一株小串链霉菌XG40及其应用

摘要

本发明涉及微生物技术领域，具体地说，涉及一株小串链霉菌XG40及其应用。小串链霉菌(Streptomyces catenulae)XG40，其保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.20655。该菌株分离自草莓植株根系抖落的根际土壤中。平板对峙试验表明小串链霉菌XG40菌株对包括蜜柚黑斑病菌、蜜柚黑点病菌、蜜柚炭疽病菌在内的13种植物病原菌菌丝生长拮抗作用，对琯溪蜜柚黑点病、黑斑病、炭疽病三种病菌具有很好的防治效果。

权利要求

1.小串链霉菌(Streptomyces catenulae)XG40，其特征在于，其保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.20655。

2.一种生物防治菌剂，其特征在于，包含权利要求1所述的小串链霉菌(Streptomyces catenulae)XG40、其发酵产物或其发酵培养物中一种或多种。

3.权利要求2所述生物防治菌剂的制备方法，其特征在于，包括于培养基中发酵培养所述小串链霉菌(Streptomyces catenulae)XG40，并获得所述小串链霉菌(Streptomyces catenulae)XG40的发酵液。

4.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，其还包括对所述发酵液进行过滤，得到所述小串链霉菌(Streptomyces catenulae)XG40的发酵液的上清液。

5.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，还包括将所述上清液稀释1～10倍。

6.根据权利要求3或4所述制备方法，其特征在于，所述培养基包括以下原料：酵母提取物0.1％～0.5％，麦芽浸粉1.0％～8.0％，葡萄糖0.1％～0.5％，碳酸钙0.1％～0.5％，NaCl 0.1％～0.5％。

7.根据权利要求6所述制备方法，其特征在于，所述培养基的pH为7.0～7.2；所述发酵培养的条件为：发酵温度26～30℃，转速150～200r/min下培养5～8天。

8.权利要求1所述小串链霉菌(Streptomyces catenulae)XG40或权利要求2所述生物防治菌剂在抗植物病菌中的应用，其特征在于，所述植物病菌为琯溪蜜柚炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)、琯溪蜜柚黑点病菌(Diaporthe citri)、蜜柚黑斑病菌(Phyllosticta citriasiana)、番茄叶霉病菌(Fulvia fulva)、辣椒枯萎病菌(Fusarium oxysporium  Sch1.f.sp.vasinfectum)、榕树炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)、多肉黑斑病菌(Alternaria alternata)、香蕉枯萎病菌4号生理小种(Fusarium oxysporium f.sp.cubense)、兰花茎腐病菌(Fusarium sp.)、番茄枯萎病菌(Fusarium oxysporium f.sp.lycopersici)、草莓根腐病菌(Fusarium oxysporum)、层出镰孢菌(Fusarium proliferatum)和茄病镰孢菌(Fusarium solani)中一种或者多种。

9.根据权利要求8所述应用，其特征在于，所述植物病菌为琯溪蜜柚炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)、琯溪蜜柚黑点病菌(Diaporthe citri)、蜜柚黑斑病菌(Phyllosticta citriasiana)中的一种或者多种。

10.根据权利要求8或9所述应用，其特征在于，所述植物为琯溪蜜柚。

11.一种防治琯溪蜜柚病虫害的方法，其特征在于，将权利要求1所述小串链霉菌(Streptomyces catenulae)XG40或权利要求2所述生物防治菌剂施用于琯溪蜜柚果实、叶片、花和枝梢中至少一处。

说明书

一株小串链霉菌XG40及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及微生物技术领域，具体地说，涉及一株小串链霉菌XG40及其应用。

背景技术

[0002] 生物防治具有无毒、无残留、可利用资源丰富等优点，利用拮抗微生物防治植物病害是解决上述问题的有效途径，具有对环境友好、效果持久、针对性强，不破坏生态平衡等
优点，是以生态系统调控为主的可持续控制技术。放线菌(Actinomycetes)是一类具有重要
经济价值和实用价值的微生物，种类丰富，且广泛分布于自然界中，从土壤中获得具有高效
拮抗活性的放线菌是开发新农药必不可少的基础工作，其产生的抗生素及其次生代谢物质
在植物生物防治方面具有重要的意义。放线菌中应用种类最多的是链霉菌，目前链霉菌已
被报道应用于防治多种植物病害，并且还发现在防治病害的过程中，链霉菌还能促进植株
生长，提高作物产量。链霉菌的代谢产物能产生多种活性物质，如丰加霉素、环二肽、四烯大
环内酯类抗生素等。且生产上应用的诺尔霉素、水合霉素、中生菌素等农用抗生素对植物病
害具有良好的防控效果。因此，应用链霉菌防控琯溪蜜柚病害具有重要的现实意义。

[0003] 琯溪蜜柚黑点病、黑斑病和炭疽病是目前琯溪蜜柚生产中最主要的三大病害，均可危害琯溪蜜柚果实、叶片、花和枝梢，潜伏期较长，爆发性强，造成琯溪蜜柚树势衰弱及落
花烂果，严重影响果实的外观品质和储藏时间。琯溪蜜柚炭疽病由胶孢炭疽菌
(Colletotrichum gloeosporioides)引起，琯溪蜜柚黑点病由间座壳属真菌(Diaporthe 
citri)引起,琯溪蜜柚黑斑病由叶点霉亚洲种(Phyllosticta citriasiana)引起。目前，生
产上针对这三种病害的防治主要依赖化学药剂，但防治效果均不理想。化学药剂虽然在一
定程度上减轻三种病害的危害，但农民普遍存在严重的乱用滥用农药现象，长期大量使用
会引发严重的农药残留、致病菌产生抗药性、环境污染等问题，进而影响人类的生存和发
展。

[0004] 目前，尚未发现能同时对琯溪蜜柚黑点病、黑斑病和炭疽病有较强拮抗作用的生防菌。

发明内容

[0005] 基于此，本发明的目的在于提供一株小串链霉菌XG40及其应用，该菌株对多种植物病原菌具有较强的拮抗抑制作用，特别是，该菌株用于琯溪蜜柚黑点病、黑斑病和炭疽病
的防治具有很好的效果，解决了现有技术中，化学防治带来的病原菌抗药性、果实农药残
留、生态平衡遭到破坏、严重污染人类赖以生存的自然环境等问题。

[0006] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

[0007] 本发明提供小串链霉菌(Streptomyces catenulae)XG40，属于链霉菌属(Streptomyces)，于2020年9月14日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中
心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.20655，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中
国科学院微生物研究所。

[0008] 本发明提供的小串链霉菌(Streptomyces catenulae)XG40是从草莓植株根系抖落的根际土壤中获得。该小串链霉菌XG40菌株，能使明胶液化、牛奶凝固而不胨化、淀粉水
解、硝酸盐还原，不能使纤维素和色氨酸分解，也不能产生H2S和黑色素；可以利用蔗糖、麦
芽糖、葡萄糖、甘油、棉子糖、D‑果糖、D‑甘露醇、α‑半乳糖、肌醇、D‑木糖作为碳源生长，不能
利用D‑阿拉伯糖、鼠李糖。可利用L‑赖氨酸、L‑组氨酸、天冬酰胺、L‑酪氨酸、L‑谷氨酸、氯化
铵、硝酸钾作为氮源生长，不能利用L‑色氨酸、甘氨酸、精氨酸。对NaCl的耐受性较强，能在
含5％NaCl的培养基上生长，对温度也有较强的耐受性，可在10～38℃之间生长，28℃为生
长最适温度,菌株适宜生长的pH范围6.0～8.5之间，最适pH为7.2，能耐受5～12的pH范围。

[0009] 该小串链霉菌XG40菌株，在高氏一号培养基上生长茂盛，气生菌丝丰茂，28℃培养1～3d菌落光滑、无孢子生成，第4d开始有奶白色孢子丝从菌落中间长出，15d后开始逐渐变
为灰蓝色至灰藏蓝色，无可溶性色素产生。

[0010] 小串链霉菌XG40菌株，在扫描电子显微镜下观察，基内菌丝无横隔膜，弯曲，高度分枝，孢子丝开环、钩形、原始螺旋形或松螺旋，时常不规则，丛生或单生，孢子丝成熟后形
成串珠状的孢子链，孢子链发达，孢子链断裂后形成圆柱形或近圆柱形的孢子，孢子表面光
滑。

[0011] 本发明还提供一种生物防治菌剂，包含所述的小串链霉菌(Streptomyces catenulae)XG40、其发酵产物和其发酵培养物中一种或多种。

[0012] 本发明还提供生物防治菌剂的制备方法，包括于培养基中发酵培养所述小串链霉菌(Streptomyces catenulae)XG40，并获得所述小串链霉菌(Streptomyces catenulae)
XG40的发酵液。

[0013] 一些具体的实施方案中，其还包括对所述发酵液进行过滤，得到所述小串链霉菌(Streptomyces catenulae)XG40的发酵液的上清液；

[0014] 优选地，还包括将所述上清液稀释1～10倍。

[0015] 另一些具体的实施方案中，所述培养基包括以下原料：酵母提取物0.1％～0.5％，麦芽浸粉1.0％～8.0％，葡萄糖0.1％～0.5％，碳酸钙0.1％～0.5％，NaCl 0.1％～0.5％。

[0016] 另一些具体的实施方案中，所述培养基的pH为7.0～7.2；所述发酵培养的条件为：发酵温度26～30℃，转速150～200r/min下培养5～8天。

[0017] 本发明还提供所述小串链霉菌(Streptomyces catenulae)XG40或所述生物防治菌剂在抗植物病菌中的应用，所述植物病菌为琯溪蜜柚炭疽病菌(Colletotrichum 
gloeosporioides)、琯溪蜜柚黑点病菌(Diaporthe citri)、蜜柚黑斑病菌(Phyllosticta 
citriasiana)、番茄叶霉病菌(Fulvia fulva)、辣椒枯萎病菌(Fusarium oxysporium 
Sch1.f.sp.vasinfectum)、榕树炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)、多肉黑斑
病菌(Alternaria alternata)、香蕉枯萎病菌4号生理小种(Fusarium oxysporium 
f.sp.cubense)、兰花茎腐病菌(Fusarium sp.)、番茄枯萎病菌(Fusarium oxysporium 
f.sp.lycopersici)、草莓根腐病菌(Fusarium oxysporum)、层出镰孢菌(Fusarium 
proliferatum)和茄病镰孢菌(Fusarium solani)中一种或者多种。

[0018] 一些具体的实施方案中，所述植物病菌为琯溪蜜柚炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)、琯溪蜜柚黑点病菌(Diaporthe citri)、蜜柚黑斑病菌(Phyllosticta 
citriasiana)中的一种或者多种。

[0019] 另一些具体的实施方案中，所述植物为琯溪蜜柚。

[0020] 小串链霉菌(Streptomyces catenulae)XG40菌株对琯溪蜜柚黑点病的平板对峙试验中活菌抑菌带宽度达14.0～14.2mm，对蜜柚黑斑病菌的抑菌带宽度达14.0～16.8mm，
对蜜柚炭疽病菌的抑菌带宽度达14.5～14.8mm，人工接种防治试验表明其发酵液中生物活
性物质对琯溪蜜柚黑点病、黑斑病和炭疽病均具有显著的防治效果，保护作用和治疗作用
分别达83.3％、86.7％、82.6％和71.7％、79.8％、70.4％，与生产上防治琯溪蜜柚黑点病、
黑斑病和炭疽病的化学药剂相比其防治效果差异不显著，并优于抗性药剂，且具备低毒、无
残留、与环境友好的优点。

[0021] 本发明还提供一种防治琯溪蜜柚病虫害的方法，为将所述小串链霉菌(Streptomyces catenulae)XG40或所述生物防治菌剂施用于琯溪蜜柚果实、叶片、花和枝
梢中至少一处。

[0022] 与现有技术相比，本发明具有的有益效果是：

[0023] 本发明通过对健康草莓植株根际土壤进行微生物分离和病原菌对峙培养，分离纯化得到了一株对人畜安全、抑菌谱广、具有较好应用前景的生防菌株‑小串链霉菌
(Streptomyces catenulae)XG40菌株。该小串链霉菌XG40菌株的发酵液对多种供试病原菌
菌丝生长均有较强的抑制作用，对蜜柚黑点病的抑菌带宽度达14.0～14.2mm，对蜜柚黑斑
病菌的抑菌带宽度达14.0～16.8mm，对蜜柚炭疽病菌的抑菌带宽度达14.5～14.8mm。丰富
了生防资源。

[0024] 本发明所提供的包含有小串链霉菌(Streptomyces catenulae)XG40和/或所述小串链霉菌(Streptomyces catenulae)XG40发酵代谢产物的生物防治菌剂，属于生物制剂，
用来防治琯溪蜜柚黑点病、黑斑病、炭疽病，防治效果好，解决了现有技术中化学防治带来
的病原菌抗药性、果实农药残留、生态平衡遭到破坏、严重污染人类赖以生存的自然环境等
问题，不会对环境和生态造成污染，可减少生产中化学药剂的使用量和残留量，降低用药成
本，同时改善生态环境，有利于琯溪蜜柚的无公害生产。

附图说明

[0025] 图1小串链霉菌(Streptomyces catenulae)XG40菌株的气生菌丝和孢子丝形态；

[0026] 图2小串链霉菌(Streptomyces catenulae)XG40菌株的孢子链和孢子形态；

[0027] 图3小串链霉菌(Streptomyces catenulae)XG40菌株依据16S rDNA序列构建的系统发育树；

[0028] 图4小串链霉菌(Streptomyces catenulae)XG40菌株对蜜柚黑斑病菌的拮抗作用；

[0029] 图5小串链霉菌(Streptomyces catenulae)XG40菌株对蜜柚黑点病菌的拮抗作用；

[0030] 图6小串链霉菌(Streptomyces catenulae)XG40菌株对蜜柚炭疽病菌的拮抗作用。

具体实施方式

[0031] 以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明
的范围。

[0032] 实施例1：小串链霉菌(Streptomyces catenulae)XG40菌株的获得

[0033] 选择福建省漳州市龙文区颜厝镇草莓种植基地健康草莓植株根系抖落的根际土3 4 5 6 7
壤，铲去表土层，取10～15cm处土样，将土壤样品用无菌水稀释10、10 、10 、10 、10倍，利用
高氏一号培养基在28℃条件下培养，采用常规的PDA平板稀释培养法分离获得。分离纯化后
的小串链霉菌(Streptomyces catenulae)XG40转入高氏一号培养基，在28℃条件下培养、
扩繁后得到小串链霉菌XG40菌株。该小串链霉菌XG40菌株于2020年9月14日保藏在中国微
生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.20655，保藏地址
为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

[0034] 高氏一号培养基及PDA平板培养基的制作参见中国农业出版社1998年出版的方中达著作的植病研究方法。

[0035] 实施例2：小串链霉菌XG40菌株在各种培养基上的培养特征

[0036] 将小串链霉菌XG40菌株分别接种于8种不同的培养基，28℃培养36～48h开始有菌落出现，菌落上有淡黄色的呼吸滴，96～120h后孢子开始产生。菌落光滑，边缘光滑或褶皱，
易挑起，直径为1.8～2.1cm，孢子堆颜色紫罗兰色至藏灰色。不同的培养基上菌落的形态、
孢子丝的颜色、气生菌丝的颜色、基内菌丝的颜色、产生可溶性色素、生长情况均有不同，根
据《链霉菌鉴定手册》提供的方法和色版进行观察、比对，结果如表1所示。

[0037] 表1菌株XG40在各种培养基上的培养特征

[0038]

[0039] 注：“—”：不产可溶性色素，“+”：越多生长越旺盛

[0040] 从表1结果可知：小串链霉菌XG40菌株在多数培养基上无可溶性色素产生；气生菌丝由浅灰色变为紫灰色或深灰色、基内菌丝为浅紫白粉至灰藏蓝色。

[0041] 该小串链霉菌XG40菌株，能使明胶液化、牛奶凝固而不胨化、淀粉水解、硝酸盐还原，不能使纤维素和色氨酸分解，也不能产生H2S和黑色素；可以利用蔗糖、麦芽糖、葡萄糖、
甘油、棉子糖、D‑果糖、D‑甘露醇、α‑半乳糖、肌醇、D‑木糖作为碳源生长，不能利用D‑阿拉伯
糖、鼠李糖。可利用L‑赖氨酸、L‑组氨酸、天冬酰胺、L‑酪氨酸、L‑谷氨酸、氯化铵、硝酸钾作
为氮源生长，不能利用L‑色氨酸、甘氨酸、精氨酸。对NaCl的耐受性较强，能在含5％NaCl的
培养基上生长，对温度也有较强的耐受性，可在10～38℃之间生长，28℃为生长最适温度,
菌株适宜生长的pH范围6.0～8.5之间，最适pH为7.2，能耐受5～12的pH范围。

[0042] 该小串链霉菌XG40菌株，在高氏一号培养基上生长茂盛，气生菌丝丰茂，28℃培养1～3d菌落光滑、无孢子生成，第4d开始有奶白色孢子丝从菌落中间长出，15d后开始逐渐变
为灰蓝色至灰藏蓝色，无可溶性色素产生。

[0043] 小串链霉菌XG40菌株，在扫描电子显微镜下观察，图1所示为小串链霉菌XG40菌株的气生菌丝和孢子丝形态图，图2所示为小串链霉菌XG40菌株的孢子链和孢子形态。可以观
察到基内菌丝无横隔膜，弯曲，高度分枝，孢子丝开环、钩形、原始螺旋形或松螺旋，时常不
规则，丛生或单生，孢子丝成熟后形成串珠状的孢子链，孢子链发达，孢子链断裂后形成圆
柱形或近圆柱形的孢子，孢子表面光滑，大小为0.55～0.60μm×0.95～0.65μm。

[0044] 实施例3：16S rDNA序列分析

[0045] 采用细菌基因组提取试剂盒提取菌株XG40基因组DNA后，采用16S三段引物为518R：5'‑ATTACCGCGGCTGCTGG‑3'；1100R：5'‑GGGTTGCGCTCGTTG‑3'；926F：5'‑
AAACTYAAAKGAATTGACGG‑3'，进行16S rDNA的PCR扩增。回收PCR扩增产物，经连接、转化、鉴
定后，阳性克隆送生工生物工程(上海)有限公司测序，其16S rRNA基因序列如SEQ ID No：1
所示，序列全长为1454bp。将所得序列提交到GenBank数据库进行BLAST分析比对，发现与
XG40同源性较高的菌株均属于链霉菌属，选取17个典型菌株的16S rDNA序列用MEGA5.0软
件构建系统发育树(图2)。菌株XG40与Streptomyces catenulae(基因登录号FJ486481.1)
相似性达到98.76％，并结合形态学特性和培养特征，将菌株XG40鉴定为小串链霉菌
(Streptomyces catenulae)。

[0046] 实施例4：小串链霉菌XG40菌株的抑菌试验

[0047] 平板对峙法：采用平板对峙法测定小串链霉菌XG40菌株对植物病原菌的拮抗作用。先将供试病原菌进行平板活化，再打制成菌饼(Φ＝4mm)，菌饼紧贴培养基的表面，供试
病原菌的菌饼带菌丝的一面朝下紧贴于PDA平板(Φ＝90mm)中央，在其两侧25mm处放置2个
(Φ＝4mm)纸片，然后用无菌移液枪吸取100uL的发酵液分别滴在2个纸片上，做好标记，每
处理重复3次。28℃培养7d后，测量拮抗菌菌落边缘与病菌菌落边缘之间的抑菌距离，由于
蜜柚黑斑病菌生长速度缓慢，待培养25d后再测(见表2)。

[0048] 表2小串链霉菌XG40菌株对13种植物病原菌菌丝生长拮抗作用

[0049]

[0050]

[0051] 注：表中数据为平均数±标准差。同列数据后不同大、小写字母表示经Duncan氏新复极差方法检验在P<0.01和P<0.05水平差异显著，下同。

[0052] 从表2结果可知：小串链霉菌XG40菌株对所有供试病原真菌均有一定的拮抗作用。其中对蜜柚黑斑病菌、蜜柚黑点病菌、蜜柚炭疽病菌、番茄叶霉病菌、香蕉枯萎病菌、多肉黑
斑病菌有较强的拮抗作用，其抑菌带大于10mm；对其它7种供试病原真菌的拮抗作用较弱，
其抑菌带均小于10mm。

[0053] 本发明图4‑6还提供了小串链霉菌XG40菌株对蜜柚黑斑病菌、蜜柚黑点病菌、蜜柚炭疽病菌的平板对峙试验的照片，其中图4‑6左侧分别为蜜柚黑斑病菌、蜜柚黑点病菌、蜜
柚炭疽病菌的空白对照，右侧分别为蜜柚黑斑病菌、蜜柚黑点病菌、蜜柚炭疽病菌与小串链
霉菌XG40对峙的处理组。从图4‑6可以清晰的看出，本发明的小串链霉菌XG40菌株对蜜柚黑
斑病菌、蜜柚黑点病菌、蜜柚炭疽病菌均有强烈的拮抗作用。

[0054] 实施例5：生物防治菌剂A‑小串链霉菌XG40发酵上清液5倍稀释液的制备

[0055] 首先按照发酵培养基配方(w/v)：酵母提取物0.2％、麦芽浸粉6％、葡萄糖0.3％、CaCO3 0.2％、NaCl 0.1％、pH值7.0，用自来水配制相应的发酵培养基，用500ml的三角摇瓶
每瓶分装150ml，高压蒸汽灭菌30分钟；其次将小串链霉菌XG40菌株，以无菌方法接种于上
述已配制分装并灭菌好的发酵培养基中，八层纱布封口扎紧，置于180r/min旋转摇床上，28
℃恒温振荡培养7d，得到发酵醪液；然后将上述发酵醪液以5000r/min离心15min，通过除菌
滤器除去菌丝体，获得发酵上清液，对该发酵上清液稀释5倍，即为生物防治菌剂A。

[0056] 实施例6：生物防治菌剂B‑小串链霉菌XG40发酵液的制备

[0057] 首先按照发酵培养基配方(w/v)：酵母提取物0.1％、麦芽浸粉8％、葡萄糖0.2％、CaCO3 0.1％、NaCl 0.1％、pH值7.2，用自来水配制相应的发酵培养基，用500ml的三角摇瓶
每瓶分装200ml，高压蒸汽灭菌30分钟；其次将小串链霉菌XG40菌株，以无菌方法接种于上
述已配制分装并灭菌好的发酵培养基中，八层纱布封口扎紧，置于150r/min旋转摇床上，26
℃恒温振荡培养8d，得到发酵液，即为生物防治菌剂B。

[0058] 实施例7：生物防治菌剂C‑小串链霉菌XG40发酵上清液的制备

[0059] 首先按照发酵培养基配方(w/v)：酵母提取物0.5％、麦芽浸粉1％、葡萄糖0.5％、CaCO3 0.5％、NaCl 0.5％、pH值7.1，用自来水配制相应的发酵培养基，用500ml的三角摇瓶
每瓶分装100ml，高压蒸汽灭菌25分钟；其次将小串链霉菌XG40菌株，以无菌方法接种于上
述已配制分装并灭菌好的发酵培养基中，八层纱布封口扎紧，置于200r/min旋转摇床上，30
℃恒温振荡培养6d，得到发酵醪液；然后将上述发酵醪液以4000r/min离心30min，通过除菌
滤器除去菌丝体，获得发酵上清液，即为生物防治菌剂C。

[0060] 实施例8：生物防治菌剂对琯溪蜜柚黑点病防治试验

[0061] 琯溪蜜柚黑点病病原菌侵染：将琯溪蜜柚黑点病菌在苜蓿煎汁+Czapek培养基(配方：苜蓿杆、叶100g；硝酸钠2.00g；氯化钾0.50g；硫酸铁0.01g；磷酸氢二钾1.00g；硫酸镁
0.50g；蔗糖30.00g；琼脂粉15g；水1000mL)26℃恒温培养25～30d后，挑取孢子角及载孢体
5 ‑1
配制成1×10个.mL 个孢子的孢子悬浮液。选择健康新鲜的琯溪蜜柚幼果，用75％酒精表
面消毒，无菌水冲洗3次，自然风干，采用刺伤接种的方法，用5号昆虫针(Φ＝0.7mm)刺伤果
面(深度约1mm)，然后将黑点病菌孢子液20μL接种于幼果伤口及其周围，接种后放入塑料盒
(相对湿度约90％)置于28℃光照培养箱，每个处理15个果实，重复3次。

[0062] 发酵液抑菌对比：于接种前24h和接种后24h，分别将XG40发酵上清液5倍稀释液(生物防治菌剂A)、80％代森锰锌500倍稀释液，10％苯醚甲环唑的500倍稀释液及无菌水
5mL均匀涂抹于幼果伤口及其周围果面，接种后，每天观察果实发病情况，计算防治效果(如
表3)。

[0063] 防治效果(％)＝(对照病情指数－处理病情指数)/对照病情指数×100

[0064] 病情指数分级标准，参考陈国庆等的果实病害分级标准。

[0065] 0级：果上无病斑；

[0066] 1级：果上病斑面积占果面积的5％以下；

[0067] 3级：果上病斑面积占果面积的的6％‑10％；

[0068] 5级：果上病斑面积占果面积的11％‑25％；

[0069] 7级：果上病斑面积占果面积的26％‑50％；

[0070] 9级：果上病斑面积占果面积的50％以上。

[0071] 表3小串链霉菌XG40发酵液对琯溪蜜柚黑点病的防治效果

[0072]

[0073] 从表3结果可知：对照果实发病率和病情指数分别为82.2％和48.6；病原菌接种前喷洒小串链霉菌XG40 5倍稀释液处理的果实发病率为22.2％，病情指数为8.1，病原菌接种
后喷洒小串链霉菌XG40发酵上清液5倍稀释液(生物防治菌剂A)处理的发病率和病情指数
分别为31.1％和13.8，保护作用和治疗作用分别为83.3％和71.7％；用80％代森锰锌的500
倍稀释液和10％苯醚甲环唑500倍稀释液处理的保护作用分别为85.8％和69.0％，治疗作
用分别为74.1％和56.6％。实验发现对照果实在之后几周病斑扩大，有的果实腐烂；经过药
剂处理的果实病斑几乎没有继续扩大。实验结果表明，小串链霉菌XG40发酵上清液5倍稀释
液(生物防治菌剂A)对琯溪蜜柚黑点病菌有显著的抑制作用，即使蜜柚感染了黑点病，也有
较好的防治效果；虽然其保护作用和治疗作用略低于80％代森锰锌500倍稀释液，但差异不
显著,高于10％苯醚甲环唑500倍稀释液，差异较显著。有研究表明代森锰锌对柑橘黑点病
菌孢子萌发有较好的抑制作用，而苯醚甲环唑对病菌孢子抑制作用较差。黑点是寄主防卫
反应的产物，果实一但受到感染，黑点就会产生，当年感染的组织不会产生孢子引发再侵
染，因此，黑点病的药剂防治应重点在保护果实免受病菌的感染，而非使用内吸性杀菌剂抑
制病菌的寄主体内的扩展，本试验生防菌剂A和保护性杀菌剂代森锰锌试验结果证明也证
明了这个推测。

[0074] 用生物防治菌剂B和生物防治菌剂C，对琯溪蜜柚黑点病进行防治试验，试验结果同样证明：生物防治菌剂B和生物防治菌剂C对琯溪蜜柚黑点病菌有显著的抑制作用，即使
蜜柚感染了黑点病，也有较好的防治效果。

[0075] 实施例9：生物防治菌剂对琯溪蜜柚黑斑病防治试验

[0076] 琯溪蜜柚黑斑病病原菌侵染：将琯溪蜜柚黑斑病菌在PDA培养基(配方：马铃薯5
200g；葡萄糖20g；琼脂粉15g；水1000mL)上26℃恒温培养20d后，挑取孢子配制成1×10 个
‑1
.mL 个孢子的孢子悬浮液。选择健康新鲜的琯溪蜜柚幼果，用75％酒精表面消毒，无菌水冲
洗3次，自然风干，采用刺伤接种的方法，用5号昆虫针(Φ＝0.7mm)刺伤果面(深度约1mm)，
然后将黑斑病菌孢子液20μL接种于幼果伤口及其周围，接种后放入塑料盒(相对湿度约
90％)置于28℃光照培养箱，每个处理15个果实，重复3次。

[0077] 发酵液抑菌对比：于接种前24h和接种后24h，分别将XG40发酵上清液5倍稀释液(生物防治菌剂A)、10％苯醚甲环唑500倍稀释液，50％多菌灵500倍稀释液及无菌水5mL均
匀涂抹于幼果伤口及其周围果面，接种后，每天观察果实发病情况，计算防治效果(如表4)。

[0078] 防治效果(％)＝(对照病情指数－处理病情指数)/对照病情指数×100

[0079] 病情指数以单个果的病斑个数及病斑大小为分级标准，参考龚玉源等的果实病害分级标准。

[0080] 0级：果上无病斑；

[0081] 1级：果上病斑小而少(病斑直径小于1mm，少于10个)；

[0082] 3级：病斑小而多(11～50个)，大而少(病斑直径大于2mm，少于10个)；

[0083] 5级：病斑小而较多(51～100个)，大而较多(11～20个)；

[0084] 7级：病斑小而很多(101个以上)，大而多(21个以上)；

[0085] 9级：小病斑布满全果，大病斑很多。

[0086] 表4链球菌XG40发酵液对琯溪蜜柚黑斑病的防治效果

[0087]

[0088] 从表4结果可知：对照果实发病率和病情指数分别为93.3％和53.8；病原菌接种前喷洒小串链霉菌XG40 5倍稀释液处理的果实发病率为31.1％，病情指数为7.2，病原菌接种
后喷洒小串链霉菌XG40发酵上清液5倍稀释液(生物防治菌剂A)处理的发病率和病情指数
分别为42.2％和10.9，保护作用和治疗作用分别为86.7％和79.8％；用10％苯醚甲环唑500
倍稀释液和50％多菌灵的500倍稀释液处理的保护作用分别为89.4％和69.5％，治疗作用
分别为81.2％和58.8％。实验发现对照果实在之后几周病斑扩大，有的果实病斑凹陷腐烂；
经过药剂小串链霉菌XG40发酵上清液5倍稀释液(生物防治菌剂A)和10％苯醚甲环唑500倍
稀释液处理的果实病斑几乎没有继续扩大，50％多菌灵的500倍稀释液处理的病斑扩大一
点，但没有凹陷腐烂。实验结果表明，小串链霉菌XG40发酵上清液5倍稀释液(生物防治菌剂
A)对琯溪蜜柚黑斑病菌有显著的抑制作用，即使蜜柚感染了黑斑病，也有较好的防治效果；
虽然其保护作用和治疗作用略低于10％苯醚甲环唑500倍稀释液，但差异不显著；而优于
50％多菌灵的500倍稀释液处理，可能是多菌灵在长期使用过程中，病菌已产生抗药性。

[0089] 用生物防治菌剂B和生物防治菌剂C，对琯溪蜜柚黑斑病进行防治试验，试验结果同样证明：生物防治菌剂B和生物防治菌剂C对琯溪蜜柚黑斑病菌有显著的抑制作用，即使
蜜柚感染了黑斑病，也有较好的防治效果。

[0090] 实施例10：生物防治菌剂对琯溪蜜柚炭疽病防治试验

[0091] 琯溪蜜柚炭疽病原菌侵染：将琯溪蜜柚黑斑病菌在PDA培养基(配方：马铃薯200g；5 ‑1
葡萄糖20g；琼脂粉15g；水1000mL)上26℃恒温培养5～7d后，挑取孢子配制成1×10个.mL
个孢子的孢子悬浮液。选择健康新鲜的琯溪蜜柚幼果，用75％酒精表面消毒，无菌水冲洗3
次，自然风干，采用刺伤接种的方法，用5号昆虫针(Φ＝0.7mm)刺伤果面(深度约1mm)，然后
将炭疽病菌孢子液20μL接种于幼果伤口及其周围，接种后放入塑料盒(相对湿度约90％)置
于28℃光照培养箱，每个处理15个果实，重复3次。

[0092] 发酵液抑菌对比：于接种前24h和接种后24h，分别将XG40发酵上清液5倍稀释液(生物防治菌剂A)、70％丙森锌500倍稀释液，50％多菌灵500倍稀释液及无菌水5mL均匀涂
抹于幼果伤口及其周围果面，接种后，每天观察果实发病情况，计算防治效果(如表5)。

[0093] 防治效果(％)＝(对照病情指数－处理病情指数)/对照病情指数×100％

[0094] 果实发病程度分级标准参照汪茜等的方法:

[0095] 0级：无病；

[0096] 1级：病斑面积占果实面积的5％以下；

[0097] 3级：病斑面积占果实面积的6％～10％；

[0098] 5级：病斑面积占果实面积的11％一25％；

[0099] 7级：病斑面积占果实面积的26％～50％；

[0100] 9级：病斑面积占果实面积的51％以上。

[0101] 表5链球菌XG40发酵液对琯溪蜜柚炭疽病的防治效果

[0102]

[0103]

[0104] 从表5结果可知：对照果实发病率和病情指数分别为88.9％和42.5；病原菌接种前喷洒小串链霉菌XG40 5倍稀释液处理的果实发病率为24.4％，病情指数为7.4，病原菌接种
后喷洒小串链霉菌XG40发酵上清液5倍稀释液(生物防治菌剂A)处理的发病率和病情指数
分别为35.6％和12.6，保护作用和治疗作用分别为82.6％和70.4％；用50％多菌灵的500倍
稀释液和70％丙森锌600倍稀释液处理的保护作用分别为75.0％和85.4％，治疗作用分别
为59.9％和71.5％。实验发现对照果实在之后几周病斑扩大，有的果实腐烂，干燥后病斑处
可见黑色的分生孢子器；经过药剂处理的果实病斑几乎没有继续扩大，病斑处未见分生孢
子器。实验结果表明，小串链霉菌XG40发酵上清液5倍稀释液(生物防治菌剂A)对琯溪蜜柚
炭疽病菌有显著的抑制作用，即使蜜柚感染了炭疽病，也有较好的防治效果；虽然其保护作
用和治疗作用略低于70％丙森锌500倍稀释液，但优于50％多菌灵的500倍稀释液。

[0105] 用生物防治菌剂B和生物防治菌剂C，对琯溪蜜柚炭疽病进行防治试验，试验结果同样证明：生物防治菌剂B和生物防治菌剂C对琯溪蜜柚炭疽病菌有显著的抑制作用，即使
蜜柚感染了炭疽病，也有较好的防治效果。

[0106] 前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变
和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应
用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及
各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。