024] 将制备及表征好的NPG/GCE电极浸泡于浓度为2mg mL‑1的蛋氨酸裂解酶液中，4℃冰箱放置72h完成酶固定化，制得蛋氨酸裂解酶修饰电极；或者将制备及表征好的NPG/GCE
‑1
电极浸泡于浓度为2mg mL 的胱硫醚合成酶液中，4℃冰箱放置72h完成酶固定化，制得胱硫
醚合成酶修饰电极。

[0025] 上述利用酶修饰电极检测尿液中同型半胱氨酸的方法中，步骤(3)所述测试电位优选‑0.1V，检测时间为200s。

[0026] 上述利用酶修饰电极检测尿液中同型半胱氨酸的方法中，步骤(4)所述测试电位优选‑0.1V，检测时间为200s。

[0027] 本发明提供了一种利用酶修饰电极检测尿液中同型半胱氨酸(Hcy)的方法，是基于酶和NPG协同催化Hcy实现对Hcy检测，其关键原理在于蛋氨酸裂解酶可催化Hcy产生硫化
氢、氨气和α‑丁酮酸，NPG可催化硫化氢生成硫单质和多硫化物，这一过程伴随电子的转移，
产生电流信号，利用蛋氨酸裂解酶修饰电极检测到的电流响应值，即可对应不同浓度的
Hcy；胱硫醚合成酶可催化一分子的同型半胱氨酸和一分子的半胱氨酸产生硫化氢和胱硫
醚，NPG可催化硫化氢生成硫单质和多硫化物，这一过程伴随电子的转移，产生电流信号，利
用胱硫醚合成酶修饰电极检测到的电流响应值，即可对应不同浓度的Hcy。因此，分别利用
构建的两种酶修饰电极检测到的电流响应值即可达到定量检测Hcy的目的。本发明所述检
测方法突出的优势在于，通过酶和NPG的协同催化作用产生电流信号，通过检测电流响应值
实现对Hcy的检测，利用电化学方法检测Hcy不需要复杂的样品前处理过程，且检测过程易
于操作，检测迅速。

[0028] 本发明具有的突出性实质性特点和显著进步体现在：

[0029] 1、本发明提供了一种基于酶修饰电极检测Hcy的方法，该方法酶修饰电极电极制备过程简单，且利用了对Hcy特异性较强的蛋氨酸裂解酶和胱硫醚合成酶，避免了半胱氨酸
的干扰。

[0030] 2、本发明提供的Hcy检测方法与其他检测方法相比，不需要昂贵的仪器和试剂，极大地降低了检测成本，且不需要复杂的样品前处理过程，操作简单，检测迅速。

附图说明

[0031] 图1为蛋氨酸裂解酶修饰电极检测Hcy的原理示意图。

[0032] 其中：GCE：玻碳电极；NPG：纳米多孔金；MGL：蛋氨酸裂解酶。

[0033] 图2为胱硫醚合成酶修饰电极检测Hcy的原理示意图。

[0034] 其中：CBS：胱硫醚合成酶。

[0035] 图3为蛋氨酸裂解酶修饰电极检测不同浓度Hcy的电流响应图。

[0036] 其中：插图为蛋氨酸裂解酶修饰电极检测Hcy的标准曲线。

[0037] 图4为胱硫醚合成酶修饰电极检测不同浓度Hcy的电流响应图。

[0038] 其中：插图为胱硫醚合成酶修饰电极检测Hcy的标准曲线。

[0039] 图5为蛋氨酸裂解酶修饰电极及所述检测方法在检测Hcy时，对尿液中的常见离子和小分子的抗干扰能力测试结果图。

[0040] 图6为胱硫醚合成酶修饰电极及所述检测方法在检测Hcy时，对尿液中的常见离子和小分子的抗干扰能力测试结果图。

具体实施方式

[0041] 下面结合具体附图和实施例对本发明内容进行详细说明。如下所述例子仅是本发明的较佳实施方式而已，应该说明的是，下述说明仅仅是为了解释本发明，并非对本发明作
任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对实施方式所做的任何简单修改，等同变
化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。

[0042] 下述实施例中，所使用的材料、试剂，如无特殊说明，均从商业途径得到。

[0043] 实施例1：一种利用酶修饰电极快速准确检测Hcy的方法

[0044] (1)纳米多孔金电极的制备及其表征：

[0045] 将厚度为100nm的金银合金薄膜置于30℃的浓硝酸中，腐蚀45min，制得NPG。将制得的NPG贴在玻碳电极(Glassy carbon electrode，GCE)表面，并在NPG表面滴加3μL 
0.05％的Nafion，待晾干后，用红外灯烘烤10min，制得纳米多孔金电极(NPG/GCE)。

[0046] 以制得的NPG/GCE为工作电极，铂电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极组成三电极体系，在0.5M H2SO4中用循环伏安法扫描20圈，扫描低电位为+0.35V，扫描高电位范围
为+1.55V，以NPG/GCE电极表面氧化物形成的电量表征NPG/GCE电极的有效面积。

[0047] (2)酶修饰电极的制备：

[0048] 将制备及表征好的NPG/GCE电极浸泡于浓度为2mg mL‑1的蛋氨酸裂解酶液中，4℃冰箱放置72h完成酶固定化，制得蛋氨酸裂解酶修饰电极(MGL/NPG/GCE)；

[0049] (3)蛋氨酸裂解酶修饰电极检测不同浓度Hcy产生的电流响应值，做出Hcy线性标准曲线：

[0050] 在50mM，pH 8.0的磷酸盐缓冲溶液中分别加入5～100μM范围内(5μM、10μM、30μM、50μM、100μM)的Hcy，采用蛋氨酸裂解酶修饰电极，利用时间电流法检测，测试电位范围为‑
0.1V，检测时间为200s，电流响应值取电流稳定后的电流值。将检测得到的电流响应值对
Hcy的浓度作图，得到蛋氨酸裂解酶修饰电极检测Hcy的线性标准曲线。

[0051] (4)检测含Hcy的尿液稀释样品：

[0052] 取尿液样品，用50mM、pH 8.0的磷酸盐缓冲溶液与尿液样品以9:1的体积配比混合成尿液稀释样品，在尿液稀释样品中加入10μM、50μM、和90μM的Hcy，采用蛋氨酸裂解酶修饰
电极，利用时间电流法检测，测试电位范围为‑0.1V，检测时间范围为200s，电流响应值取电
流稳定后的电流值。将得到的电流响应值代入Hcy线性标准曲线中即可得到尿液稀释样品
中Hcy的浓度，检测结果如表1所示。

[0053] 上述检测得到的Hcy浓度与加入的Hcy浓度值相比离差率均小于5％，证明本发明所述利用酶修饰电极检测尿液中同型半胱氨酸的方法可行。

[0054] 表1：检测结果

[0055]

[0056] 实施例2：一种利用酶修饰电极快速准确检测Hcy的方法

[0057] (1)纳米多孔金电极的制备及其表征：

[0058] 将厚度为90nm的金银合金薄膜置于28℃的浓硝酸中，腐蚀30min，制得NPG。将制得的NPG贴在玻碳电极(Glassy carbon electrode，GCE)表面，并在NPG表面滴加2μL 0.05％
的Nafion，待晾干后，用红外灯烘烤10min，制得纳米多孔金电极(NPG/GCE)。

[0059] 以制得的NPG/GCE为工作电极，铂电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极组成三电极体系，在0.5M H2SO4中用循环伏安法扫描20圈，扫描低电位为+0.3V，扫描高电位范围为
+1.5V，以NPG/GCE电极表面氧化物形成的电量表征NPG/GCE电极的有效面积。

[0060] (2)酶修饰电极的制备：

[0061] 将制备及表征好的NPG/GCE电极浸泡于浓度为2mg mL‑1的蛋氨酸裂解酶液中，4℃冰箱放置72h完成酶固定化，制得蛋氨酸裂解酶修饰电极(MGL/NPG/GCE)；

[0062] (3)蛋氨酸裂解酶修饰电极检测不同浓度Hcy产生的电流响应值，做出Hcy线性标准曲线：

[0063] 在50mM，pH 8.0的磷酸盐缓冲溶液中分别加入5～100μM范围内(5μM、10μM、30μM、50μM、100μM)的Hcy，采用蛋氨酸裂解酶修饰电极，利用时间电流法检测，测试电位范围为‑
0.2V，检测时间为150s，电流响应值取电流稳定后的电流值。将检测得到的电流响应值对
Hcy的浓度作图，得到蛋氨酸裂解酶修饰电极检测Hcy的线性标准曲线。

[0064] (4)检测含Hcy的尿液稀释样品：

[0065] 取尿液样品，用50mM、pH 8.0的磷酸盐缓冲溶液与尿液样品以9:1的体积配比混合成尿液稀释样品，在尿液稀释样品中加入10μM、50μM、和90μM的Hcy，采用蛋氨酸裂解酶修饰
电极，利用时间电流法检测，测试电位范围为‑0.2V，检测时间范围为150s，电流响应值取电
流稳定后的电流值。将得到的电流响应值代入Hcy线性标准曲线中即可得到尿液稀释样品
中Hcy的浓度。检测结果证明本发明所述利用酶修饰电极检测尿液中同型半胱氨酸的方法
可行。

[0066] 实施例3：一种利用酶修饰电极快速准确检测Hcy的方法

[0067] (1)纳米多孔金电极的制备及其表征：

[0068] 将厚度为110nm的金银合金薄膜置于32℃的浓硝酸中，腐蚀60min，制得NPG。将制得的NPG贴在玻碳电极(Glassy carbon electrode，GCE)表面，并在NPG表面滴加5μL 
0.05％的Nafion，待晾干后，用红外灯烘烤10min，制得纳米多孔金电极(NPG/GCE)。

[0069] 以制得的NPG/GCE为工作电极，铂电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极组成三电极体系，在0.5M H2SO4中用循环伏安法扫描20圈，扫描低电位为+0.4V，扫描高电位范围为
+1.6V，以NPG/GCE电极表面氧化物形成的电量表征NPG/GCE电极的有效面积。

[0070] (2)酶修饰电极的制备：

[0071] 将制备及表征好的NPG/GCE电极浸泡于浓度为2mg mL‑1的蛋氨酸裂解酶液中，4℃冰箱放置72h完成酶固定化，制得蛋氨酸裂解酶修饰电极(MGL/NPG/GCE)；

[0072] (3)蛋氨酸裂解酶修饰电极检测不同浓度Hcy产生的电流响应值，做出Hcy线性标准曲线：

[0073] 在50mM，pH 8.0的磷酸盐缓冲溶液中分别加入5～100μM范围内(5μM、10μM、30μM、50μM、100μM)的Hcy，利用蛋氨酸裂解酶修饰电极，利用时间电流法检测，测试电位范围为
0.0V，检测时间为300s，电流响应值取电流稳定后的电流值。将检测得到的电流响应值对
Hcy的浓度作图，得到蛋氨酸裂解酶修饰电极检测Hcy的线性标准曲线。

[0074] (4)检测含Hcy的尿液稀释样品：

[0075] 取尿液样品，用50mM、pH 8.0的磷酸盐缓冲溶液和尿液样品以9:1的配比混合成尿液稀释样品，在尿液稀释样品中加入10μM、50μM、和90μM的Hcy，利用蛋氨酸裂解酶修饰电
极，利用时间电流法检测，测试电位范围为0.0V，检测时间范围为300s，电流响应值取电流
稳定后的电流值。将得到的电流响应值代入Hcy线性标准曲线中即可得到尿液稀释样品中
Hcy的浓度。检测结果证明本发明所述利用酶修饰电极检测尿液中同型半胱氨酸的方法可
行。

[0076] 实施例4：一种利用酶修饰电极快速准确检测Hcy的方法

[0077] (1)纳米多孔金电极的制备及其表征：

[0078] 将厚度为100nm的金银合金薄膜置于30℃的浓硝酸中，腐蚀45min，制得NPG。将制得的NPG贴在玻碳电极(Glassy carbon electrode，GCE)表面，并在NPG表面滴加3μL 
0.05％的Nafion，待晾干后，用红外灯烘烤10min，制得纳米多孔金电极(NPG/GCE)。

[0079] 以制得的NPG/GCE为工作电极，铂电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极组成三电极体系，在0.5M H2SO4中用循环伏安法扫描20圈，扫描低电位为+0.35V，扫描高电位范围
为+1.55V，以NPG/GCE电极表面氧化物形成的电量表征NPG/GCE电极的有效面积。

[0080] (2)酶修饰电极的制备：

[0081] 将制备及表征好的NPG/GCE电极浸泡于浓度为2mg mL‑1的胱硫醚合成酶液中，4℃冰箱放置72h完成酶固定化，制得胱硫醚合成酶液修饰电极(CBS/NPG/GCE)。

[0082] (3)胱硫醚合成酶修饰电极检测不同浓度Hcy产生的电流响应值，做出Hcy线性标准曲线：

[0083] 在50mM，pH 8.0的磷酸盐缓冲溶液中分别加入5～100μM范围内(5μM、10μM、30μM、50μM、100μM)的Hcy，采用胱硫醚合成酶修饰电极，利用时间电流法检测，测试电位范围为‑
0.1V，检测时间为200s，电流响应值取电流稳定后的电流值。将检测得到的电流响应值对
Hcy的浓度作图，得到胱硫醚合成酶修饰电极检测Hcy的线性标准曲线。

[0084] (4)检测含Hcy的尿液稀释样品：

[0085] 取尿液样品，用50mM、pH 8.0的磷酸盐缓冲溶液与尿液样品以9:1的体积配比混合成尿液稀释样品，在尿液稀释样品中加入10μM和30μM的Hcy，采用胱硫醚合成酶修饰电极，
利用时间电流法检测，测试电位范围为‑0.1V，检测时间范围为200s，电流响应值取电流稳
定后的电流值。将得到的电流响应值代入Hcy线性标准曲线中即可得到尿液稀释样品中Hcy
的浓度，检测结果如表2所示。

[0086] 上述检测得到的Hcy浓度与加入的Hcy浓度值相比离差率均小于5％，证明本发明所述利用酶修饰电极检测尿液中同型半胱氨酸的方法可行。。

[0087] 表2：检测结果

[0088]

[0089] 实施例5：一种利用酶修饰电极快速准确检测Hcy的方法

[0090] (1)纳米多孔金电极的制备及其表征：

[0091] 将厚度为90nm的金银合金薄膜置于28℃的浓硝酸中，腐蚀30min，制得NPG。将制得的NPG贴在玻碳电极(Glassy carbon electrode，GCE)表面，并在NPG表面滴加2μL 0.05％
的Nafion，待晾干后，用红外灯烘烤10min，制得纳米多孔金电极(NPG/GCE)。

[0092] 以制得的NPG/GCE为工作电极，铂电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极组成三电极体系，在0.5M H2SO4中用循环伏安法扫描20圈，扫描低电位为+0.3V，扫描高电位范围为
+1.5V，以NPG/GCE电极表面氧化物形成的电量表征NPG/GCE电极的有效面积。

[0093] (2)酶修饰电极的制备：

[0094] 将制备及表征好的NPG/GCE电极浸泡于浓度为2mg mL‑1的胱硫醚合成酶中，4℃冰箱放置72h完成酶固定化，制得胱硫醚合成酶修饰电极(CBS/NPG/GCE)。

[0095] (3)胱硫醚合成酶修饰电极检测不同浓度Hcy产生的电流响应值，做出Hcy线性标准曲线：

[0096] 在50mM，pH 8.0的磷酸盐缓冲溶液中分别加入5～100μM范围内(5μM、10μM、30μM、50μM、100μM)的Hcy，采用胱硫醚合成酶修饰电极，利用时间电流法检测，测试电位范围为‑
0.2V，检测时间为150s，电流响应值取电流稳定后的电流值。将检测得到的电流响应值对
Hcy的浓度作图，得到胱硫醚合成酶修饰电极检测Hcy的线性标准曲线。

[0097] (4)检测含Hcy的尿液稀释样品：

[0098] 取尿液样品，用50mM、pH 8.0的磷酸盐缓冲溶液与尿液样品以9:1的体积配比混合成尿液稀释样品，在尿液稀释样品中加入10μM和30μM的Hcy，采用胱硫醚合成酶修饰电极，
利用时间电流法检测，测试电位范围为‑0.2V，检测时间范围为150s，电流响应值取电流稳
定后的电流值。将得到的电流响应值代入Hcy线性标准曲线中即可得到尿液稀释样品中Hcy
的浓度。检测结果证明本发明所述利用酶修饰电极检测尿液中同型半胱氨酸的方法可行。

[0099] 实施例6：一种利用酶修饰电极快速准确检测Hcy的方法

[0100] (1)纳米多孔金电极的制备及其表征：

[0101] 将厚度为110nm的金银合金薄膜置于32℃的浓硝酸中，腐蚀60min，制得NPG。将制得的NPG贴在玻碳电极(Glassy carbon electrode，GCE)表面，并在NPG表面滴加5μL 
0.05％的Nafion，待晾干后，用红外灯烘烤10min，制得纳米多孔金电极(NPG/GCE)。

[0102] 以制得的NPG/GCE为工作电极，铂电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极组成三电极体系，在0.5M H2SO4中用循环伏安法扫描20圈，扫描低电位为+0.4V，扫描高电位范围为
+1.6V，以NPG/GCE电极表面氧化物形成的电量表征NPG/GCE电极的有效面积。

[0103] (2)酶修饰电极的制备：

[0104] 将制备及表征好的NPG/GCE电极浸泡于浓度为2mg mL‑1的胱硫醚合成酶中，4℃冰箱放置72h完成酶固定化，制得胱硫醚合成酶修饰电极(CBS/NPG/GCE)。

[0105] (3)胱硫醚合成酶修饰电极检测不同浓度Hcy产生的电流响应值，做出Hcy线性标准曲线：

[0106] 在50mM，pH 8.0的磷酸盐缓冲溶液中分别加入5～100μM范围内(5μM、10μM、30μM、50μM、100μM)的Hcy，采用胱硫醚合成酶修饰电极，利用时间电流法检测，测试电位范围为
0.0V，检测时间为300s，电流响应值取电流稳定后的电流值。将检测得到的电流响应值对
Hcy的浓度作图，得到胱硫醚合成酶修饰电极检测Hcy的线性标准曲线。

[0107] (4)检测含Hcy的尿液稀释样品：

[0108] 取尿液样品，用50mM、pH 8.0的磷酸盐缓冲溶液与尿液样品以9:1的体积配比混合成尿液稀释样品，在尿液稀释样品中加入10μM和30μM的Hcy，采用胱硫醚合成酶修饰电极，
利用时间电流法检测，测试电位范围为0.0V，检测时间范围为300s，电流响应值取电流稳定
后的电流值。将得到的电流响应值代入Hcy线性标准曲线中即可得到尿液稀释样品中Hcy的
浓度。检测结果证明本发明所述利用酶修饰电极检测尿液中同型半胱氨酸的方法可行。