一种抗赤霉病高产小麦的分子标记辅助选育方法转让专利
申请号 : CN202110557331.5
文献号 : CN113273489B
文献日 : 2021-12-17
发明人 : 胡文静 , 张勇 , 高德荣 , 吕国锋 , 张晓祥 , 朱冬梅 , 蒋正宁 , 张春梅 , 江伟 , 吴素兰
申请人 : 江苏里下河地区农业科学研究所
摘要 :
权利要求 :
1.一种抗赤霉病高产小麦的分子标记辅助选育方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤,
步骤S1,亲本选择:在累计推广面积大于500万亩、优良农艺性状且综合抗病性好的小麦品种或者其衍生品种中筛选出同时携带穗粒数增效位点QGns‑3B和粒重增效位点QGW‑Y4的目标材料为母本,同时筛选出携带抗赤霉病主效基因Fhb1和Fhb5的目标品种为父本;
步骤S2,种植父母本,配组杂交,收获F1杂交种;
步骤S3,F1自交,收获自交种F2;
步骤S4,选择综合农艺性状优良、综合抗病性好的单株标记,按照单株收获得到F3;
步骤S5,种植F3,并结合分子标记检测穗粒数增效位点QGns‑3B、粒重增效位点QGW‑Y4、抗赤霉病主效基因Fhb1和Fhb5,选择检测均呈阳性的单株收获得到F4;
步骤S6,将中选F4种植成株行,分子标记检测穗粒数增效位点QGns‑3B、粒重增效位点QGW‑Y4、抗赤霉病主效基因Fhb1和Fhb5基因型,选择阳性株行标记,小麦开花期在标记株行喷施禾谷镰刀菌孢子液接种鉴定发病情况,全生育期考察标记株行的农艺性状,选择综合农艺性状优良、综合抗病性好并且赤霉病抗性达到R级的株行按中选株行混合收获脱粒,千粒重大于42克,亩产量不低于500公斤的为中选F5;
步骤S7,将F5种植成鉴定圃,设长江中下游小麦品种区域试验对照品种扬麦20为农艺性状和产量对照,选择综合农艺性状和综合抗病性好于对照并且赤霉病抗性达到R级,千粒重大于42克、亩产量不低于500公斤的品系;
所述步骤S1‑S7中,所述粒重增效位点QGW‑Y4的检测特异性引物序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示,所述穗粒数增效位点QGns‑3B的检测特异性引物序列如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、 SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7所示,所述抗赤霉病基因Fhb5的连锁SSR标记的特异性引物组序列如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11所示,所述抗赤霉病基因Fhb1的连锁GSM标记的特异性引物组序列如SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13所示。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述喷施禾谷镰刀菌孢子液接种鉴定发病
5 5
情况具体操作为,随机挑选50个穗子喷施浓度5×10~10×10个/mL孢子液接种,接种后立即喷水弥雾保湿,诱发赤霉病,接种后20~26天,当安农8455的病穗率达到75%、感病小穗率达到75%时,停止喷水,调查接种穗子的病小穗数和总小穗数,计算发病小穗率:发病小穗数/总小穗数×100%。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤S1中,亲本选择,在优良农艺性状且综合抗病性好的小麦品种或者其衍生品种中筛选携带穗粒数增效位点QGns‑3B和粒重增效位点QGW‑Y4的目标材料为父本,筛选携带抗赤霉病主效基因Fhb1和Fhb5的目标品种为母本。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述母本为镇麦9号,所述父本为扬麦18。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤S6中,种植苏麦3号、扬麦158、扬麦13和安农8455为赤霉病高抗、中抗、中感和高感为对照。
说明书 :
一种抗赤霉病高产小麦的分子标记辅助选育方法
技术领域
背景技术
粒重可达45.5g~47.5g,比普通品种显著高出5.56%~13.10%,以扬麦4号为亲本育成了
在产量和抗病上均有突破的小麦品种扬麦5号和扬麦158及其衍生品种扬麦11、扬麦16等,
前两个品种均获得国家科学技术进步一等奖,成为我国20世纪80年代末、90年代末种植面
积最大的小麦品种,后面两个品种分别获得江苏省科学技术进步二等奖、中华农业科技一
等奖。扬麦158是我国20世纪末种植面积最大的品种,也是长江中下游历史上推广速度最
快、覆盖率最高的小麦品种,它的育成与推广促成了长江下游建国以来小麦品种第六次大
面积更换,扬麦16连续八年是农业部推介主导小麦品种。以上品种为保障我国的粮食和食
品安全做出了巨大贡献,这些品种的遗传背景中均不携带已知的抗赤霉病主效基因Fhb1~
Fhb7,但其综合抗病性、农艺性状和产量均优良,推测其抗病性和携带的抗病基因与农艺性
状可能无不利连锁,在小麦抗赤霉病遗传改良中更易于被利用。
掘其粒重位点的优异等位变异,并开发成可供育种使用的便捷的连锁分子标记对于选择产
量高的遗传背景的育种工作十分重要。目前暂未有对扬麦4号粒重的遗传基础的公开研究
报道。
逆境等威胁,据统计真菌病害每年可导致全球产量损失15%~20%,其中小麦赤霉病
(Fusarium head blight,FHB)危害尤为严峻,小麦赤霉病是由禾谷镰刀菌等引起的世界性
病害,被称为小麦的“癌症”,不仅造成严重减产,还会产生DON等赤霉毒素危害人畜健康。到
目前为止,在世界范围内赤霉病仍然只能采取预防措施,一旦发病不能控制,只能采取预防
措施。因赤霉病发生受气象条件等影响,发病程度预测难度较大,导致年年预防,造成不必
要的浪费和环境污染,与绿色生产要求相悖。其次,高感小麦品种在重发年份药剂防治收效
甚微,给粮食安全带来风险。近十年我国小麦赤霉病5次大爆发,年发病面积约1亿亩,占小
麦种植面积1/4,重发时减产50%,甚至绝收,小麦赤霉病已成为我国粮食和口粮安全的最
大威胁。长江中下游冬麦区是我国小麦主产区,也是最大的赤霉病重发区,抗赤霉病一直是
该麦区重要的育种目标,但至今未能育成大面积高抗赤霉病品种,赤霉病抗性与高产的矛
盾仍是制约我国小麦育种的重要“卡脖子”问题。因此,创新小麦抗赤霉病高产育种途径和
技术体系,培育具有突破性的抗赤霉病高产小麦品种,对于提升我国抗赤霉病小麦育种总
体水平,增强我国种业核心竞争力,具有重要意义。
造的条件和多年多点的鉴定结果才可靠,这样就会造成育种选择的周期颇长。利用赤霉病
抗源或者抗病基因进行小麦抗赤霉病遗传改良是育种家长期努力的方向。传统的抗源例如
苏麦3号、望水白等农艺性状差,利用其进行赤霉病抗性改良,一直没有取得突破性进展,虽
然选育出一些赤霉病抗性强而稳定的品种(系)如宁7840等,但是农艺性状较差如植株偏高
不抗倒,产量三要素不协调等推测可能其抗病性或者抗性基因与农艺性状存在连锁累赘。
由于赤霉病抗性是受多基因控制的复杂数量性状,如果只依赖一个或极少数抗性基因,而
忽视遗传背景的作用,在赤霉病严重流行年份不足以有效降低危害,并且导入抗病基因的
同时更加要重视农艺性状和产量的提优,否则就会得不偿失。目前还未有报道利用传统抗
源或者抗性基因培育出在生产上可大面积推广的赤霉病抗性与苏麦3号相当(R级)的突破
性品种。
发明内容
Fhb5,F2~F3代在大棚种植加代,同时对株高、抗倒性和生育期等综合农艺性状进行选择,其
中F3开始结合分子标记筛选,中选F4在大田种植成株行,对综合农艺性状(株高、抗倒性、穗
数、穗粒数、生育期)、赤霉病抗性、综合抗病性等进行选择,分子标记辅助聚合产量相关性
状增效位点和抗赤霉病基因,收获后测定千粒重和产量,F5及之后进入鉴定圃和品比圃,抗
赤霉病全面进行综合抗病性、综合农艺性状和产量鉴定,高效培育抗赤霉病高产小麦品种。
QGW‑Y4的目标材料为母本,筛选携带抗赤霉病主效基因Fhb1和Fhb5的目标品种(系)为父
本;
在标记株行喷施禾谷镰刀菌孢子液接种鉴定发病情况,全生育期考察标记株行的农艺性
状,选择综合农艺性状优良、综合抗病性好并且赤霉病抗性达到R级的株行按中选株行混合
收获脱粒,千粒重大于42克,亩产量不低于500公斤的为中选F5;
千粒重大于42克、亩产量不低于500公斤的品系。
Asian wheat lines for resistance to Fusarium head blight.Theoretical and
Applied Genetics,2006,113:308‑320.)方法制备赤霉菌孢子悬浮液,随机挑选50个穗子
5 5
喷施浓度5×10~10×10个/mL孢子液接种,接种后立即喷水弥雾保湿,诱发赤霉病,接种
后20~26天,安农8455的病穗率达到75%、感病小穗率达到75%时,停止喷水,调查接种穗
子的病小穗数和总小穗数,计算发病小穗率:发病小穗数/总小穗数×100%。
的目标材料为父本,筛选携带抗赤霉病主效基因Fhb1和Fhb5的目标品种为母本。
粒重优异等位变异的小麦品种(系),提高育种效率。
Fhb5的小麦品种(系)杂交,聚合产量相关性状增效位点和抗赤霉病基因,实现抗赤霉病与
高产的有机结合和协同提高,使高产得到保证的前提下抗赤霉病等级得到突破,为解决长
江中下游麦区乃至全国的赤霉病危害的提供了有效途径。
附图说明
具体实施方式
范围。需要注意的是,除非另有说明,本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所
属领域技术人员所理解的通常意义。
增效位点QGns‑3B和粒重增效位点QGW‑Y4的母本目标品种镇麦9号;同时筛选出携带抗赤霉
病主效基因Fhb1和Fhb5的父本目标品种扬麦18。
有与扬麦4号相同的增效基因型,但是符合同时携带穗粒数增效位点QGns‑3B和粒重增效位
点QGW‑Y4的目标材料”只有镇麦9号,因此最终选择镇麦9号作为母本。
18,因此最终选择扬麦18作为父本。
牌标记,第二年12月按照单株收获得到F3。
株挂牌标记,CTAB法提取挂牌标记的单株DNA,分子标记检测穗粒数增效位点QGns‑3B、粒重
增效位点QGW‑Y4、抗赤霉病主效基因Fhb1和Fhb5,选择检测均呈阳性的单株于第三年6月按
照单株收获得到F4。
记检测穗粒数增效位点QGns‑3B、粒重增效位点QGW‑Y4、抗赤霉病主效基因Fhb1和Fhb5基因
型,选择阳性株行挂牌标记。小麦开花期在挂牌标记株行随机挑选50个穗子喷施孢子液接
5 5
种(浓度5×10~10×10个/mL),接种后立即喷水弥雾保湿,诱发赤霉病,接种后20~26天,
安农8455的病穗率达到75%、感病小穗率(发病小穗数/总小穗数×100%)达到75%时,停
止喷水,调查接种穗子的病小穗数和总小穗数,计算发病小穗率:发病小穗数/总小穗数×
100%,全生育期考察挂牌标记株行的农艺性状,选择比对照扬麦20早1~3天、株高78~89
厘米、每亩有效穗数大于30万、每穗穗粒数大于38、抗倒性好、锈病、白粉病和黄花叶病等综
合抗性达到与扬麦16相当或者好于扬麦16并且赤霉病发病小穗率的数值介于扬麦158和苏
麦3号之间的株行于来年6月分别按中选株行混合收获脱粒,测定籽粒产量和千粒重,从中
选择亩产不低于500公斤,千粒重大于42克的成F5株系。
赤霉病抗性达到R级,千粒重大于42克、亩产量不低于500公斤的品系。
31.5~32.5万穗,穗粒数42.5~44.5粒,千粒重43.5~44.5克,亩产量509.4公斤~524.7公
斤,同年同点长江中下游区试对照品种扬麦20平均亩产量达到452.7公斤,因此扬ZY18比对
照扬麦20增产12.5%~15.9%(达极显著水平)。赤霉病抗性接种鉴定结果为平均病小穗率
为6.65%,平均严重度是1.12,抗赤霉病,同年同点高感赤霉病的品种安农8455的平均病小
穗率是83.14%,平均严重度是4.75,中抗赤霉病品种扬麦158的平均病小穗率为23.92%,
平均严重度是2.05,公认的抗赤霉病品种苏麦3号的平均病小穗率为5.04%,平均严重度为
1.01,因此扬ZY18抗病等级与苏麦3号相当,是高抗赤霉病的品种。可见,通过本发明的方法
能够聚合产量相关性状增效位点和抗赤霉病基因,实现抗赤霉病与高产的有机结合和协同
提高,使高产得到保证的前提下抗赤霉病等级得到突破,为解决长江中下游麦区乃至全国
的赤霉病危害的提供了有效途径。
17基因型相同的目标材料镇麦9号;采用用于检测小麦抗赤霉病基因Fhb5的连锁标记
WMC752、MAG9482进行PCR扩增得到扩增产物,确定Fhb5位点与望水白基因型相同的目标材
料扬麦18。
PCR buffer 1.0μL、10Mm dNTP 0.2μL、10Mm MgCl2 1.0μL、5U Taq聚合酶0.2μL、5μM的上游
引物0.4μL、5μM的下游引物0.4μL和无菌去离子水5.8μL;所述PCR扩增程序为:(1)94℃预变
性8min,(2)94℃变性30s,(3)Xgpw1145引物55℃退火40s;MAG9482引物52℃退火40s,(4)72
℃延伸30s,36个循环,(5)72℃延伸10分钟;(6)4℃保存。
为阳性,为中选材料,MAG9482目标基因型与望水白和扬麦18相同视为阳性,为中选材料。
同的目标材料扬麦18。
PCR buffer 1.0μL、10Mm d NTP 0.2μL、10Mm MgCl2 1.0μL、5U Taq聚合酶0.2μL、5μM的上
游引物0.4μL、5μM的下游引物0.4μL和无菌去离子水5.8μL;所述PCR扩增程序为:94℃预变
性5min;94℃变性30s,64℃退火30s,72℃延伸45s,35个循环;72℃延伸10分钟;4℃保存。
基地(江苏扬州),试验当年扬州的小麦播期设为10月25日,试验采用随机区组设计,3行区,
2次重复,每行40粒,行长1.33m,行距0.23m。田间施肥及管理参照当地大田栽培生产,及时
防治病虫草害,2015年和2016年的6月待小麦成熟时各株系按小区人工收获,收获晒干后在
室内调查RIL群体及亲本的千粒重。参照GB5519—88粮食和油料千粒重的测定方法(自然水
分千粒重法),数500粒小麦籽粒,每个样品重复2次,换算成千粒重,取其平均值为该株系千
粒重。两次试验结果允许误差不超过6%;若超出允许误差则重新测定。
JoinMap v4.0构建和校正遗传图谱,利用Map Chart2.3(https://www.wur.nl/en/show/
Mapchart.htm)绘制遗传图谱。利用IciMapping v4.1的完备区间作图法(Inclusive
composite interval mapping,I CIM)检测与粒重显著相关的QTL,LOD阈值设为2.5。为了
与前人结果比较,将连锁标记或者基因序列与中国春参考基因组序列的EnsemblPlants数
据库(http://plants.ensembl.org/)进行比对。
区间为Marker111588547~Marker111662588(附图2、表3),相距0.09个cM,表型贡献率达到
15.31%~20.57%(表3)。
Marker111588547~Marker111662588,经过查阅文献和与小麦参考基因组比对发现该位置
位于4B染色体长臂514.87Mb~519.40Mb,较精细,未见相同或者相近物理位置上已有粒重
QTL/基因的相关报道(482.82Mb,参考文献:Jia H,Wan H,Yang S,Zhang Z,Kong Z,Xue S,
Zhang L,Ma Z(2013)Genetic dissection of yield‑related traits in a recombinant
inbred line population created using a key breeding parent in China’s wheat
breeding.Theor Appl Genet 126:2123–2139;610.56Mb,参考文献:Huang XQ,Cloutier
S,Lycar L,Radovanovic N,Humphreys DG,Noll JS,Somers DJ,Brown PD(2006)
Molecular detection of QTLs for agronomic and quality traits in a doubled
haploid population derived from two Canadian wheats(Triticum aestivum L.)
.Theor Appl Genet 113:753–766)申请人进一步从QTL区间中依据标记同源性初步筛选
SNP标记,选择区间中特异性高、与粒重相关性最高的SNP标记进行KASP标记转化,确定
Marker111662588标记的基因组特异性最好、与粒重相关性最显著,其侧翼序列是5’‑
CTTGACCACCCTACAGGTGAAGGGGAGAAT TAGCC[A/G]GTTTATGCTCTAAGGAGTACATTGATACGTCTCCA‑
3’(SEQ ID NO.14),利用Polymarker(http://polymarker.tgac.ac.uk/)进行KASP引物设
计,引物由北京嘉程生物科技有限公司合成。最终成功将Marker111662588标记转化为KASP
标记GW‑Y4,其对应的变异位点是A/G,即核苷酸序列SEQ ID NO.14自5’端起第36位碱基存
在A/G等位基因(SNP)位点;小麦育种来说,粒重高的是优势等位变异,扬麦4号携有优势等
位变异A,携有等位基因A的小麦千粒重高于含有等位基因G的小麦。
等位变异碱基A/G。
M),用无菌超纯水补充至100μL,充分混匀,作为KASP标记的引物工作液,备用。
应体系中不添加模板DNA的空白对照(NTC),每个板设置1个或多个空白对照。
采用如上KASP引物组、PCR试剂进行PCR扩增,获得PCR扩增产物。PCR反应在S1000 Thermal
Cycler PCR仪(Bio‑R ad Laboratories Inc.)上进行,用多功能酶标仪(PHERAstar Plus,
BMGLABTECH,Germany)对PCR扩增产物进行扫描读取荧光值。FAM激发波长为485nm,发射波
长为520nm;VIC激发波长为535nm,发射波长为556nm,系统参比荧光ROX激发波长为575nm,
发射波长为610nm。采用Kluster Caller软件(KBioscience)进行基因分型,根据分析结果
确定粒重相关位点连锁的SNP标记Marker111662588的基因型。
型结果荧光信号坐标系中靠近X轴的位置(蓝色),与扬麦4号相同,即证明这些小麦在分子
标记Marker111662588侧翼核苷酸序列(如SEQ ID NO.14)的第36位碱基(SNP位点)的基因
型为A;而扩增产物的荧光信号数据经Kluster Caller软件分析聚集在坐标系中靠近Y轴的
位置(红色),与扬麦4号分型不同,则证明这些小麦在该SNP位点的基因型为G;附图3中左下
角显示为黑色的样本为空白对照。151个家系连同两个亲本的KASP检测结果、2015年和2016
年大田试验收获后测定的粒重两年的平均结果如表5和附图3所示。
因型为A,偃展1号基因型为G,151个家系中基因型为A的家系比基因型为G的家系2015年和
2016年两年千粒重平均值高8.12%,在p<0.01水平上有显著差异,说明上述KASP标记GW‑Y4
的引物组及基因型检测体系可以应用于小麦粒重分子标记辅助育种中(表8统计方法为本
领域常规方法,具体也可以参见文献“盖钧镒,《试验统计方法》,中国农业出版社,2000年9
月”中公开的内容)。附图3显示材料分型结果良好,材料分型与芯片检测数据完全一致,说
明KASP标记开发成功,可进一步用于育种材料检测。
重复,每行40粒,行长1.33m,行距0.23m。田间施肥及管理参照当地大田栽培生产,及时防治
病虫草害,2015年和2016年的6月待小麦成熟时各株系按小区人工收获,收获晒干后在室内
调查群体及亲本的千粒重。参照GB5519—88粮食和油料千粒重的测定方法(自然水分千粒
重法),数500粒小麦籽粒,每个样品重复2次,换算成千粒重,取其平均值为该株系千粒重。
两次试验结果允许误差不超过6%;若超出允许误差则重新测定。
平均值以及KASP检测结果如表6和附图4所示。扩增产物的荧光信号数据经Kluster Caller
软件分析聚集在分型结果荧光信号数据经Kluster Caller软件分析聚集与扬麦4号相同,
即证明这些小麦品系在分子标记Marker111662588的基因型为A;若小麦品系的扩增产物的
荧光信号数据经Kluster Caller软件分析聚集与扬麦4号分型不同,则证明这些小麦品系
在该SNP位点的基因型为G(表3)。
果t=3.5;2016年基因型为A的品种比基因型为G的品种千粒重平均值高11.53%,T测验结
果t=5.17;2015年和2016年基因型为A的品种比基因型为G的品种平均千粒重高9.12%,T
测验结果t=4.77,均在p<0.01水平上有极显著差异,表明含有等位基因A的小麦千粒重高
于含有等位基因G的小麦。同时说明上述KASP标记引物组及基因型检测体系可以应用于小
麦千粒重的分子标记辅助选择育种中。
相同的目标材料镇麦9号。
系中靠近X轴的位置(蓝色),与扬麦4号相同,即证明这些小麦在分子标记GW‑Y4侧翼核苷酸
序列(如SEQ ID NO.14)的第36位碱基(SNP位点)的基因型为A,是中选材料;而扩增产物的
荧光信号数据经Kluster Caller软件分析聚集在坐标系中靠近Y轴的位置(红色),与扬麦4
号分型不同,则证明这些小麦在该SNP位点的基因型为G;附图5中左下角显示为黑色的样本
为空白对照。
不是作为限制,因此,示例性实施例的其他示例可以具有不同的值。