芍药甘草汤的质量控制方法

摘要

本发明属于中药分析技术领域，具体涉及一种芍药甘草汤的质量控制方法。本发明提供的芍药甘草汤的质量控制方法包括供试品溶液制备步骤、对照品溶液制备步骤，和超高液相色谱检测步骤。通过上述质量控制方法能够实现对芍药甘草汤中指标成分的定性、定量分析，为芍药甘草汤的质量评价和临床应用提供重要的参考依据。通过优化超高液相色谱检测的色谱条件，可以提高指标成分的响应度，进而有利于改善对指标成分含量检测的准确性，实现对芍药甘草汤中复杂的化学成分进行归属和含量测定。

权利要求

1.一种芍药甘草汤的质量控制方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：供试品溶液制备步骤：取芍药甘草汤标准汤剂、芍药甘草汤对应实物或芍药甘草汤颗粒，制备芍药甘草汤供试品溶液；

对照品溶液制备步骤：取单一组分对照品，制备包含单一组分对照品的芍药甘草汤对照品溶液；

超高液相色谱检测步骤：通过超高液相色谱对所述芍药甘草汤供试品溶液和对照品溶液进行检测；其中，所述超高液相色谱检测采用二元流动相进行梯度洗脱，流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为乙腈；

所述方法还包括在所述供试品溶液制备步骤之前的如下步骤：

药材基原鉴定步骤：取芍药甘草汤的原料药材，提取所述原料药材的基因组DNA，PCR扩增所述基因组DNA的ITS2片段，根据所述PCR扩增的ITS2片段鉴定药材基原。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述超高液相色谱检测为UHPLC‑DAD检测。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述超高液相色谱的色谱条件还包括：所述流动相A与所述流动相B的体积比为(95‑5)：(5‑95)；

‑1

所述二元流动相的流速为0.4mL·min ；

所述超高液相色谱的进样量为5μL；

所述超高液相色谱的色谱柱的柱温为30℃。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述色谱柱为Thermo Accucore C18色谱柱，150mm×2.1mm，2.6μm。

5.根据权利要求1‑4任一项所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的引物组包括：P3，其包含如SEQ ID NO.1所示的序列的核苷酸序列，E4，其包含如SEQ ID NO.2所示的序列的核苷酸序列。

6.根据权利要求1‑4任一项所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的条件为：94℃

5min，35个循环，72℃7min；其中，所述循环为：94℃30s，55℃30s，72℃90s。

7.根据权利要求1‑4任一项所述的方法，其特征在于，所述超高液相色谱检测步骤还包括：测定指标成分含量的步骤：对所述芍药甘草汤供试品溶液和对照品溶液进行超高液相色谱检测，获得各自的超高液相色谱图，根据所述超高液相色谱图测定芍药甘草汤供试品中指标成分的含量；其中，所述指标成分包括芍药苷、甘草苷和甘草酸。

8.根据权利要求1‑4任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：芍药甘草汤的特征图谱构建步骤：对至少两个批次的芍药甘草汤供试品溶液和对照品溶液进行超高液相色谱检测，获得各自的超高液相色谱图，选择其中一个批次的芍药甘草汤供试品溶液的色谱图作为参照图谱，依据参照谱图与所述芍药甘草汤对照品溶液的色谱图确定特征峰，依据所述特征峰确定不同批次的芍药甘草汤供试品的共有峰，得到芍药甘草汤的特征图谱。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述芍药甘草汤的特征图谱包括14个特征峰。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述芍药甘草汤的特征图谱中甘草苷色谱峰为S峰，其余所述特征峰与所述S峰的相对保留时间在规定值的±5％之内。

11.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述测定指标成分含量的步骤包括：取白芍饮片和炙甘草饮片，测定白芍饮片和/或炙甘草饮片中指标成分的含量，以所述白芍饮片和炙甘草饮片制备芍药甘草汤供试品溶液；

根据所述白芍饮片和/或炙甘草饮片中指标成分的含量，与所述芍药甘草汤供试品中指标成分的含量，获得所述芍药甘草汤供试品中指标成分的转移率。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，测定白芍饮片中指标成分的含量的步骤包括：制备白芍饮片对照品溶液，

制备白芍饮片供试品溶液，

对所述白芍饮片对照品溶液和供试品溶液进行超高液相色谱检测，获得各自的超高液相色谱图，根据所述超高液相色谱图测定所述白芍饮片中芍药苷的含量；

和/或，测定炙甘草饮片中指标成分的含量的步骤包括：

制备炙甘草饮片对照品溶液，

制备炙甘草饮片供试品溶液，

对所述炙甘草饮片对照品溶液和供试品溶液进行超高液相色谱检测，获得各自的超高液相色谱图，根据所述超高液相色谱图测定所述炙甘草饮片中甘草苷和甘草酸的含量。

13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，对所述白芍饮片对照品溶液和供试品溶液进行超高液相色谱检测的色谱条件为：采用二元流动相进行梯度洗脱，流动相A为0.1％磷酸水溶液，流动相B为乙腈，流动相A与流动相B的体积比为43:7；色谱柱为Thermo Accucore C18色谱柱，150mm×2.1mm，2.6μm；进样量为5μL，柱温为30℃，流速为0.4mL/min；

检测波长为237nm；和/或，

对所述炙甘草饮片对照品溶液和供试品溶液进行超高液相色谱检测的色谱条件为：采用二元流动相进行梯度洗脱，流动相A为0.05％磷酸水溶液，流动相B为乙腈，流动相A与流动相B的体积比为(95‑77)：(5‑23)；色谱柱为Thermo Accucore C18色谱柱，150mm×2.1mm，

2.6μm；进样量为3μL，柱温为30℃，流速为0.4mL/min；检测波长为237nm。

14.根据权利要求1‑4任一项所述的方法，其特征在于，所述制备芍药甘草汤供试品溶液的步骤包括：称取质量比为1:1的白芍饮片和炙甘草饮片，加入固液比(g:mL)为1:25的水煎煮，一次滤过，得到芍药甘草汤标准汤剂；按照1:1的体积比向芍药甘草汤标准汤剂中精密加入甲醇，混匀，离心，取上清液二次滤过，所得续滤液即为芍药甘草汤供试品溶液；或者，称取质量比为1:1的白芍饮片和炙甘草饮片，加入固液比(g:mL)为1:25的水煎煮，一次滤过，得到芍药甘草汤的标准汤剂；精密吸取芍药甘草汤的标准汤剂，冷冻干燥，得到芍药甘草汤对应实物；将芍药甘草汤对应实物复溶于50％的甲醇中，超声、冷却，定容，离心，取上清液二次滤过，所得续滤液即为芍药甘草汤供试品溶液；或者，取芍药甘草汤颗粒，精密加入50％甲醇，密塞，称定重量，超声，放冷，再称定重量，用

50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，所得滤液即为芍药甘草汤供试品溶液。

15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述煎煮的条件为：在第一功率条件下加热至微沸，调节功率为第二功率，保持微沸继续加热45‑50min。

16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述第一功率为500W，所述第二功率为

300W。

17.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述一次滤过是用150目筛网过滤，所述二次滤过是用0.22μm滤膜过滤，所述离心是12000rpm离心5min。

18.根据权利要求1‑4任一项所述的方法，其特征在于，制备芍药甘草汤对照品溶液的步骤包括：取芍药苷对照品，精密称定，加入固液比(mg:mL)为(1.2‑1.4)：1的甲醇进行定容，得到包含芍药苷的芍药甘草汤对照品溶液；

取甘草苷对照品，精密称定，加入固液比(mg:mL)为(1‑1.2)：1的甲醇进行定容，得到包含甘草苷的芍药甘草汤对照品溶液；

取甘草酸对照品，精密称定，加入固液比(mg:mL)为(0.8‑1)：1的甲醇进行定容，得到包含甘草酸的芍药甘草汤对照品溶液。

说明书

芍药甘草汤的质量控制方法

技术领域

[0001] 本发明属于中药分析技术领域，具体涉及一种芍药甘草汤的质量控制方法。

背景技术

[0002] 近年来，中药以及中药制剂在世界各地的需求快速增长，作为中医药理论的精髓，中药组方以其独特的配伍规律与优越的药理疗效，在数千年的临床治疗中起到了关键作用。然而，由于中药成分复杂，中药组方更因不同药物之间的拮抗或协同、剂量差异、四气五味、升降沉浮等复杂作用而表现出特殊的复杂性，使其缺乏整体质量监控技术，中药组方鉴别与质量控制成为影响中药发展的重要问题。

[0003] 芍药甘草汤(Shaoyao‑Gancao‑Decoction，SGD)源于张仲景之《伤寒杂病论》。该方组方精简，疗效显著，被历朝历代医家推崇，沿用至今，并且在其基础上加减化裁，用于治疗不同的病证，被广泛应用于古、现代中医临床。现代药理学研究和临床实践也证实，SGD具有显著的解痉、抗炎镇痛、止咳平喘、保肝利胆、抗HBV病毒、抗纤维化、保护胃黏膜、免疫调节、以及抗过敏、通便、保护跟腱组织等作用，对多种痉挛性疾病、疼痛性疾病、炎症性疾病以及支气管哮喘、帕金森病、便秘等都有显著的治疗作用。作为第一批入选《古代经典名方目录》的复方，SGD的煎煮工艺及质量标准研究对于后续经典名方的开发具有一定的指导意义。

[0004] 中国专利文献CN111624271A公开了一种检测芍药甘草汤对应实物的液相色谱方法、标准指纹图谱和应用。所述方法采用配备有紫外检测器的高效液相色谱仪进行检测，色谱条件如下：流动相：乙腈(A)‑0.05％磷酸水溶液(B)，梯度洗脱0‑1min 14‑17.5％A，1‑5min 17.5‑19％A，5‑6min 19‑20％A，6‑7min 20％A，7‑8min 20‑20.5％A，8‑12min 20.5‑
23％A，12‑30min 23‑36％A，30‑32min 36％A，32‑45min 36‑43％A；色谱柱：Venusil XBP C184.6*150mm，3μm；检测波长230‑240nm；流速：1.0ml/min；柱温20‑30℃。所得芍药甘草汤对应实物标准指纹图谱可以用于进行芍药甘草汤对应实物的质量控制。

[0005] 然而，以上述液相色谱方法对芍药甘草汤供试品溶液进行检测时，供试品芍药苷、甘草苷及甘草酸的色谱峰高度均明显低于对照品中三种指标成分的色谱峰高度，供试品中指标成分液相色谱检测的响应度不高，影响对芍药甘草汤对应实物中指标成分定性或定量检测的准确性。

发明内容

[0006] 发明要解决的问题

[0007] 鉴于现有技术中存在的技术问题，例如：检测芍药甘草汤对应实物的液相色谱方法存在指标成分的色谱峰高度偏低，降低了芍药甘草汤对应实物中指标成分定性或定量检测的准确性的问题。为此，本发明提供了一种芍药甘草汤的质量控制方法，通过优化超高液相色谱检测的色谱条件，可以提高指标成分的响应度，实现对芍药甘草汤中复杂成分的化学成分归属和含量测定，提高对芍药甘草汤的质量控制的准确定和稳定性。

[0008] 用于解决问题的方案

[0009] 本发明提供了一种芍药甘草汤的质量控制方法，其中，所述方法包括如下步骤：

[0010] 供试品溶液制备步骤：取芍药甘草汤标准汤剂、芍药甘草汤对应实物或芍药甘草汤颗粒，制备芍药甘草汤供试品溶液；

[0011] 对照品溶液制备步骤：取单一组分对照品，制备包含单一组分对照品的芍药甘草汤对照品溶液；

[0012] 超高液相色谱检测步骤：通过超高液相色谱对所述芍药甘草汤供试品溶液和对照品溶液进行检测；其中，所述超高液相色谱检测采用二元流动相进行梯度洗脱，流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为乙腈。

[0013] 在一些实施方式中，根据本发明所述的方法，其中，所述超高液相色谱检测为UHPLC‑DAD检测；

[0014] 优选地，所述超高液相色谱的色谱条件还包括：

[0015] 所述流动相A与所述流动相B的体积比为(95‑5)：(5‑95)；

[0016] 所述二元流动相的流速为0.4mL·min‑1；

[0017] 所述超高液相色谱的进样量为5μL；

[0018] 所述超高液相色谱的色谱柱的柱温为30℃，更优选地，所述色谱柱为Thermo Accucore C18色谱柱，150mm×2.1mm，2.6μm。

[0019] 在一些实施方式中，根据本发明所述的方法，其中，所述方法还包括在所述供试品溶液制备步骤之前的如下步骤：

[0020] 药材基原鉴定步骤：取芍药甘草汤的原料药材，提取所述原料药材的基因组DNA，PCR扩增所述基因组DNA的ITS2片段，根据所述PCR扩增的ITS2片段鉴定药材基原；

[0021] 优选地，所述PCR扩增的引物组包括：

[0022] P3，其包含如SEQ ID NO.1所示的序列的核苷酸序列，

[0023] E4，其包含如SEQ ID NO.2所示的序列的核苷酸序列；

[0024] 优选地，所述PCR扩增的条件为：94℃5min，35个循环(94℃30s，55℃30s，72℃90s)，72℃7min。

[0025] 在一些实施方式中，根据本发明所述的方法，其中，所述超高液相色谱检测步骤还包括：

[0026] 测定指标成分含量的步骤：对所述芍药甘草汤供试品溶液和对照品溶液进行超高液相色谱检测，获得各自的超高液相色谱图，根据所述超高液相色谱图测定芍药甘草汤供试品中指标成分的含量；其中，所述指标成分包括芍药苷、甘草苷和甘草酸。

[0027] 在一些实施方式中，根据本发明所述的方法，其中，所述方法还包括：

[0028] 芍药甘草汤的特征图谱构建步骤：对至少两个批次的芍药甘草汤供试品溶液和对照品溶液进行超高液相色谱检测，获得各自的超高液相色谱图，选择其中一个批次的芍药甘草汤供试品溶液的色谱图作为参照图谱，依据参照谱图与所述芍药甘草汤对照品溶液的色谱图确定特征峰，依据所述特征峰确定不同批次的芍药甘草汤供试品的共有峰，得到芍药甘草汤的特征图谱；

[0029] 优选地，所述芍药甘草汤的特征图谱包括14个特征峰，更优选地，所述芍药甘草汤的特征图谱中甘草苷色谱峰为S峰，其余所述特征峰与所述S峰的相对保留时间在规定值的±5％之内。

[0030] 在一些实施方式中，根据本发明所述的方法，其中，所述测定指标成分含量的步骤包括：

[0031] 取白芍饮片和炙甘草饮片，测定白芍饮片和/或炙甘草饮片中指标成分的含量，以所述白芍饮片和炙甘草饮片制备芍药甘草汤供试品溶液；

[0032] 根据所述白芍饮片和/或炙甘草饮片中指标成分的含量，与所述芍药甘草汤供试品中指标成分的含量，获得所述芍药甘草汤供试品中指标成分的转移率。

[0033] 在一些实施方式中，根据本发明所述的方法，其中，所述测定白芍饮片中指标成分的含量的步骤包括：

[0034] 制备白芍饮片对照品溶液，

[0035] 制备白芍饮片供试品溶液，

[0036] 对所述白芍饮片对照品溶液和供试品溶液进行超高液相色谱检测，获得各自的超高液相色谱图，根据所述超高液相色谱图测定所述白芍饮片中芍药苷的含量；

[0037] 和/或，所述测定炙甘草饮片中指标成分的含量的步骤包括：

[0038] 制备炙甘草饮片对照品溶液，

[0039] 制备炙甘草饮片供试品溶液，

[0040] 对所述炙甘草饮片对照品溶液和供试品溶液进行超高液相色谱检测，获得各自的超高液相色谱图，根据所述超高液相色谱图测定所述炙甘草饮片中甘草苷和甘草酸的含量。

[0041] 在一些实施方式中，根据本发明所述的方法，其中，对所述白芍饮片对照品溶液和供试品溶液进行超高液相色谱检测的色谱条件为：采用二元流动相进行梯度洗脱，流动相A为0.1％磷酸水溶液，流动相B为乙腈，流动相A与流动相B的体积比为43:7；色谱柱为Thermo Accucore C18色谱柱，150mm×2.1mm，2.6μm；进样量为5μL，柱温为30℃，流速为0.4mL/min；检测波长为237nm；和/或，

[0042] 对所述炙甘草饮片对照品溶液和供试品溶液进行超高液相色谱检测的色谱条件为：采用二元流动相进行梯度洗脱，流动相A为0.05％磷酸水溶液，流动相B为乙腈，流动相A与流动相B的体积比为(95‑77)：(5‑23)；色谱柱为Thermo Accucore C18色谱柱，150mm×2.1mm，2.6μm；进样量为3μL，柱温为30℃，流速为0.4mL/min；检测波长为237nm。

[0043] 在一些实施方式中，根据本发明所述的方法，其中，所述制备芍药甘草汤供试品溶液的步骤包括：

[0044] 称取质量比为1:1的白芍饮片和炙甘草饮片，加入固液比(g:mL)为1:25的水煎煮，一次滤过，得到芍药甘草汤标准汤剂；按照1:1的体积比向芍药甘草汤标准汤剂中精密加入甲醇，混匀，离心，取上清液二次滤过，所得续滤液即为芍药甘草汤供试品溶液；或者，[0045] 称取质量比为1:1的白芍饮片和炙甘草饮片，加入固液比(g:mL)为1:25的水煎煮，一次滤过，得到芍药甘草汤的标准汤剂；精密吸取芍药甘草汤的标准汤剂，冷冻干燥，得到芍药甘草汤对应实物；将芍药甘草汤对应实物复溶于50％的甲醇中，超声、冷却，定容，离心，取上清液二次滤过，所得续滤液即为芍药甘草汤供试品溶液；或者，

[0046] 取芍药甘草汤颗粒，精密加入50％甲醇，密塞，称定重量，超声，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，所得滤液即为芍药甘草汤供试品溶液；

[0047] 优选地，所述煎煮的条件为：在第一功率条件下加热至微沸，调节功率为第二功率，保持微沸继续加热45‑50min；可选地，所述第一功率为500W，所述第二功率为300W；

[0048] 优选地，所述一次滤过是用150目筛网过滤，所述二次滤过是用0.22μm滤膜过滤，所述离心是12000rpm离心5min。

[0049] 在一些实施方式中，根据本发明所述的方法，其中，所述制备芍药甘草汤对照品溶液的步骤包括：

[0050] 取芍药苷对照品，精密称定，加入固液比(mg:mL)为(1.2‑1.4)：1的甲醇进行定容，得到包含芍药苷的芍药甘草汤对照品溶液；

[0051] 取甘草苷对照品，精密称定，加入固液比(mg:mL)为(1‑1.2)：1的甲醇进行定容，得到包含甘草苷的芍药甘草汤对照品溶液；

[0052] 取甘草酸对照品，精密称定，加入固液比(mg:mL)为(0.8‑1)：1的甲醇进行定容，得到包含甘草酸的芍药甘草汤对照品溶液。

[0053] 发明的效果

[0054] 在一些实施方式中，本发明提供的芍药甘草汤的质量控制方法，能够实现对芍药甘草汤中指标成分的定性、定量分析，为芍药甘草汤的质量评价和临床应用提供重要的参考依据。本发明中通过优化超高液相色谱检测的色谱条件，可以提高指标成分的响应度，提高色谱峰峰高，进而有利于改善对指标成分含量检测的准确性，实现对芍药甘草汤中复杂成分的化学成分归属和含量测定。

[0055] 在一些实施方式中，本发明提供的芍药甘草汤的质量控制方法中，以UHPLC‑DAD进行超高液相色谱检测，具有稳定度高、可靠性好、重现性好等优势。

[0056] 在一些实施方式中，本发明的质量控制方法，还包括药材基原鉴定步骤。通过PCR扩增实现对芍药甘草汤的药材基原追溯，有利于药材真伪鉴定以及物种区分，从药材源头实现对芍药甘草汤的质量控制，保证其药材来源的一致性，提高对芍药甘草汤的质量控制的全面性和准确性。

[0057] 在一些优选的实施方式中，药材基原鉴定步骤中鉴定的甘草药材为乌拉尔甘草，与古方中甘草的药材来源具有一致性，通过本发明的质量控制方法，有利于实现与古方中药材的关键属性一致的目标，充分发挥药材的配伍优势，保证芍药甘草汤的药用效果。

[0058] 在一些实施方式中，本发明的质量控制方法，通过构建芍药甘草汤的特征图谱，可以实现对芍药甘草汤中复杂化学成分的定性、定量评价，实现整体质量的全面控制，通过对芍药苷、甘草苷和甘草酸的指标成分的含量检测方法等进行深入的研究，可以针对每一味药的特性进行方法开发，排除其他成分的干扰，解决了每一味药的检测难点，另外，本发明对芍药苷、甘草苷和甘草酸的含量测定方法适用于工艺参数优选，也适用于成品质量标准中含量测定，说明此含量检测的方法具有重现性，能够更加全面、有效控制芍药甘草汤标准汤剂、对应实物以及中药颗粒的质量。

[0059] 在一些实施方式中，本发明的质量控制方法，测定白芍饮片和/或炙甘草饮片中指标成分的含量，还能够实现对供试品中指标成分的转移率进行测定，从而实现对芍药甘草汤制备工艺的质量控制和参数优化，保证不同批次间制备产品的质量一致性。

附图说明

[0060] 图1示出了实施例1中PCR扩增芍药甘草汤中多基原药材甘草的琼脂糖凝胶电泳检测结果。

[0061] 图2示出了芍药甘草汤标准汤剂S01‑S15的对照特征图谱；其中，峰3：芍药内酯苷；峰4：芍药苷；峰6：甘草苷；峰7：芹糖基甘草苷；峰9：甘草素；峰14：甘草酸。

[0062] 图3示出了芍药甘草汤标准汤剂S01‑S15的特征图谱；其中，峰3：芍药内酯苷；峰4：芍药苷；峰6：甘草苷；峰7：芹糖基甘草苷；峰9：甘草素；峰14：甘草酸。

具体实施方式

[0063] 以下将详细说明本发明的各种示例性实施例、特征和方面。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。

[0064] 另外，为了更好地说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在另外一些实例中，对于本领域技术人员熟知的方法、手段、器材和步骤未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。

[0065] 如无特殊声明，本说明书中所使用的单位均为国际标准单位，并且本发明中出现的数值，数值范围，均应当理解为包含了工业生产中所不可避免的系统性误差。

[0066] 本说明书中，使用“可以”表示的含义包括了进行某种处理以及不进行某种处理两方面的含义。

[0067] 本说明书中，所提及的“一些具体/优选的实施方案”、“另一些具体/优选的实施方案”、“实施方案”等是指所描述的与该实施方案有关的特定要素(例如，特征、结构、性质和/或特性)包括在此处所述的至少一种实施方案中，并且可存在于其它实施方案中或者可不存在于其它实施方案中。另外，应理解，所述要素可以任何合适的方式组合在各种实施方案中。

[0068] 本说明书中，使用“数值A～数值B”表示的数值范围是指包含端点数值A、B的范围。

[0069] 除非另有说明，本文中所使用的术语“对照品”是指用于鉴别、检查、含量测定和校正检定仪器性能的标准物质，通常由国家药品检定机构审查认可，其标准应不低于制品的质量标准。

[0070] 除非另有说明，本文中所使用的术语“质量控制方法”也可称为“质量监测方法”。

[0071] 除非另有说明，本文中所使用的术语“供试品”是指用作检测或鉴定的实验样品。

[0072] 除非另有说明，本文中所使用的术语“精密称定”是指称取重量应准确至所取重量的千分之一，术语“称定”是指称取重量应准确至所取重量的百分之一，术语“精密量取”是指量取体积应准确至所取体积的千分之一，术语“精密吸取”是指通过微量进样器来准确量取样品的操作方式。

[0073] 除非另有说明，本文中所使用的术语“续滤液”是指过滤时弃去初滤液后继续收集的滤液。与初滤液相比，续滤液更加接近样品的真实浓度，因为过滤介质(如滤膜、滤纸等)有可能会吸附溶质，因而造成初滤液中样品浓度偏低；另外，续滤液更加干净，因为被过滤介质吸附的溶质可以形成滤饼，降低了过滤孔径，因而能够截留更微小的微粒。

[0074] 除非另有说明，本文中所使用的术语“二元流动相体系”是指由两种组分组成的流动相，通常将其中一种(优选前者)记为“流动相A”，将另一种(优选后者)记为“流动相B”。例如，在0.1％甲酸水溶液‑乙腈二元流动相体系中，流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为乙腈。但上述标记方法并未固定不变，同样可将乙腈记为流动相A，而将0.1％甲酸水溶液记为流动相B。

[0075] 除非另有说明，本文中所使用的术语“超高效液相色谱”(或称“UPLC”)是指在高效液相色谱(HPLC)的基础上开发一种全新技术，具有填料颗粒小、检测速度快、分析通量大、灵敏度高等特点。更进一步地，本发明中的“超高效液相色谱”是指使用超高效液相色谱‑二极管阵列检测器检测法(UHPLC‑DAD)。

[0076] 除非另有说明，本文中所使用的术语“保留时间”是指被分离组分从进样开始到柱后出现该组分浓度极大值时为止所经历的时间，即从进样开始到出现被分离组分色谱峰的顶点时为止所经历的时间；术语“相对保留时间”是指被分离组分的校正保留时间与标样的校正保留时间之比；术语“校正保留时间”是指被分离组分的保留时间减去空气的保留时间。例如，若空气的保留时间是3s，被分离组分的保留时间是9s，标样的保留时间是15s，则被分离组分的校正保留时间是6s，标样的校正保留时间是12s，被分离组分相对于标样的相对保留时间是0.5。

[0077] 除非另有说明，本文中所使用的术语“转移率”是指指标成分从原料药材中向汤剂中释放的比率。本发明中的转移率通过如下方法计算得出：转移率(％)＝W(mg)/M(mg)*100％；其中：W表示汤剂中指标成分的量(mg)；M表示饮片中指标成分的量(mg)。

[0078] 除非另有说明，本文中涉及溶液浓度百分比“％”是指体积百分比。

[0079] 实验设备：

[0080] 1290Infinity II型超高效液相色谱仪，美国安捷伦公司，包括G7167B型自动进样系统，G7166B型柱温箱，G7117A型二极管阵列检测器(DAD)；BS‑210S型电子分析天平，北京赛多利斯天平有限公司；LD510‑2型电子天平，沈阳龙腾电子有限公司；H1650‑W型台式高速离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；LGJ‑10E真空冷冻干燥机，四环福瑞科仪科技发展有限公司；HDZ20型智能煎药壶，美味世家永达基电器厂，容量2L，额定功率500W，稳定电压220V。

[0081] 材料：

[0082] 对照品芹糖基甘草苷、甘草素、芍药内酯苷，批号分别为18110902、17091402、1701302，质量分数均≥98％，成都普菲德生物技术有限公司；对照品芍药苷、甘草苷、甘草酸铵，批号分别为17041401、L63P‑J7XV、18012902，质量分数依次为98％、93.1％、98％，购自中国食品药品检定研究院；水为娃哈哈纯净水，甲醇、乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。SGD所用饮片均由盛实百草药业有限公司提供，饮片所用药材分别为毛茛科芍药属植物芍药Paeonialactiflora Pall.的干燥根，豆科甘草属植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.的干燥根及根茎，详细信息见表1。

[0083] 表1

[0084]

[0085] 实施例

[0086] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

[0087] 实施例1：鉴定药材基原

[0088] 1、实验步骤：

[0089] 芍药甘草汤中多基原药材甘草用75％乙醇擦拭药材表面后，刮掉外表面，取干燥根茎20‑30mg，用高通量组织研磨仪(Scientz‑48，China)研磨120s(50Hz)成粉末状。使用植物基因组DNA提取试剂盒(Tiangen Biotech(Beijing)Co.，Ltd，批号：DP305‑02)提取总DNA时，其余步骤与试剂盒使用说明书相同。

[0090] 以样品DNA作为模板，选用通用引物对ITS2序列进行PCR扩增，PCR反应条件及通用引物见表，PCR反应体系为mix 12.5μl，正反向引物各1μl，双蒸水6.5μl，DNA4μl，共25μl。将PCR产物送至北京擎科新业生物技术有限公司进行双向测序。

[0091] 表2引物及反应条件

[0092]

[0093] 2、实验结果：

[0094] PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果如图1所示，对PCR扩增片段进行测序后，得到如SEQ ID NO.3‑SEQ ID NO.17所示序列的测序结果，对SEQ ID NO.3‑SEQ ID NO.17所示序列进行比对后，甘草药材全部为乌拉尔甘草。

[0095] 按照经典名方研发的要求，对于不同来源的一味药材，需要确定其具有统一的药材基原，不能以不同的基原进行混用。本实施例中所采用的甘草经过药材基原鉴定后发现统一为乌拉尔甘草。乌拉尔甘草为芍药甘草汤古代复方中常用的采草药材来源，选择以乌拉尔甘草制备芍药甘草汤可以实现与古代复方中关键质量属性一致的目标，充分发挥药用效果。同时，乌拉尔甘草作为原料，其资源丰富、满足大批量制备的需求。

[0096] 实施例2：白芍饮片和炙甘草饮片中指标成分的含量测定

[0097] 1、实验步骤：

[0098] 1.1制备白芍饮片、炙甘草饮片对照品溶液

[0099] 1)芍药苷：取芍药苷对照品，精密称定9.30mg于10mL容量瓶中，甲醇定容，即得。

[0100] 2)甘草苷：取甘草苷对照品，精密称定10.3mg于10mL容量瓶中，甲醇定容(加DMSO0.5mL后甲醇定容)，即得。

[0101] 3)甘草酸：取甘草酸对照品，精密称定9.114mg于10mL容量瓶中，甲醇定容，即得。

[0102] 1.2制备白芍饮片、炙甘草饮片供试品溶液

[0103] 1)白芍饮片供试品溶液：取本品中粉约0.1g，精密称定，置50ml容量瓶中，精密加入50％乙醇35ml，密塞，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，用50％乙醇定容，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

[0104] 2)炙甘草饮片供试品溶液：取本品粉末(过三号筛)约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％乙醇50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用70％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

[0105] 1.3色谱条件

[0106] 1)白芍

[0107] 色谱柱：Thermo Accucore C18色谱柱(2.1mm×150mm，2.6μm)；流动相：磷酸水A(0.1％)‑乙腈B；

[0108] 表3梯度洗脱条件

[0109]时间(min) A％ B％
0 86.00 14.00
15.00 86.00 14.00

[0110] 柱温：30℃；流速：0.4mL/min；检测波长：237nm。

[0111] 供试品溶液进样体积为3μL。

[0112] 2)炙甘草

[0113] 色谱柱：Thermo Accucore C18色谱柱(2.1mm×150mm，2.6μm)；

[0114] 流动相：磷酸水A(0.05％)‑乙腈B；

[0115] 表4梯度洗脱条件

[0116] 时间(min) A％ B％6.00 95.00 5.00
10.00 85.00 15.00
23.50 79.00 21.00
26.50 78.00 22.00
30.50 77.00 23.00

[0117] 柱温：30℃；流速：0.4mL/min；检测波长：237nm。供试品溶液进样体积为3μL。

[0118] 1.4标准曲线

[0119] 1)白芍饮片

[0120] 芍药苷标准曲线：精密吸取对照品溶液0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL分别加到5mL容量瓶中，定容至刻度。每个浓度进样3μL，以芍药苷对照品溶液进样浓度(μg/mg)为横坐标(X)，237nm波长下峰面积为纵坐标(Y)，计算回归方程，y＝7759.9x+2.7061；R2＝0.9978。

[0121] 2)炙甘草饮片

[0122] 甘草苷标准曲线：精密吸取对照品溶液0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL分别加到5mL容量瓶中，定容至刻度。每个浓度进样2μL，以甘草苷对照品溶液进样浓度(μg/mg)为2
横坐标(X)，237nm波长下峰面积为纵坐标(Y)，计算回归方程，y＝9945.4x+13.658；R ＝
0.9994；

[0123] 甘草酸铵标准曲线：精密吸取对照品溶液0.3mL、0.5mL、0.8mL、1mL、2mL分别加到5mL容量瓶中，定容至刻度。每个浓度进样2μL，以甘草酸铵对照品溶液进样浓度(μg/mg)为
2
横坐标(X)，237nm波长下峰面积为纵坐标(Y)，计算回归方程，y＝2417.2x‑42.478；R ＝
0.997。

[0124] 2、实验结果：

[0125] 表5白芍饮片中芍药苷测定结果

[0126]

[0127] 表6甘草饮片中甘草苷测定结果

[0128]

[0129]

[0130] 表7甘草饮片中甘草酸测定结果

[0131]

[0132] 实施例3：芍药甘草汤供试品中指标成分的含量、转移率测定

[0133] 1、实验步骤：

[0134] 1.1芍药甘草汤对照品溶液制备

[0135] 1)芍药苷：取芍药苷对照品，精密称定13.8mg于10mL容量瓶中，甲醇定容，即得。

[0136] 2)甘草苷：取甘草苷对照品，精密称定10.3mg于10mL容量瓶中，甲醇定容，即得。

[0137] 3)甘草酸：取甘草酸对照品，精密称定9.00mg于10mL容量瓶中，甲醇定容，即得。

[0138] 1.2芍药甘草汤供试品溶液制备

[0139] 1)芍药甘草汤标准汤剂的供试品溶液

[0140] 取白芍12g，炙甘草12g，置于煎药壶中，加水600mL并将煎药壶置于加热盘上，调整功率500W煎煮至微沸(大约15min)，调整功率至300W，保持微沸继续煎煮48min，用150目筛网过滤，得药液约300ml，既得芍药甘草汤标准汤剂，并编号S01～S15。

[0141] 精密吸取芍药甘草汤标准汤剂0.8ml，精密加入甲醇0.8ml，涡旋充分混匀，12000rpm离心5min，取上清液用0.22μm滤膜过滤，取续滤液即得芍药甘草汤供试品溶液。

[0142] 2)芍药甘草汤对应实物的供试品溶液

[0143] 精密吸取芍药甘草汤标准汤剂5mL，至于10mL罗口瓶中，放置冷冻干燥机中，待完全冻干后，用50％甲醇复溶，转移至10mL容量瓶中，超声，冷却，定容，12000rpm离心5min，取上清液用0.22μm滤膜过滤，取续滤液，作为芍药甘草汤对应实物的供试品溶液。

[0144] 3)芍药甘草汤颗粒的供试品溶液

[0145] 取芍药甘草汤颗粒，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇，密塞，称定重量，超声20min，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得芍药甘草汤颗粒的供试品溶液。

[0146] 1.3色谱条件

[0147] 色谱柱为Thermo Accucore C18色谱柱(2.1mm×150mm，2.6μm)；

[0148] 流动相：0.1％甲酸水溶液A‑乙腈B；

[0149] 表8梯度洗脱条件

[0150]

[0151] 2、实验结果

[0152] 2.1精密吸取供试品溶液，按照色谱条件进样并测定峰面积，根据外标法计算供试品中芍药苷、甘草苷、甘草酸含量。

[0153] 表9芍药甘草汤物质基准(标准汤剂)指标成分含量

[0154] 编号 芍药苷mg/ml 甘草苷mg/ml 甘草酸mg/mlSGT1 0.5938 0.2168 0.4914
SGT2 0.7226 0.2471 0.4349
SGT3 0.6980 0.1889 0.4479
SGT4 0.6244 0.2236 0.4243
SGT5 0.6736 0.2336 0.4668
SGT6 0.5626 0.1255 0.3241
SGT7 0.6022 0.2333 0.3051
SGT8 0.5442 0.2536 0.4668
SGT9 0.7984 0.1542 0.5935
SGT10 0.6455 0.3104 0.4711
SGT11 0.7215 0.3013 0.5747
SGT12 0.6891 0.2528 0.4397
SGT13 0.8286 0.2514 0.4701
SGT14 0.6069 0.3173 0.5993
SGT15 0.6426 0.2863 0.5769

[0155] 2.2芍药甘草汤对应实物的指标成分含量

[0156] 取芍药甘草汤对应实物的供试品溶液，用与标准汤剂含量测定相同的色谱条件测量峰面积，并计算指标成分含量。

[0157] 表10芍药甘草汤对应实物指标成分含量

[0158] 编号 芍药苷mg/ml 甘草苷mg/ml 甘草酸mg/mlSGT1 0.5822 0.2104 0.4768
SGT2 0.7418 0.2473 0.4266
SGT3 0.6571 0.1828 0.4242
SGT4 0.6036 0.2125 0.4113
SGT5 0.6818 0.2328 0.4599
SGT6 0.5801 0.1265 0.3298
SGT7 0.6105 0.2391 0.3119
SGT8 0.5357 0.2417 0.5501
SGT9 0.7655 0.1494 0.5383
SGT10 0.6436 0.3033 0.4634
SGT11 0.7356 0.3057 0.5810
SGT12 0.6985 0.2559 0.4410
SGT13 0.8473 0.2565 0.4781
SGT14 0.6458 0.3400 0.6424
SGT15 0.6492 0.2844 0.5666

[0159] 表9和表10中分别示出了芍药甘草汤物质基准以及芍药甘草汤对应实物中的指标成分含量

[0160] 表9中示出了芍药甘草汤物质基准中指标成分的含量，包含SGT1～SGT15共15个批次的芍药甘草汤物质基准中芍药苷、甘草苷和甘草酸三种指标成分的含量，可用于对原料药材质量稳定性、以及煎煮工艺的稳定性进行评价。若其中个别批次中指标成分的含量出现偏大或偏小，说明原料药材的质量稳定性差，不适于作为芍药甘草汤的制备原料；或者是煎煮工艺需要进一步优化。由上述表9中数据可知，本发明中制备的不同批次间芍药甘草汤物质基准中指标成分的含量波动小，说明药材稳定性及工艺稳定性好，以上述SGT1～SGT15的指标成分含量可分别确定芍药苷、甘草苷和甘草酸的含量区间，在后续质量评价中，通过判断芍药甘草汤中指标成分的含量是否落入上述区间内，对芍药甘草汤的质量进行评价。

[0161] 表10中示出了芍药甘草汤对应实物中的指标成分含量，反映的是从汤剂到冻干粉的转换后，指标成分的情况。此外，也可反映冻干设备、以及设备的参数对指标成分的影响，用于评价冻干过程中各因素的稳定性。通过比较芍药甘草汤对应实物中的指标成分含量，与标准汤剂中指标成分的含量，还可以评价指标成分在低温、真空等条件下的稳定性。若某批次的某指标成分在低温、真空等条件下不稳定，那么得到的冻干粉中此成分的含量与汤剂相比，会有很大的变化。

[0162] 2.3指标成分转移率测定

[0163] 根据饮片和标准汤剂中指标成分的含量测定结果，按照转移率计算公式计算指标成分转移率，转移率计算公式为：转移率(％)＝W(mg)/M(mg)*100％(W表示标准汤剂中指标成分的含量，M表示饮片中指标成分的含量)。

[0164] 表11指标成分转移率测定

[0165]

[0166]

[0167] 表11示出了指标成分转移率的测定结果，转移率可用于评价指标成分的溶解性，煎煮工艺的稳定性。例如，指标成分的溶解性较好，溶解到汤剂中的量较多，但煎煮时间过长后可能导致其分解成其他成分，通过测定指标成分转移率，可对制备芍药甘草汤的工艺参数进行有效控制，优化工艺过程。

[0168] 实施例4：芍药甘草汤的特征图谱构建

[0169] 1、实验步骤：

[0170] 精密吸取实施例3中编号S01～S15的供试品溶液和对照品溶液，以编号01的供试品溶液作为参照物溶液，按照实施例3中色谱条件进行检测，记录UHPLC‑DAD色谱图。

[0171] 将S01～S15的色谱信息输入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012版)进行分析，设置S01的色谱图为参照图谱(图2)，全谱峰匹配，见图3。结果显示共有峰21个，指认6个。15批芍药甘草汤标准汤剂供试品与对照特征图谱的相似度均＞0.9，符合指纹图谱相似度要求。

[0172] 2、实验结果：

[0173] 图3示出了芍药甘草汤的特征图谱中应有14个特征峰，其中有6个峰应分别与相应的对照品峰保留时间相同，与甘草苷对照品相应的6号峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，相对保留时间在规定值的±5％之内。规定值为：0.29(峰1)、0.54(峰2)、0.62(峰3)、0.71(峰4)、0.92(峰5)、1.00(峰6)、1.07(峰7)、1.78(峰8)、1.81(峰9)、2.66(峰10)、
2.88(峰11)、2.93(峰12)、3.11(峰13)、3.24(峰14)。

[0174] 通过构建特征图谱可为芍药甘草汤的质量评价提供参考依据，对芍药甘草汤中的复杂成分实现定性、定量分析，实现对芍药甘草汤药效的有效控制。

[0175] 以上实施例仅用于阐明本发明的若干实施方案，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明的范围产生任何限制。应当明确的是，对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围之内。