一株高效产酶的枯草芽孢菌株LC1-1及其产酶方法和应用

摘要

本发明涉及一株高效产壳聚糖酶的枯草芽孢菌株LC1‑1及其产酶方法和应用，该菌株于2021年2月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21809。所述枯草芽孢菌株LC1‑1能够在25‑65℃的温度下，pH为4.5‑8的条件下生产出壳聚糖酶，产酶过程无需壳聚糖诱导，通过碳源、氮源优化并对培养基成分优化，所获得的壳聚糖酶的产量高、稳定性好，且能够降解壳聚糖生成单糖、壳三糖和壳四糖，具有良好的应用前景。

权利要求

1.一株产壳聚糖酶的枯草芽孢杆菌（Bacillus sublitis）LC1‑1，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌于2021年2月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21809。

2.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌LC1‑1生产壳聚糖酶的产酶方法，其特征在于所述产酶方法包括如下步骤：（1）发酵：将枯草芽孢杆菌接种于培养基中，在温度为25℃‑65℃， pH为4.5‑8的条件下发酵，得到含有壳聚糖酶的发酵液；

（2）分离：将含壳聚糖酶的发酵液离心，收集上清液；用20% 80％饱和度硫酸铵盐析，从~发酵液中提取壳聚糖酶粗提物，透析除盐；

（3）纯化：采用葡聚糖凝胶柱层析和离子交换层析，获得壳聚糖酶。

3.根据权利要求2所述的生产壳聚糖酶的产酶方法，其特征在于，所述发酵过程中的发酵时间为10‑17小时。

4.根据权利要求2所述的生产壳聚糖酶的产酶方法，其特征在于，所述培养基的碳源浓度为10‑33g/L。

5.根据权利要求4所述的生产壳聚糖酶的产酶方法，其特征在于，所述培养基的碳源浓度为30 g/L或22.7 g/L。

6.根据权利要求2所述的生产壳聚糖酶的产酶方法，其特征在于，所述培养基的氮源浓度为10‑30g/L。

7.根据权利要求6所述的生产壳聚糖酶的产酶方法，其特征在于，所述培养基的氮源浓度为15g/L。

8.根据权利要求2所述的生产壳聚糖酶的产酶方法，其特征在于，所述培养基成分为：碳源浓度为22.7g/L，氮源浓度15g/L；发酵条件为：装液量20%，接种量2.0%，温度34℃，pH为

5.5，转速为180rpm。

9.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌LC1‑1所产的壳聚糖酶，其特征在于，所述的壳聚糖酶的分子量为40‑45kDa。

10.权利要求9所述的壳聚糖酶在降解壳聚糖生产单糖、壳三糖和壳四糖产品中用途。

说明书

一株高效产酶的枯草芽孢菌株LC1‑1及其产酶方法和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及一株高产壳聚糖酶的枯草芽孢菌LC1‑1及其产酶方法和应用。

背景技术

[0002] 壳聚糖是指脱乙酰度高于55％的甲壳素产物，是目前发现的唯一天然阳离子多糖。虽然多项研究表明，壳聚糖在生物医学、农业、废水及废物处理、饮食(食品保鲜剂和防腐剂等)、化妆品领域有十分重要的应用，但由于其分子量较大，水溶性差，其应用也受到一定限制。壳寡糖又称低聚壳聚糖，是壳聚糖进一步降解的产物，分子量普遍低于3000Da，聚合度在2～20之间，水溶性较好，黏度较低，是一种功能性低聚糖。除具备壳聚糖特殊的生理活性外，壳寡糖在抑菌和抗肿瘤等方面生理活性更强。因此壳寡糖比壳聚糖具有更大的应用潜力。

[0003] 目前制备壳寡糖主要有物理法、化学法和酶法降解。利用化学反应制备壳寡糖，所得产物分子量分布范围较广，产品质量不均一，同时化学反应不易控制，容易产生污染，产品上残留的化学物质不易清除，产品的安全性有待考证。物理法制备壳寡糖需要额外的大型设备，投资较高，因此，当前很少有基于物理法的壳寡糖生产方式。酶法降解生产壳寡糖，分子量均一；同时，产品的生产不需要强酸强碱等极端条件，对能源的消耗低，生产过程安全绿色无污染；此外，降解的壳聚糖没有额外的化学物质残留，不需要过多的处理步骤，节约生产成本，产品的安全性也更好，因而酶法降解生产壳寡糖成为研究的热点。

[0004] 起初研究壳聚糖酶时，生物学家从自然界中大量筛选产壳聚糖酶的微生物。随后，国内外研究人员陆续地在细菌、真菌、放线菌中发现壳聚糖酶的存在。从自然界中筛选产酶微生物，主要不足之处在于，产酶效果较差，且一些产酶菌株需要经过诱导才能达到高产酶的效果。据统计，产壳聚糖酶的菌株包括，芽孢杆菌(Bacillus sp.No.7‑M)、环状芽孢杆菌(B.circulans MH‑K)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus HuT6037)、链霉菌属(Streptomyces sp.N174)、曲霉(Aspergillus oryzae)、链霉菌(Streptomyces clavuligerus sp.P1)等。

发明内容

[0005] 基于当前酶法生产壳寡糖的现状，本发明提供了一株能高效产壳聚糖酶的枯草芽孢杆菌，及其在生产壳聚糖酶中的应用。

[0006] 为了实现以上发明目的，本发明采用以下技术方案：

[0007] 本发明提供了一株高效产壳聚糖酶的枯草芽孢杆菌LC1‑1，该枯草芽孢杆菌于2021年2月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21809。

[0008] 进一步的，所述的枯草芽孢杆菌LC1‑1，该菌能够高效生产壳聚糖酶，产酶无需壳聚糖诱导。

[0009] 进一步的，所述枯草芽孢杆菌的菌落为不规则形状，具有叶状边缘，表面色暗，不透明，直径2‑3mm；其菌体在显微镜下为直杆状，芽孢中生。

[0010] 本发明提供了一种枯草芽孢杆菌LC1‑1生产壳聚糖酶的产酶方法，其特征在于，所述产酶方法包括如下步骤：

[0011] (1)发酵：将枯草芽孢杆菌接种于培养基中，在温度为25℃‑65℃，pH为4.5‑8的条件下发酵，得到含有壳聚糖酶的发酵液；

[0012] (2)分离：将含壳聚糖酶的发酵液离心，收集上清液；用20％～80％饱和度硫酸铵盐析，从发酵液中提取壳聚糖酶粗提物，透析除盐；

[0013] (4)纯化：采用葡聚糖凝胶柱层析和离子交换层析，获得壳聚糖酶。

[0014] 进一步的，具体纯化方法为：

[0015] (1)将硫酸铵沉淀得到的粗酶经过透析除盐后，先进行离子交换层析，待活性物质吸附于层析介质后，由低盐浓度缓冲液向高盐浓度缓冲液洗脱，分别收集不同盐浓度缓冲液的洗脱组分，对每一管进行活性测定确定活性峰，将活性溶液收集。

[0016] (2)将收集到的活性物质进一步过葡聚糖凝胶G75，洗脱液为蒸馏水。

[0017] 进一步的，所述发酵温度为25℃～65℃，所述发酵pH为4.5～8。

[0018] 进一步的，所述发酵过程中的发酵时间为10‑17小时。

[0019] 进一步的，所述培养基的碳源浓度为10‑33g/L，优选的，碳源浓度为30g/L、22.7g/L。

[0020] 进一步的，所述培养基的氮源浓度为10‑30g/L，优选的，氮源浓度为15g/L。

[0021] 进一步的，所述培养基成分为：碳源浓度为22.7g/L，氮源浓度15g/L；发酵条件为：装液量20％，接种量2.0％，温度34℃，pH为5.5，转速为180rpm。

[0022] 进一步的，发酵过程中所用的培养基组成重量份比例为酵母粉1～15份、氯化钠1～30份、胰蛋白胨1～30份、蔗糖1～50份、磷酸氢二钾1～10份、磷酸二氢钾1～10份。

[0023] 本发明还提供了枯草芽孢杆菌LC1‑1根据上述方法所产的壳聚糖酶。

[0024] 进一步的，所述的壳聚糖酶的分子量为40‑45kDa。

[0025] 进一步的，所述的壳聚糖酶能够降解壳聚糖生成单糖、壳三糖和壳四糖。

[0026] 进一步的，所述壳聚糖酶在前15min酶促反应迅速，并能于45min到达终点。

[0027] 进一步的，所述的壳聚糖酶能够耐受温度20～70℃，pH为3.7～10.8。

[0028] 进一步的，所述壳聚糖酶通过添加金属离子催化剂调整反应速度。

[0029] 进一步的，所述壳聚糖酶在前15min酶促反应迅速并能于45min到达终点。

[0030] 进一步的，所述壳聚糖酶通过添加金属离子催化剂调整反应速度：可以通过添加2+ 2+ 3+ 2+ 2+
Mn 促进酶促反应；也能够通过添加Zn 和/或SDS和/或Fe 和/或Cu 和/或Fe 抑制酶促反应。

[0031] 与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：

[0032] (1)本发明通过筛选提供了一株高效产壳聚糖酶的枯草芽孢杆菌LC1‑1，该菌株能够高效生产壳聚糖酶，且产酶过程无需壳聚糖诱导，所产酶的分子量为40‑45kDa，且在酸碱条件下稳定，具有一定温度耐受性和pH耐受性。

[0033] (2)本发明通过单因素试验、响应面设计对碳源、氮源、温度、pH值等方面对生产条件进行优化，寻找最适的生产条件，该条件下生产的壳聚糖酶可达到32.23U/ml。

[0034] (3)本发明提供一种壳聚糖酶制备方法，本发明优化工艺过程，在纯化过程中增加离子交换介质纯化和葡聚糖柱层析洗脱步骤，通过碳源、氮源、pH、温度、硫酸铵浓度等因素的摸索，提高壳聚糖酶的产酶效率和工艺生产的实用性。

[0035] (4)本发明提供了一种壳聚糖酶，通常的壳聚糖酶降解壳聚糖的产物多为多糖，本发明所制备的壳聚糖酶能够降解壳聚糖生成成分单一的单糖、壳三糖和壳四糖，产酶速率稳定高效，前15min酶促反应迅速，45min即可达到反应终点。能够广泛地应用在卫生、食品、饲料、养殖、种植等领域。

附图说明

[0036] 图1菌株在65℃条件下在LB培养基中的菌落形态及初筛培养基上的产透明圈情况。

[0037] (a)LC1‑1在LB平板上的菌落形态；

[0038] (b)LC1‑1在初筛培养基上产透明圈情况。

[0039] 图2单因素实验结果。

[0040] (a)接种量对菌株LC1‑1产壳聚糖酶的影响；

[0041] (b)不同发酵温度对菌株LC1‑1产壳聚糖酶的影响；

[0042] (c)pH对菌株LC1‑1产壳聚糖酶的影响；

[0043] (d)转速对菌株LC1‑1产壳聚糖酶的影响；

[0044] (e)装液量对菌株LC1‑1产壳聚糖酶的影响；

[0045] (f)不同碳源对菌株LC1‑1产壳聚糖酶的影响；

[0046] (g)不同氮源对菌株LC1‑1产壳聚糖酶的影响；

[0047] (h)不同碳源浓度对菌株LC1‑1产壳聚糖酶的影响；

[0048] (i)不同氮源浓度对菌株LC1‑1产壳聚糖酶的影响。

[0049] 图3响应面设计结果。

[0050] (a)碳源浓度和温度对壳聚糖酶活影响3D图；

[0051] (b)碳源浓度和温度对壳聚糖酶活的平面图。

[0052] 图4发酵过程中生物量及pH变化曲线。

[0053] (a)发酵罐中LC1‑1的OD600、离线pH和log(CFU)变化；

[0054] (b)发酵罐中LC1‑1的产酶情况与发酵过程中剩余碳源浓度变化。

[0055] 图5发酵罐中补料工艺初探离线pH、OD600及酶活的变化。

[0056] 图6壳聚糖酶硫酸铵沉淀结果。

[0057] 图7壳聚糖酶离子交换色谱层析图谱及酶活曲线。

[0058] 图8葡聚糖凝胶柱层析图谱及酶活曲线。

[0059] 图9SDS‑PAGE结果。Lane 1：Marker；Lane 2：粗提物；Lane 3：离子柱活性峰；Lane 4：离子柱和分子筛后活性峰；Lane 5：离子柱和分子筛后活性峰。

[0060] 图10、图11和图12分别为该酶的温度耐受性、pH耐受性和金属离子表面活性剂对酶活性的影响。

[0061] 图13酶解曲线。

[0062] 图14酶解产物的TLC图。

[0063] 图15酶解产物的LC‑MS图。

具体实施方式

[0064] 下面结合实施例对本发明做进一步说明，所述实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明均可从商业途径得到。

[0065] 实施例1枯草芽孢杆菌LC1‑1菌种鉴定

[0066] 挑取LC1‑1单菌落接种于LB固体平板上，在LB固体培养基上培养24h，LC1‑1在LB培养基中的菌落形态如图1(a)所示，菌落呈不规则形，表面色暗，不透明；可以起皱，在电子显微镜下，该菌体呈直杆状。LC1‑1的生理生化特性参照《Bergey’s OF Systematic Bacteriology Second Edition》(第九版)，对实验菌株进行革兰氏染色、芽孢染色、菌株运动性观察、过氧化氢酶实验、乙醇甲基甲醇(V.P)试验、硝酸盐还原实验、石蕊牛奶实验、厌氧生长实验等方面的生理生化实验，结果显示芽孢染色实验后LC1‑1显示芽孢中生，其余均为阳性结果。

[0067] 表1 LC1‑1生理生化实验结果

[0068]

[0069] 根据菌株的形态学、生理生化特性以及16S rRNA基因序列等信息，已经确定LC1‑1为芽孢杆菌属，在NCBI Genome中下载Bacillus sublitis、Bacillus tequilensis、Bacillus amyloliquefaciensd等3种芽孢杆菌属的全基因组序列，进行ANI比对分析，分析结果见表2。一般来说，95％为现在公认的ANI分类阈值，由表可知，LC1‑1与Bacillus sublitis的ANI分析数值达到98.80％，而其他两种菌均低于95％的鉴定阈值，由此，确定LC1‑1为枯草芽孢杆菌。

[0070] 表2 LC1‑1与其他菌株的ANI对比值

[0071]

[0072] 综上可知该菌为枯草芽孢杆菌，命名为LC1‑1，其菌落特征为：不规则形状，具有叶状边缘，表面色暗，不透明，直径2‑3mm；其菌体在显微镜下为直杆状，芽孢中生。

[0073] 将筛选到的菌株LC1‑1进行菌种保藏，所述的LC1‑1的保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2021年02月04日；枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis的保藏编号：CGMCC No.21809。

[0074] 实施例2枯草芽孢杆菌LC1‑1在平板上65℃下的产壳聚糖酶性能

[0075] 初筛培养基以壳聚糖为唯一碳源，在壳聚糖被降解之后会生成降解后的透明圈。在初筛培养基中产透明圈情况如图1(b)所示，在图1(b)中其透明圈直径与菌落直径比为3。

[0076] 实施例3壳聚糖酶的发酵生产条件优化

[0077] (1)单因素实验

[0078] 分别对培养基成分(碳源、氮源、最适碳源浓度、最适氮源浓度)和发酵条件(温度、pH、转速、装液量、接种量)等因素进行单因素实验(结果见图2)。

[0079] 由图2(a)～(i)可得到最适接种量为2％，最适发酵温度为35℃，最适发酵初始pH为5.5，最适转速为180rpm，装液量为20％，碳源浓度为20g/L，氮源浓度为15g/L，据此进行Minnimum‑Run Equireplicated Res IV设计及响应面优化设计。

[0080] (2)Minnimum‑Run Equireplicated Res IV设计

[0081] 利用Design‑Expert 8.0.6软件设计Minnimum‑Run Equireplicated Res IV实验设计表，对装液量、转速、初始pH、温度、接种量、最适碳源浓度、最适氮源浓度进行7因素两水平的Minnimum‑Run Equireplicated Res IV实验设计优化，其设计因素、水平和结果见表1。其中第7组获得壳聚糖酶最大活性，为35.68U/mL。

[0082] 由Design‑Expert 8.0.6软件设计Minnimum‑Run Equireplicated Res IV实验设计可得碳源浓度和温度为显著性影响因素，适当提高碳源浓度和温度有利于提高壳聚糖酶活。

[0083] 表3 Minnimum‑Run Equireplicated Res IV设计结果

[0084]

[0085] 表4偏回归系数及影响因子的显著性分析

[0086]

[0087] 注：置信度选择95％，*表不该因素是显著性影响因素。

[0088] (3)响应面设计

[0089] 在单因素实验和Minnimum‑Run Equireplicated Res IV设计的基础上，以壳聚糖酶活力为评价指标，对碳源浓度和发酵温度这2个因素进行Box‑Behnken设计响应面实验，中心复合实验结果见表3。

[0090] 采用Design Expert软件对所得数据进行回归分析，得到关于碳源浓度(A)和温度2 2
(B)的二次方程模型：壳聚糖酶活力＝32.21+0.065*A+0.053*B‑0.90*A‑0.91*B。模型的P值＜0.01，说明此模型是显著的；所有一次项全部显著，表明这2项在0.05水平上都是显著
2
的；交互项有2项显著；失拟项不显著；R 为99.79％，表明该模型结果和实验所得数据拟合较好。

[0091] 根据所建立的数学模型进行参数最优化，响应面分析确定蔗糖的浓度是22.7g/L，温度为34℃时可获得壳聚糖酶最大酶活，为32.21U/mL(图3(a))。为检验方法的可靠性，采用得到的最优发酵培养条件进行发酵生产壳聚糖酶实验，在此条件下进行3次平行试验，实际得到壳聚糖酶活性平均值为32.20U/mL，实际值与预测值之间的误差约为0.03％。因此采用响应面优化菌株LC1‑1发酵生产壳聚糖酶的条件可靠。

[0092] 表5中心复合实验结果

[0093]

[0094]

[0095] 根据单因素试验和响应面因素试验，进行产酶因素的调整，发现通过下述条件生产壳聚糖酶，经测试壳聚糖酶活力实测值最高，具体如下：培养基成分中碳源浓度为22.7g/L，氮源浓度15g/L，装液量20％，接种量2.0％，温度34℃，pH为5.5，转速为180rpm。此条件下进行3次平行试验，测得壳聚糖酶活力平均值达到32.20U/mL。

[0096] 实施例4壳聚糖酶发酵液的制备

[0097] (1)发酵培养基的选择：

[0098] 选择合适的发酵培养基发酵枯草芽孢杆菌LC1‑1，分别采用以下重量份比例的组成内容：酵母粉1～15份、氯化钠1～30份、胰蛋白胨1～30份、蔗糖1～50份、磷酸氢二钾1～10份、磷酸二氢钾1～10份。根据摇瓶中的发酵条件优化结果，优选的，采用酵母粉1g/L、氯化钠5g/L、胰蛋白胨15g/L、蔗糖20g/L、磷酸氢二钾2g/L、磷酸二氢钾1g/L。

[0099] (2)种子液制备：从试管斜面挑取LC1‑1单菌落至一级种子培养基，培养16～20h后转接至二级种子培养基，37℃、180rpm培养16～20h至对数生长期。

[0100] (3)液体深层发酵：按照(1)配制20L发酵培养基于50L发酵罐中，高压蒸汽灭菌，分别测定灭菌前后(消前、消后)的pH值以及碳源含量，取100μL灭菌后(消后)样品加入至5mL LB液体培养基中摇培，通过培养基是否变浑浊验证灭菌是否彻底，按照接种量为2％在发酵罐中接入种子液，从接入种子液(接种后0h)开始，每2h取样监测发酵过程中发酵液OD600、pH及酶活性变化情况(见图4(a)(b))。

[0101] 由图可知，随着发酵时间的延长，菌液的pH值呈现先下降后增加的趋势，符合芽孢杆菌的生长规律。菌株LC1‑1延滞期较短，在生产中具有良好的优势。菌株LC1‑1从6h开始产酶，产酶和菌株的生长过程密切相关，12h后，碳源几乎消耗殆尽，菌体开始自溶，壳聚糖酶逐渐被消化降解，16h酶活消失。在实验中观察到当蔗糖浓度在5g/L左右时酶合成有一个跃升，这为补料工艺的探究提供了线索

[0102] 实施例5 LC1‑1产壳聚糖酶补料工艺初探

[0103] (1)选择合适的发酵培养基发酵枯草芽孢杆菌LC1‑1，分别采用以下重量份比例的组成内容：酵母粉1～15份、氯化钠1～30份、胰蛋白胨1～30份、蔗糖1～50份、磷酸氢二钾1～10份、磷酸二氢钾1～10份。根据摇瓶中的发酵条件优化结果，优选的，采用酵母粉2g/L、氯化钠5g/L、胰蛋白胨15g/L、蔗糖22.7g/L、磷酸氢二钾2g/L、磷酸二氢钾1g/L。

[0104] (2)种子液制备：从试管斜面挑取LC1‑1单菌落至一级种子培养基，培养16～20h后转接至二级种子培养基，37℃、180rpm培养16～20h至对数生长期。

[0105] (3)液体深层发酵：按照(1)配制20L发酵培养基于50L发酵罐中，按照接种量为2％在发酵罐中接入种子液，从接入种子液(接种后0h)开始，每2h取样监测发酵过程中发酵液的碳源浓度、OD600、离线pH及酶活等。根据实际情况进行补料。(见图5)

[0106] 因为在前期发酵罐中试实验中，菌种生长很快，导致大部分能源用于菌体生长，目标代谢产物存在的时间较短，所以本次实验开始适当降低转速，进而降低LC1‑1曾殖的速度，在6h后提高转速。由图可知，发酵17h后产酶达到最高值，为39.9U/mL，此时碳源浓度为5.7g/L，pH为5.76。

[0107] 实施例6壳聚糖酶的分离纯化

[0108] (1)壳聚糖酶的粗提：下罐后得到含壳聚糖酶的发酵液，经10000rpm离心后收集上清液，在发酵上清中缓慢加入硫酸铵，边加边用磁力搅拌器搅拌加速硫酸铵溶解，使硫酸铵饱和度分别为20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％和90％，将不同饱和度的硫酸铵上清液于4℃放置过夜，10000rpm离心10min。分别测定上清液和沉淀中的壳聚糖酶酶活(见图6)。

[0109] (2)壳聚糖酶粗提物通过离子交换层析和葡聚糖凝胶柱层析纯化壳聚糖酶：壳聚糖酶粗提物采用UniGel‑80 DEAE离子柱层析进行分离纯化，纯化条件为：洗脱液为含0.25～1mol/L NaCl的pH 7.5 Tris‑HCl溶液，由低盐浓度向高盐梯度洗脱；每个梯度洗脱时间30min，流速为1ml/min；检测波长为280nm(见图7)；葡聚糖柱层析洗脱液为蒸馏水(见图8)。

[0110] 根据结果，阴离子交换柱层析中，洗脱液中NaCl的浓度为0.5mol/L时的洗脱液有壳聚糖酶活性，把有活性的这部分洗脱液收集起来，过G‑75葡聚糖凝胶柱，共得到2个洗脱峰，其中第1个峰与酶活峰重叠，将第一个峰的收集液跑SDS‑PAGE。

[0111] (3)用SDS‑PAGE的方法测定壳聚糖酶的纯度和分子量(见图9)。

[0112] 经SDS‑PAGE检测发现，经过离子柱和分子筛纯化后的活性峰为单条带，证明经过一系列纯化步骤后得到的壳聚糖酶纯度较高，壳聚糖酶的分子量范围为40‑45kDa。

[0113] 实施例7壳聚糖酶的稳定性

[0114] (1)热稳定性

[0115] 将酶液于30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃下放置15min和30min，测定残余酶活力，将最高酶活力作为100％，分别计算不同温度下壳聚糖酶的相对酶活(图10)。

[0116] 结果显示，该壳聚糖酶在20～50℃之间时，稳定性较好，在孵育30min之内，均能保留95％以上的活性。在温度为60℃时，孵育15min，酶活保留最高酶活的72.8％，孵育30min，酶活保留最高酶活的64.3％。温度在70℃时孵育15min，酶活保留最高酶活的51.5％，孵育30min，酶活保留最高酶活的46.0％。80℃时则几乎丧失了所有活性。

[0117] (2)pH耐受性

[0118] 将壳聚糖酶粗提物于不同pH缓冲液下(0.2M醋酸‑醋酸钠缓冲液(3.7～5.6)，0.2M磷酸氢二钠‑磷酸二氢钠缓冲液(6.0～8.0)，0.1M碳酸钠‑碳酸氢钠(8.7～10.8))放置2h，在最适pH下测定残余酶活力，将最高酶活力作为100％，分别计算不同pH下壳聚糖酶的相对酶活(图11)。

[0119] 结果显示，壳聚糖酶活性在pH 3.7～10.8时相对稳定。在不同pH下放置2h，活性均保持在85％以上，因此该壳聚糖酶的pH耐受性较好。

[0120] (3)金属离子和表面活性剂的影响

[0121] 将浓度为10mmol/L不同金属离子盐溶液(FeCl3，MgSO4，ZnSO4，MnSO4，CaCl2，CuSO4，FeSO4)，10mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)和2％的吐温‑80和酶液等体积混合，4℃放置30min，，以不加金属离子作为空白对照，测定壳聚糖酶活，以空白对照作为100％，分别计算各样品壳聚糖酶的相对酶活(图12)。

[0122] 结果显示，Mn2+对酶促反应有促进作用，Mg2+、Ca2+、EDTA和吐温80对酶促反应基本2+ 3+ 2+ 2+
无影响，Zn 和SDS对酶促反应有抑制作用，Fe 、Cu 、Fe 对酶促反应有严重抑制作用，分别为空白组的16.8％、21.8％和17.2％。总体来说，该壳聚糖酶对表面活性剂耐受性较好。

[0123] 实施例8酶解曲线

[0124] 在反应体系中按照pH 5.6的醋酸钠缓冲液∶2％胶体壳聚糖∶壳聚糖酶＝10∶9∶1的体积比加入各物质，50℃进行反应，每10min测定一次反应体系中还原糖的量，以时间为横坐标，OD520为纵坐标，绘制酶解曲线(图13)。

[0125] 由图可知，前15min酶促反应迅速，45min后还原糖含量不再上升，酶解反应完全。

[0126] 实施例9酶解产物组成

[0127] (1)酶解产物的制备

[0128] 在反应体系中按照醋酸盐缓冲液∶2％胶体壳聚糖∶壳聚糖酶＝10∶9∶1的体积比加入各物质，50℃进行反应45min后，100℃煮沸10min，8000rpm离心10min，上清即为酶解产物。

[0129] (2)TLC法检测酶解产物组成

[0130] 用毛细管吸取适量1％氨基葡萄糖溶液，2.5％市售壳寡糖样品，2.5％酶解产物于同一块硅胶板上，将硅胶板置于展开缸中，上行法展开。取出后，将硅胶板于100℃烘箱中烘干。然后在硅胶板上喷洒0.5％(w/v)的茚三酮乙醇显色剂，于105℃烘箱中烘20min使各种糖显色。展开剂为异丙醇∶水∶氨水的体积比为60∶30∶4(图14)。

[0131] 在硅胶板上，不同寡糖类表现出不同的RF值。分子量小的单糖位于最远离溶剂前沿的位置，次之二糖，再次之三糖、四糖，未分解的壳聚糖则位于原点附近，RF值很小。图13通道3显示菌株LC1‑1所产壳聚糖酶的水解物层析结果。由图中可观察到该酶对壳聚糖的水解比较彻底，在对应壳聚糖的原点附近几乎看不到明显斑点。该酶的水解产物有3种。

[0132] (3)LC‑MS测定酶解产物组成

[0133] 使用液质联用仪对酶解产物进行分析鉴定，流动相为甲醇(A)，千分之一的甲酸水溶液(B)，洗脱条件为0～8min，30％A～100％A，进样量10μL，流速为5mL/min。实验结果见图15。

[0134] 在图中看到有分子量为273、501和814三个特征峰，结合TLC的结果图，判定为酶解产物为单糖、壳三糖和壳四糖。