本发明提供了一种具有抗衰老作用的菠萝提取液组合物，其特征在于，所述菠萝提取液组合物由以下成分的原料提取制备得到：菠萝、燕麦、木瓜、罗汉果、葛根粉、植物油和水，还提供了其制备方法和应用。本发明人通过试验证明，本发明的菠萝提取液组合物能够增加细胞内相关过氧化物的降解，减少UVA照射后细胞内的MDA含量，增加细胞内相关过氧化物的降解，从而减少过氧化对细胞的损伤，达到抗衰老的功效。
1.一种具有抗衰老作用的菠萝提取液组合物，其特征在于，所述菠萝提取液组合物由以下成分的原料提取制备得到：菠萝、燕麦、木瓜、罗汉果、葛根粉、植物油和水；且所述菠萝提取液组合物通过将燕麦和水制备的燕麦预处理液与含有菠萝、木瓜、罗汉果的混合预处理液混合后再加入葛根粉、植物油制得；其中，所述菠萝提取液组合物中各成分的质量份数为：菠萝0.01～5份，燕麦0.1～10份，木瓜
0.01～5份，罗汉果0.01～5份，葛根粉0.5～10份、水100份；并且，所述混合预处理液与所述燕麦预处理液的质量比为1:10。
2.根据权利要求1所述的菠萝提取液组合物，其特征在于，所述植物油选自以下一种或多种：橄榄油、青刺果油、澳洲坚果油、牡丹籽油、椿花油。
3.根据权利要求2所述的菠萝提取液组合物，其特征在于，菠萝0.05～2份，燕麦0.5～5份，木瓜0.1～1份，罗汉果0.1～1份，葛根粉1～8份、水100份。
4.根据权利要求3所述的菠萝提取液组合物，其特征在于，菠萝0.1～1份，燕麦0.5～2份，木瓜0.1～0.5份，罗汉果0.1～0.5份，葛根粉2～5份、水100份。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的菠萝提取液组合物的制备方法，其特征在于，所述菠萝提取液组合物通过以下方法制备：(1)将燕麦和水混合静置，得到燕麦预处理液；
(2)菠萝、木瓜、罗汉果分别清洗、去皮、切块，与水按比例混合后打浆静置，得到混合预处理液；
(3)将步骤(1)所得燕麦预处理液与步骤(2)所得混合预处理液混合加热搅拌，冷却过滤留上清液；
(4)向步骤(3)中所得上清液中加入葛根粉和植物油，均质得到所述菠萝提取液组合物。
6.根据权利要求5所述的菠萝提取液组合物的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中：所述静置时间为1～5小时。
7.根据权利要求6所述的菠萝提取液组合物的制备方法，其特征在于，所述静置时间为
8.根据权利要求7所述的菠萝提取液组合物的制备方法，其特征在于，所述静置时间为
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述燕麦粉碎后过60～100目筛；
所述燕麦和水的质量比为1:1～500；和/或所述静置时间为8～60小时。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述燕麦粉碎后过80目筛；
所述燕麦和水的质量比为1:5～200；和/或所述静置时间为12～48小时。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述燕麦和水的质量比为1:20～100；和/或所述静置时间为24小时。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述燕麦和水的质量比为1:50。
13.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述菠萝和水的质量比为1:1～150；
所述木瓜和水的质量比为1:1～200；和/或所述罗汉果和水的质量比为1:1～200。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述菠萝和水的质量比为1:10～100；
所述木瓜和水的质量比为1:10～150；和/或所述罗汉果和水的质量比为1:10～150。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述菠萝和水的质量比为1:20～80；
16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述菠萝和水的质量比为1:20～50；
17.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，步骤(2)所得混合预处理液与步骤(1)所得燕麦预处理液的质量比为1:1～100。
18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，步骤(2)所得混合预处理液与步骤(1)所得燕麦预处理液的质量比为1:1～50。
19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，步骤(2)所得混合预处理液与步骤(1)所得燕麦预处理液的质量比为1:1～20。
20.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述加热温度为20～90℃；
所述加热时间为0.5～5小时；和/或所述搅拌速率为50～500r/min。
21.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述加热温度为25～85℃；
所述加热时间为0.5～4小时；和/或所述搅拌速率为50～300r/min。
22.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述加热温度为30～80℃；
23.根据权利要求22所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述加热温度为40～60℃；
24.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述葛根粉与步骤(3)所得上清液的质量比为1:10～200；和/或所述均质时间为1～60分钟。
25.根据权利要求24所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述葛根粉与步骤(3)所得上清液的质量比为1:10～100；和/或所述均质时间为5～50分钟。
26.根据权利要求25所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述葛根粉与步骤(3)所得上清液的质量比为1:20～80；和/或所述均质时间为5～30分钟。
27.根据权利要求26所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述葛根粉与步骤(3)所得上清液的质量比为1:25～50；和/或所述均质时间为15～20分钟。
28.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法还包括以下步骤：(5)对步骤(4)所得菠萝提取液组合物进行灭菌处理。
29.根据权利要求28所述的方法，其特征在于，所述灭菌处理方式为加热灭菌。
30.根据权利要求29所述的方法，其特征在于，所述加热灭菌温度为60～100℃；和/或所述加热灭菌时间为1～5小时。
31.根据权利要求30所述的方法，其特征在于，所述加热灭菌温度为70～90℃；和/或所述加热灭菌时间为1～3小时。
32.根据权利要求31所述的方法，其特征在于，所述加热灭菌温度为80℃；和/或
33.一种菠萝提取液组合物在制备抗衰老产品中的应用，其特征在于，所述菠萝提取液组合物包含菠萝、燕麦、木瓜、罗汉果和葛根粉；其中，所述菠萝提取液组合物为权利要求1至4中任一项所述的菠萝提取液组合物或根据权利要求5至32中任一项所述方法制备的菠萝提取液组合物。
具有抗衰老作用的菠萝提取液组合物、其制备方法和应用
技术领域
[0001] 本发明属于化妆品领域，具体涉及一种具有抗衰老作用的菠萝提取液组合物、其制备方法和应用。
背景技术
[0002] 天然化妆品如今越来越受到人们的青睐。天然化妆品，除了配方成分天然以外，同时不添加香精、防腐剂等具有潜在刺激性成分。
[0003] 酶解作为一种广泛应用于食品、药品及化妆品领域的技术，可将大分子成分改造成小分子，并伴随多糖、多肽等其他活性物质产生。植物中含有的酶多种多样，有蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶、酯酶等，利用植物中含有的酶可以将大分子蛋白质酶解成寡肽，将淀粉、纤维素酶解成寡糖，将脂肪酶解成甘油、脂肪酸。将这些产物应用在化妆品中，更有利于皮肤吸收功效成分，最终达到一定的功效。
发明内容
[0004] 因此，本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种具有抗衰老作用的菠萝提取液组合物、其制备方法和应用。
[0005] 为实现上述目的，本发明的第一方面提供了一种具有抗衰老作用的菠萝提取液组合物，其特征在于，所述菠萝提取液组合物由以下成分的原料提取制备得到：菠萝、燕麦、木瓜、罗汉果、葛根粉、植物油和水；且所述菠萝提取液组合物通过将燕麦和水制备的燕麦预处理液与含有菠萝、木瓜、罗汉果的混合预处理液混合后再加入葛根粉、植物油制得。
[0006] 根据本发明第一方面的菠萝提取液组合物，其中，所述植物油选自以下一种或多种：橄榄油、青刺果油、澳洲坚果油、牡丹籽油、椿花油；和/或
[0007] 所述菠萝提取液组合物中各成分的质量份数为：菠萝0.01～5份，燕麦0.1～10份，木瓜0.01～5份，罗汉果0.01～5份，葛根粉0.5～10份、水100份；
[0008] 优选地，菠萝0.05～2份，燕麦0.5～5份，木瓜0.1～1份，罗汉果0.1～1份，葛根粉1～8份、水100份；
[0009] 更优选地，菠萝0.1～1份，燕麦0.5～2份，木瓜0.1～0.5份，罗汉果0.1～0.5份，葛根粉2～5份、水100份。
[0010] 本发明的第二方面提供了第一方面所述菠萝提取液组合物的制备方法，所述方法包括以下步骤：
[0011] (1)将燕麦和水混合静置，得到燕麦预处理液；
[0012] (2)菠萝、木瓜、罗汉果分别清洗、去皮、切块，与水混合打浆，室温静置，得到混合预处理液；
[0013] (3)将步骤(1)所得燕麦预处理液与步骤(2)所得混合预处理液混合加热搅拌，冷却过滤留上清液；
[0014] (4)向步骤(3)中所得上清液中加入葛根粉和植物油，均质得到所述菠萝提取液组合物。
[0015] 根据本发明第二方面的方法，其中，步骤(1)中，所述燕麦粉碎后过60～100目优选为80目筛；
[0016] 所述燕麦和水的质量比为1:1～500，优选为1:5～200，更优选为1:20～100，最优选为1:50；和/或
[0017] 所述静置时间为8～60小时，优选为12～48小时，最优选为24小时。
[0018] 根据本发明第二方面的方法，其中，步骤(2)中，所述菠萝和水的质量比为1:1～150，优选为1:10～100，更优选为1:20～80，最优选为1:20～50；
[0019] 所述木瓜和水的质量比为1:1～200，优选为1:10～150，更优选为1:20～100，最优选为1:50～80；
[0020] 所述罗汉果和水的质量比为1:1～200，优选为1:10～150，更优选为1:20～100，最优选为1:50～80。
[0021] 根据本发明第二方面的方法，其中，步骤(3)中，步骤(2)所得混合预处理液与步骤(1)所得燕麦预处理液的质量比为1：1～100，优选为1：1～50，更优选为1:1～20，最优选为1：10。根据本发明第二方面的方法，其中，步骤(3)中，所述加热温度为20～90℃，优选为25～85℃，更优选为30～80℃，进一步优选为40～60℃；
[0022] 所述加热时间为0.5～5小时，优选为0.5～4小时，更优选为1～3小时，进一步优选为1～2小时；和/或
[0023] 所述搅拌速率为50～500r/min，优选为50～300r/min，更优选为50～200r/min，进一步优选为50～150r/min。
[0024] 根据本发明第二方面的方法，其中，步骤(4)中，所述葛根粉与步骤(3)所得上清液的质量比为1:10～200，优选为1:10～100，更优选为1:20～80，最优选为1:25～50；和/或[0025] 所述均质时间为1～60分钟，优选为5～50分钟，更优选为5～30分钟，进一步优选为15～20分钟。
[0026] 根据本发明第二方面的方法，其中，所述方法还包括以下步骤：
[0027] (5)对步骤(4)所得菠萝提取液组合物进行灭菌处理；
[0028] 优选地，所述灭菌处理方式为加热灭菌；
[0029] 更优选地，所述加热灭菌温度为60～100℃，优选为70～90℃，最优选为80℃；和/或所述加热灭菌时间为1～5小时，优选为1～3小时，最优选为2小时。
[0030] 本发明的第三方面提供了一种菠萝提取液组合物在制备抗衰老产品中的应用，所述菠萝提取液组合物包含菠萝、燕麦、木瓜、罗汉果和葛根粉；
[0031] 优选地，所述菠萝提取液组合物为第一方面所述的菠萝提取液组合物或根据第二方面所述方法制备的菠萝提取液组合物。
[0032] 本发明菠萝提取液组合物的制备方法包括以下步骤：
[0033] (1)将燕麦和水混合制备预处理液。室温静置24小时。
[0034] (2)将菠萝、木瓜、罗汉果与水混合打浆，加入(1)中，加热搅拌，过滤。
[0035] (3)将葛根粉加入(2)提取液中。再加入植物油均质得到所述菠萝提取液组合物。
[0036] (4)100℃ 2h灭菌，无菌条件下灌装。
[0037] 步骤(1)中，所述燕麦和水的比例为1:1～500g/mL，优选为1:5～300g/mL，更优选为1:20～200g/mL，最优选为1:100g/mL；
[0038] 步骤(2)中，所述菠萝和水的比例为1:1～150g/mL，优选为1:10～100g/mL，更优选为1:20～80g/mL，最优选为1:50g/mL；
[0039] 所述木瓜和水的比例为1:1～200g/mL，优选为1:10～150g/mL，更优选为1:20～100g/mL，最优选为1:80g/mL；
[0040] 所述罗汉果和水的比例为1:1～200g/mL，优选为1:10～150g/mL，更优选为1:50～100g/mL，最优选为1:80g/mL；
[0041] 所述加热温度为1～150℃，优选为10～100℃，更优选为20～100℃，最优选为40℃；
[0042] 所述加热时间为1～10小时，优选为1‑8小时，更优选为1～5小时，最优选为4小时[0043] 所述搅拌速率为10～600r/min，优选为10～500r/min，更优选为10～300r/min，最优选为150r/min。
[0044] 步骤(3)中，所述葛根粉和提取液的比例为1:1～100g/mL，优选为1:5～80g/mL，更优选为1:10～70g/mL，最优选为1:50g/mL；
[0045] 植物油的加入量为1～30％，优选为1～20％；更优选为1～10％，最优选为3％；
[0046] 所述均质速度为1000～8000r/min，优选为1000～7000r/min，更优选为2000～6000r/min；最优为5000r/min；
[0047] 均质时间为1～60分钟，优选为1～50分钟，更优选为10～40分钟，最优选为15分钟。
[0048] 本发明的菠萝提取液组合物可以具有但不限于以下有益效果：
[0049] 本发明提供了一种菠萝提取液组合物在制备具有抗衰老作用的产品中的应用，本发明人通过试验证明，本发明的菠萝提取液组合物能够增加细胞内相关过氧化物的降解，减少UVA照射后细胞内的MDA含量，增加细胞内相关过氧化物的降解，从而减少过氧化对细胞的损伤，达到抗衰老的功效。
附图说明
[0050] 以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
[0051] 图1示出了试验例1中对成纤维细胞内谷胱甘肽过氧化物酶(GSH‑Px)的影响。
[0052] 图2示出了试验例2中成纤维细胞内脂质过氧化物含量的影响。
[0053] 图3示出了试验例3中过氧化氢标准曲线。
[0054] 图4示出了试验例3中过氧化氢酶酶活力的影响。
具体实施方式
[0055] 下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
[0056] 本部分对本发明试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，在上下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。
[0057] 以下实施例中使用的试剂和仪器如下：
[0058] 试剂：
[0059] 菠萝、木瓜、罗汉果，购自广东省湛江市红星农场；
[0060] 燕麦(炒制熟)购自张家口建军燕麦食品有限公司；
[0061] 葛根(干燥粉)购自同仁堂大药房；
[0062] 仪器：
[0063] 均质机，购自IKA。
[0064] 成纤维细胞，黑色素细胞，购自中科院干细胞库；
[0065] 血红细胞，购自北京兴隆动物养殖厂；
[0066] SDS，购自阿拉丁；
[0067] 氯化钠，购自国药；
[0068] 仪器：
[0069] 酶联免疫检测仪，购自Thermo Fisher Scientific OY、型号1510‑00662C。
[0070] 均质机，购自IKA。
[0071] 实施例1
[0072] 本实施例用于说明本发明菠萝提取液组合物的制备方法。
[0073] 1、原料处理
[0074] 菠萝：清洗、去皮、切块。
[0075] 木瓜：清洗、去皮、切块。
[0076] 罗汉果：清洗、去皮、切块。
[0077] 燕麦：粉碎后过80目备用。
[0078] 2、菠萝提取液组合物制备
[0079] (1)燕麦粉与水按照质量比1：50混合，室温静置24小时，得到燕麦预处理液。
[0080] (2)制备混合预处理液，其中，菠萝、木瓜、罗汉果与水添加比例如表1所示，将菠萝、木瓜、罗汉果与水混合打浆，静置2小时，即为混合预处理液。
[0081] 表1混合预处理液的添加比例
[0082] 原料 质量份数水 100
菠萝 5
木瓜 2
罗汉果 2
[0083] (3)(2)中预处理液与(1)燕麦预处理液按照质量比1：10混合，40℃加热2小时，50rad/min进行搅拌；冷却至室温，过滤去除杂质，留上清液(不透明)。
[0084] (4)加入与上清液质量比为1：25的葛根粉，质量比为2％橄榄油，均质机均质15分钟，得到所述菠萝提取液组合物。
[0085] 3、灭菌处理
[0086] 菠萝提取液组合物灌装入面膜袋(含面膜布)。
[0087] 80℃灭菌2小时。
[0088] 实施例2
[0089] 本实施例用于说明本发明菠萝提取液组合物的制备方法。
[0090] 1、原料处理(食品级)
[0091] 菠萝：清洗、去皮、切块。
[0092] 木瓜：清洗、去皮、切块。
[0093] 罗汉果：清洗、去皮、切块。
[0094] 燕麦：粉碎后过80目备用。
[0095] 2、菠萝提取液组合物制备
[0096] (1)燕麦粉与水按照质量比1:100混合，室温静置24小时，得到燕麦预处理液。
[0097] (2)制备混合预处理液，其中，菠萝、木瓜、罗汉果与水添加比例如表2所示，将菠萝、木瓜、罗汉果与水混合打浆，静置2小时，即为混合预处理液。
[0098] 表2预处理液的添加比例
[0099]原料 质量份数
水 100
菠萝 2
木瓜 1.25
罗汉果 1.25
[0100] (3)(2)中预处理液与(1)燕麦预处理液按照质量比1:10混合，60℃加热1小时，150rad/min进行搅拌；冷却至室温，过滤去除杂质，留上清液(不透明)。
[0101] (4)加入与上清液质量比为1：50的葛根粉，3％橄榄油，均质机均质20分钟。
[0102] 3、灭菌处理
[0103] 菠萝提取液组合物灌装入面膜袋(含面膜布)。
[0104] 80℃灭菌2小时。
[0105] 试验例1
[0106] 本试验例用于说明实施例1制备提取液对成纤维细胞内谷胱甘肽过氧化物酶(GSH‑Px)活力的影响。
[0107] 1)细胞裂解液上清制备
[0108] 取对数生长期状态良好的成纤维细胞计数并接种于6孔培养板中，控制每孔细胞5
数5x10 个细胞。在37℃，5％CO2环境下培养过夜，弃培养基，加入少量的PBS(pH＝7.4)以刚
2
好覆盖细胞为宜，随后以UVA刺激细胞，UV辐射量为7J/cm ，空白组不照射。吸弃PBS，加入不同浓度(使成纤维细胞存活率为50％、80％、100％的样品浓度)样品作用细胞24小时(模型组以及空白对照组加入无血清DMEM培养液)。取出，置于冰上，PBS洗涤2次；以细胞刮刀刮下细胞，收集至离心管中，5000r/min离心5min弃上清得到细胞沉淀，后加入200μL裂解液裂解细胞，12000g 4℃下离心5min，取上清得到细胞裂解上清液。
[0109] 2)试剂盒的准备工作：
[0110] a.配制30mM NADPH。在本试剂盒提供的15mg NADPH中加入600微升超纯水，溶解，混匀。
[0111] b.84mM GSH溶液的配制。在14mg GSH中加入550微升超纯水，溶解并混匀。溶液。
[0112] c.GPx检测工作液的配制。
[0113] 表3GPx检测工作液的配制
[0114] 可测定样品数(含对照) 1个样品30mM NADPH 5μL
84mM GSH 5μL
谷胱甘肽还原酶 1.6μL
GPx检测工作液体积 11.6μL
[0115] d.15mM过氧化物试剂溶液的配制。取21.5微升过氧化物试剂(t‑Bu‑OOH)加入10毫升超纯水，混匀，即配制成15mM过氧化物试剂溶液。
[0116] 3)样品测定
[0117] 参考下表4，使用96孔板，依次加入检测缓冲液、待测样品和GPx检测工作液，混匀。加入4微升15mM过氧化物试剂溶液后，反应开始。需适当混匀。
[0118] 表4各溶液加入量
[0119] 空白对照(blank) 样品本底对照 样品谷胱甘肽还原酶 185μL 179‑187μL 175‑183μL
待测样品 — 2‑10μL 2‑10μL
GPx检测工作液 11μL 11μL 11μL
15mM过氧化物试剂溶液 4μL — 4μL
总体积 200μL 200μL 200μL
[0120] 使用荧光酶标仪，每隔2分钟记录A 340值，连续记录10分钟，获得6个点的数据。
[0121] 结果：菠萝提取液组合物对成纤维细胞内谷胱甘肽过氧化物酶酶活力的影响如图1所示。模型组是只通过UVA照射，未添加样品的细胞组，空白组为未照射且未添加样品的细胞组，经试验发现UVA照射使细胞的谷胱甘肽过氧化物酶活力下降，样品组与模型组做统计学差异后发现，本菠萝提取液组合物能够显著提高成纤维细胞的谷胱甘肽过氧化物酶活力，甚至高于阳性对照VC，说明发明提取液能够增加细胞内相关过氧化物的降解，从而减少过氧化对细胞的损伤，达到抗衰老的功效。
[0122] 试验例2
[0123] 本试验例用于说明实施例1制备提取液对成纤维细胞内脂质过氧化物含量的影响。
[0124] 1)样品的准备：
[0125] a.细胞裂解液进行裂解。每100万细胞使用0.1ml裂解液或匀浆液。裂解后，10,000g‑12,000g离心10分钟取上清用于后续测定。裂解等样品制备步骤宜在冰浴或4℃进行操作。
[0126] 2)试剂盒的准备工作：
[0127] a.TBA储存液的配制：称取适量TBA，用TBA配制液配制成浓度为0.37％的TBA储存液。例如18.5mg TBA用5ml TBA配制液配制，最终浓度即为0.37％。TBA配制液需完全溶解后再使用，可以加热到70℃以促进溶解。TBA储存液较难溶解，需加热到70℃，并通过剧烈Vortex以促进溶解。配制好的TBA储存液室温避光保存，至少3个月内有效。
[0128] b.MDA检测工作液的配制:根据待测定的样品数(含对照)，参考下表5在临检测前新鲜配制适量的MDA检测工作液。
[0129] 表5 MDA检测工作液的配制
[0130] 检测次数 1次 10次 20次 50次TBA稀释液 150μl 1500μl 3000μl 7500μl
TBA储存液 50μl 500μl 1000μl 2500μl
抗氧化剂 3μl 30μl 60μl 150μl
[0131] c.标准品的稀释：取适量标准品用蒸馏水稀释至1、2、5、10、20、50μM，用于后续制作标准曲线。
[0132] 3)样品测定:
[0133] a.在离心管或其它适当容器内加入0.1ml匀浆液、裂解液或PBS等适当溶液作为空白对照，加入0.1ml上述不同浓度标准品用于制作标准曲线，加入0.1ml样品用于测定；随后加入0.2ml MDA检测工作液。参考下表设置检测反应体系：
[0134] 表6反应体系的设置
[0135]
[0136]
[0137] b.混匀后，100℃沸水浴加热15分钟。加热时务必注意避免液体暴沸溅出。使用沸水浴，则需使用可把盖子锁死的离心管或螺旋盖离心管，或用Parafilm封住离心管口，用针头刺一小孔。
[0138] c.水浴冷却至室温，1000g室温离心10分钟。取200微升上清加入到96孔板中，随后用酶标仪在532nm测定吸光度。如果不方便测定532nm的吸光度，也可以测定530‑540nm之间的吸光度。
[0139] d.MDA含量的计算：样品可以直接根据标准曲线计算获得MDA的摩尔浓度，计算出样品溶液中的MDA含量后，可以通过单位重量的蛋白含量表示最初样品中的MDA含量，例如μmol/mg蛋白。
[0140] 结果：菠萝提取液组合物对成纤维细胞内的脂质过氧化物含量的影响如图2所示。模型组是只通过UVA照射，未添加样品的细胞组，空白组为未照射且未添加样品的细胞组，经试验发现UVA照射会增加细胞内MDA的含量，样品组与模型组做统计学差异分析发现，本菠萝提取液组合物能极其显著的减少UVA照射后细胞内的MDA含量，减少过量的脂质过氧化物对细胞的损伤，达到抗衰老的功效。
[0141] 试验例3
[0142] 本试验例用于说明实验例2制备提取液面膜对成纤维细胞内过氧化氢酶活力的影响。
[0143] 1)准备工作：
[0144] a.配制250mM过氧化氢溶液。试剂盒提供的过氧化氢浓度约为1M。由于过氧化氢不是非常稳定，使用前需自行测定过氧化氢的实际浓度。把浓度约为1M的过氧化氢用试剂盒提供的过氧化氢酶检测缓冲液稀释100倍，使过氧化氢的浓度约为10mM。测定A240。过氧化氢浓度(mM)＝22.94X A240。从而计算出本试剂盒提供的过氧化氢的实际浓度。然后再根据实际的过氧化氢浓度配制250mM过氧化氢溶液。
[0145] b.配制5mM过氧化氢溶液。根据测定得到的实际过氧化氢浓度配制5mM过氧化氢溶液。
[0146] c.配制显色工作液。在冰浴上溶解显色底物，适当分装后再使用，尽量避免反复冻融。其它试剂放置在冰浴上备用。取适当量的过氧化物酶，按照1:1000的比例用显色底物稀释，配制成显色工作液。例如取5μl过氧化物酶，加入5ml显色底物，混匀即得到5ml显色工作液。
[0147] 2)样品准备：用适当的裂解液裂解细胞或组织，得到样品。3)标准曲线测定：
[0148] a.取0、12.5、25、50、75微升配制好的5mM过氧化氢溶液至1.5ml塑料离心管中，分别加入过氧化氢酶检测缓冲液至最后体积为100微升，混匀。
[0149] b.各取4微升，加入到96孔板中的一个孔内。加入200μl显色工作液。25℃至少孵育15分钟后测定A520，但孵育时间不宜超过45分钟。
[0150] 4)样品测定
[0151] 表7各溶液的添加量
[0152] 空白对照(blank) 样品(sample)
样品体积 0μl 4μl
过氧化氢酶检测缓冲液 40μl 36μl
250mM过氧化氢溶液 10μl 10μl
[0153] a.参考表7，取4微升样品至1.5ml塑料离心管中，加入过氧化氢酶检测缓冲液至体积为40微升，混匀。再加入10微升250mM过氧化氢溶液，用移液器迅速混匀。参考表1，25℃反应5分钟。
[0154] b.加入450微升过氧化氢酶反应终止液，颠倒混匀或Vortex混匀以终止反应。需在终止反应后15分钟内完成下面的步骤c和步骤d。
[0155] c.在一洁净的塑料离心管内加入40微升过氧化氢酶检测缓冲液，再加入10微升已终止并混匀的上述反应体系，混匀。
[0156] d.从上一步骤的50微升体系中取10微升加入到96孔板中的一个孔内。加入200微升显色工作液。
[0157] e.25℃至少孵育15分钟后测定A520，但孵育时间不宜超过45分钟。
[0158] 5)样品中过氧化氢酶酶活力的计算：
[0159] a.计算出标准曲线。A520＝k[过氧化氢微摩尔数]+b，由标准曲线计算出k和b的值。图3示出了试验例3中过氧化氢标准曲线。
[0160] b.计算出样品中残余的过氧化氢微摩尔数。
[0161] 残余过氧化氢微摩尔数＝(A520‑b)/k
[0162] c.过氧化氢酶酶活力单位的定义：1个酶活力单位(1unit)在25℃，pH7.0的条件下，在1分钟内可以催化分解1微摩尔过氧化氢。
[0163] d.对于细胞或组织样品的过氧化氢酶活力计算：
[0164] [样品过氧化氢酶酶活力]＝[消耗过氧化氢微摩尔数]X[稀释倍数]/([反应分钟数]X[样品体积]X[蛋白浓度])
[0165] [样品过氧化氢酶酶活力]的单位为units/mg蛋白
[0166] [消耗过氧化氢微摩尔数]＝[空白对照残余过氧化氢微摩尔数]－[样品残余过氧化氢微摩尔数]
[0167] [稀释倍数]＝250
[0168] [反应分钟数]即为实际的反应分钟数
[0169] [样品体积]为表2中的X微升，以毫升来表示即为X/1000毫升。
[0170] [蛋白浓度]为取X微升样品时，样品中的蛋白浓度，单位为mg/ml。
[0171] 结果：菠萝提取液组合物对成纤维细胞内过氧化氢酶酶活力的影响如图4所示。模型组是只通过UVA照射，未添加样品的细胞组，空白组为未照射且未添加样品的细胞组，经试验发现UVA照射后，细胞内过氧化氢酶酶活力会降低，样品组与模型组做统计学差异分析后可知，本菠萝提取液组合物能够极其显著的增加细胞内过氧化氢酶的酶活力，效果与阳性对照VC相当。说明本面菠萝提取液组合物能够增加细胞内相关过氧化物的降解，从而减少过氧化对细胞的损伤，达到抗衰老的功效。
[0172] 尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可进行各个条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。
