一种肝脏特异性积累DHA的鱼类模型构建方法及其应用

摘要

本发明公开了一种肝脏特异性积累DHA的鱼类模型构建方法及其应用，其包括如下步骤：确定敲除靶点；gDNA片段的扩增与体外转录；鱼胚胎注射sgRNA和Cas9蛋白；敲除纯合品系筛选；DHA含量测定。其基于CRISPR/Cas9基因敲除技术对鱼类肝脏中DHA转出的关键基因vtg1实施敲除，从而建立鱼类肝脏特异性累积DHA的动物模型，为后续针对DHA对鱼类的生理和发育影响研究，提供更精准、靶标更强的研究工具。

权利要求

1.一种肝脏特异性积累DHA的鱼类模型构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)确定敲除靶点：

查询鱼类vtg1的基因序列，利用CRISPR设计工具确定鱼类vtg1基因的CRISPR/Cas9敲除靶点；所述鱼类vtg1基因的CRISPR/Cas9敲除靶点序列为ATAGTGTGTTCTGCAC；

2)gDNA片段的扩增与体外转录：

以鱼类sgRNA质粒为模板，利用PCR技术扩增获得包含有鱼类vtg1基因敲除靶点的gDNA片段，并对扩增产物进行回收、纯化；且利用PCR技术扩增获得包含有鱼类vtg1基因敲除靶点的gDNA片段时，上游引物序列为：ATAGTGTGTTCTGCAC，下游引物序列为：AGCACCGACTCGGTGCCACT；

以所述包含有鱼类vtg1基因敲除靶点的gDNA片段为模板进行体外转录，以获取包含有鱼类vtg1基因敲除靶点的sgRNA；

3)鱼胚胎注射sgRNA和Cas9蛋白：

将上述包含有鱼类vtg1基因敲除靶点的sgRNA溶液和Cas9蛋白溶液注射到鱼类胚胎中；

4)敲除纯合品系筛选：

注射完成后，取部分鱼类胚胎提取鱼类基因组，并利用PCR技术进行扩增，并对扩增产物进行基因测序，若测序结果表明发生vtg1基因突变，则保留剩余鱼类胚胎，并养至性成熟，由此获得vtg1基因发生突变的F0代鱼类；

将F0代鱼类与野生型鱼类进行杂交，获得F1代鱼类；取部分F1代鱼类胚胎提取鱼类基因组，并进行基因测序， 若测序结果表明发生vtg1基因突变，则保留剩余F1代鱼类胚胎，并养至性成熟；

提取成年F1代鱼类基因组并测序，根据测序结果筛选发生vtg1基因突变的F1代雌雄鱼类，彼此杂交，以获得F2代鱼类胚胎，并养至性成熟；

提取成年F2代鱼类基因组并测序，根据测序结果筛选出vtg1基因已被敲除的纯合F2代鱼类；

5)DHA含量测定：

测定所述纯合品系中雌性鱼类肝脏的DHA含量。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，包含有鱼类vtg1基因敲除靶点的sgRNA终浓度为300‑600ng/μl。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，注射时，sgRNA溶液与Cas9蛋白溶液的体积比为1：(0.8‑1.5)。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，注射时，在鱼类的单细胞胚胎期进行注射，且将上述sgRNA溶液与Cas9蛋白溶液注射到胚胎的动物极。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，采用鱼类胚胎注射仪进行注射，且参数设置为：Pout值为15，Pinject值为40‑50。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)中，将鱼类胚胎养至性成熟的过程包括：在胚胎孵化后5‑7天，使用研磨的蛋黄溶液投喂幼鱼；在胚胎孵化后7‑10天，使用蛋黄溶液和草履虫混合投喂；在胚胎孵化后10天至性成熟阶段，使用丰年虫和商业饲料混合投喂。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)中，利用PCR技术对鱼类基因组进行扩增时，其上游引物序列为：ATGGATCCTCTACTCTACGAG，下游引物序列为：AGTGACTGCTATCCAGTCCTT。

8.一种通过权利要求1‑7任一项所述方法制备得到的鱼类模型在研究DHA在鱼类肝脏特异性累积中的应用。

说明书

一种肝脏特异性积累DHA的鱼类模型构建方法及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种肝脏特异性积累DHA的鱼类模型构建方法及其应用。

背景技术

[0002] 鱼类中富含Ω‑3高度不饱和脂肪酸二十二碳六烯酸(DHA)，其具有很高的营养价值和生理功能，可以促进神经系统发育，保护视力，并降低心血管疾病的风险。同时，DHA在鱼类生理发育过程中亦发挥着非常重要的功能。研究表明，DHA是幼鱼神经细胞膜和视觉细胞膜的重要组成成分，具有抑制炎症和抵抗氧化应激的功能。并且，水产饲料中DHA的添加可以提高幼鱼的生长和存活率，降低畸形率，同时修复肠道损伤。上述研究表明，无论是评估水产品的营养价值，还是探究鱼类自身的生长发育调控，鱼类DHA在其中均发挥了十分重要的作用。

[0003] 在鱼类生理研究中，往往需要探讨DHA在特定组织中的功能，因而需要DHA特异性地积累在某个组织中。肝脏是DHA合成和代谢调控的重要器官，因此肝脏组织特异性的DHA累积对于研究DHA所调控的分子信号通路具有十分重要的意义。

[0004] 然而，迄今为止，尚无方案可以实现DHA在鱼类肝脏中的特异性累积，相关动物模型的缺乏已成为限制对DHA生理发育功能研究的障碍之一。

发明内容

[0005] 针对上述技术问题，本发明提供了肝脏特异性积累DHA的鱼类模型构建方法及其应用，其基于CRISPR/Cas9基因敲除技术对鱼类肝脏中DHA转出的关键基因vtg1实施敲除，从而建立鱼类肝脏特异性累积DHA的动物模型，为后续针对DHA对鱼类的生理和发育影响研究，提供更精准、靶标更强的研究工具。

[0006] 为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

[0007] 一方面，提供了一种肝脏特异性积累DHA的鱼类模型构建方法，其包括如下步骤：

[0008] 1)确定敲除靶点：

[0009] 查询鱼类vtg1(即卵黄蛋白原1)的基因序列，利用CRISPR设计工具确定鱼类vtg1基因的CRISPR/Cas9敲除靶点；

[0010] 2)gDNA片段的扩增与体外转录：

[0011] 以鱼类sgRNA质粒为模板，利用PCR技术扩增获得包含有鱼类vtg1基因敲除靶点的gDNA片段，并对扩增产物进行回收、纯化；

[0012] 以所述包含有鱼类vtg1基因敲除靶点的gDNA片段为模板进行体外转录，以获取包含有鱼类vtg1基因敲除靶点的sgRNA；

[0013] 3)鱼胚胎注射sgRNA和Cas9蛋白：

[0014] 将上述包含有鱼类vtg1基因敲除靶点的sgRNA溶液和Cas9蛋白溶液注射到鱼类胚胎中；

[0015] 4)敲除纯合品系筛选：

[0016] 注射完成后，取部分鱼类胚胎提取鱼类基因组，并以此为模板，利用PCR技术进行扩增，并对扩增产物进行基因测序，若测序结果表明发生vtg1基因突变，则保留剩余鱼类胚胎，并养至性成熟，由此获得vtg1基因发生突变的F0代鱼类；

[0017] 将F0代鱼类与野生型鱼类进行杂交，获得F1代鱼类；取部分F1代鱼类胚胎提取鱼类基因组，并进行基因测序，若测序结果表明发生vtg1基因突变，则保留剩余F1代鱼类胚胎，并养至性成熟；

[0018] 提取成年F1代鱼类基因组并测序，根据测序结果筛选发生vtg1基因突变的F1代雌雄鱼类，彼此杂交，以获得F2代鱼类胚胎，并养至性成熟；

[0019] 提取成年F2代鱼类基因组并测序，根据测序结果筛选出vtg1基因已被敲除的纯合F2代鱼类；

[0020] 5)DHA含量测定：

[0021] 测定所述纯合品系中雌性鱼类肝脏的DHA含量。

[0022] 优选的，所述鱼类vtg1基因的CRISPR/Cas9敲除靶点序列为ATAGTGTGTTCTGCAC(SEQ ID NO.1)。

[0023] 优选的，采用T7转录试剂盒进行体外转录。

[0024] 优选的，包含有鱼类vtg1基因敲除靶点的sgRNA终浓度为300‑600ng/μl。

[0025] 优选的，注射时，sgRNA溶液与Cas9蛋白溶液的体积比为1：(0.8‑1.5)。

[0026] 优选的，注射时，在鱼类的单细胞胚胎期进行注射，且将上述sgRNA溶液与Cas9蛋白溶液注射到胚胎的动物极。

[0027] 优选的，采用鱼类胚胎注射仪进行注射，且参数设置为：Pout值为15，Pinject值为40‑50。

[0028] 优选的，利用PCR技术扩增获得包含有鱼类vtg1基因敲除靶点的gDNA片段时，上游引物序列为：ATAGTGTGTTCTGCAC(SEQ ID NO.1)，下游引物序列为：AGCACCGACTCGGTGCCACT(SEQ ID NO.2)。

[0029] 优选的，步骤4)中，将鱼类胚胎养至性成熟的过程包括：在胚胎孵化后5‑7天，使用研磨的蛋黄溶液投喂幼鱼；在胚胎孵化后7‑10天，使用蛋黄溶液和草履虫混合投喂；在胚胎孵化后10天至性成熟阶段，使用丰年虫和商业饲料混合投喂。

[0030] 优选的，步骤4)中，利用PCR技术对鱼类基因组进行扩增时，其上游引物序列为：ATGGATCCTCTACTCTACGAG(SEQ ID NO.3)，下游引物序列为：AGTGACTGCTATCCAGTCCTT(SEQ ID NO.4)。

[0031] 优选的，所述鱼类包括罗非鱼、斑马鱼、鲫鱼中的一种或几种。

[0032] 另一方面，还提供一种通过上述方法制备得到的鱼类模型在研究DHA在鱼类肝脏特异性累积中的应用。

[0033] 本发明至少具备以下有益效果：

[0034] 本发明基于CRISPR/Cas9基因敲除技术，首次创新性地针对鱼类肝脏中DHA转出的关键基因vtg1实施敲除，从而抑制鱼类肝脏中DHA的转出途径，但不会干扰肝脏中DHA的合成和转入途径，进而建立鱼类肝脏特异性累积DHA的动物模型，为后续针对DHA对鱼类的生理和发育影响研究，提供更精准、靶标更强的研究工具。

附图说明

[0035] 为了更清楚地说明本发明实施例技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

[0036] 图1为F2代vtg1敲除纯合斑马鱼与野生型斑马鱼基因组的测序结果；

[0037] 图2为F2代vtg1敲除纯合斑马鱼与野生型斑马鱼的体重、肥满度测定结果；

[0038] 图3为F2代vtg1敲除纯合斑马鱼与野生型斑马鱼的全鱼总脂质测定结果；

[0039] 图4为F2代vtg1敲除纯合斑马鱼与野生型斑马鱼的肝脏总脂质测定结果；

[0040] 图5为F2代vtg1敲除纯合斑马鱼与野生型斑马鱼的内脏(去除肝脏)总脂质测定结果；

[0041] 图6为F2代vtg1敲除纯合斑马鱼与野生型斑马鱼的全鱼DHA测定结果；

[0042] 图7为F2代vtg1敲除纯合斑马鱼与野生型斑马鱼的肝脏DHA测定结果；

[0043] 图8为F2代vtg1敲除纯合斑马鱼与野生型斑马鱼的内脏(去除肝脏)DHA测定结果。

具体实施方式

[0044] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

[0045] 实施例1：

[0046] 本实施例提供了一种肝脏特异性积累DHA的鱼类模型构建方法，其包括如下步骤：

[0047] (1)确定敲除靶点：

[0048] 利用NCBI搜索网站查询斑马鱼(Danio rerio)vtg1的基因序列，在专门针对斑马鱼CRISPR/Cas9敲除的靶点设计网站http://zifit.partners.org/ZiFiT中提交vtg1全基因序列，且确定针对vtg1基因特异序列片段设计的敲除靶点序列为ATAGTGTGTTCTGCAC(SEQ ID NO.1)。

[0049] (2)gDNA片段的扩增与体外转录：

[0050] 以斑马鱼sgRNA质粒为模板，上述vtg1敲除靶点序列(SEQ ID NO.1)为上游引物，sgRNA质粒试剂盒自带下游引物(SEQ ID NO.2)，利用PCR技术扩增获得包含有斑马鱼vtg1基因敲除靶点的gDNA片段，具体扩增程序为：第一步：94℃5min；第二步：94℃30sec；第三步：56℃30sec；第四步：72℃15sec；第五步：72℃5min；第六步：4℃1h，其中，第二步至第四步进行35个循环；然后利用割胶回收试剂盒对扩增得到的gDNA产物进行割胶纯化，从而获得纯度较高的gDNA片段；

[0051] 采用T7高产转录试剂盒，按照试剂盒说明书操作步骤，以所述包含有鱼类vtg1基因敲除靶点的gDNA片段为模板进行体外转录，以获取包含有鱼类vtg1基因敲除靶点的sgRNA；然后在所述sgRNA产物中加入30μl无酶水和31μl的8M的氯化锂溶液，混匀后零下20℃沉淀过夜，再在4℃条件下12000rpm离心30min，弃去上层液体，沉淀后的sgRNA加入一定量的无酶水溶液，使得包含有鱼类vtg1基因敲除靶点的sgRNA终浓度为300‑600ng/μl，至此，针对斑马鱼vtg1基因的sgRNA构建完成。

[0052] (3)鱼胚胎注射sgRNA和Cas9蛋白：

[0053] 取上述包含有鱼类vtg1基因敲除靶点的sgRNA溶液1μl、Cas9蛋白溶液1μl、Cas9蛋白缓冲液0.3μl、无酶水0.7μl进行混合，该混合步骤全程在低温条件下进行，防止蛋白酶失活；

[0054] 使用斑马鱼胚胎注射仪，将Pout参数调至约为15，Pinject参数调至40‑50范围，在斑马鱼的单细胞胚胎期，即产卵后半小时内，快速将上述混合溶液注射到斑马鱼胚胎的动物极，将注射结束的的胚胎收集入培养皿中，加入1/10000的亚甲基蓝溶液进行培养。

[0055] (4)敲除纯合品系筛选：

[0056] 斑马鱼胚胎注射两天后，取部分注射后的斑马鱼胚胎，擦干水分，放入1.5ml离心管中；每管加入50μl 50mmol/L的NaOH后，放入PCR仪，95℃下反应15min，以提取斑马鱼的全基因组；以上述提取的基因组作为模板，取上述PCR产物1.5μl、vtg1敲除靶点的上下游引物(上游引物序列为：ATGGATCCTCTACTCTACGAG(SEQ ID NO.3)，下游引物序列为：AGTGACTGCTATCCAGTCCTT(SEQ ID NO.4))各1μl、buffer缓冲液和连接酶共6μl配置反应体系，利用PCR技术扩增包含有vtg1突变位点的靶片段，具体扩增程序为：第一步：94℃5min；
第二步：94℃30sec；第三步：56.5℃30sec；第四步：72℃30sec；第五步：72℃5min；第六步：4℃10min，其中，第二步至第四步进行34个循环，PCR反应结束即可获得包含有vtg1突变位点的靶片段产物，并将扩增后的靶片段进行基因测序，若测序结果为杂峰，则表明胚胎中具有vtg1基因发生突变的个体(如胚胎均没有发生vtg1基因突变，则测序结果出现的都是单峰)，则进一步保留剩余斑马鱼注射胚胎，并养至性成熟(约120天)，即获得vtg1基因已发生突变的F0代斑马鱼，需要注意的是，测序结果为杂峰只能说明vtg1基因发生突变，但该突变可能是由于碱基缺失以外的方式造成，如基因插入、替换等。

[0057] 选择12条F0代成年斑马鱼与野生型斑马鱼进行杂交，获得F1代斑马鱼，通过上述基因组提取方法，提取部分孵化3天的F1代斑马鱼胚胎基因组，并对其进行包含有vtg1突变位点的靶片段测序，若测序结果为双峰，则进一步表明F1代斑马鱼中存在vtg1基因发生突变的个体，则进一步保留F1代同胞鱼，并养至性成熟；

[0058] 对成年的F1代斑马鱼逐条剪尾巴提取基因组，对其进行包含有vtg1突变位点的靶片段进行测序，筛选发生同种类型vtg1基因突变的F1代雌雄斑马鱼，彼此杂交，获得F2代敲除斑马鱼胚胎，并养至性成熟；

[0059] 针对F2代斑马鱼的包含有vtg1突变位点的靶片段进行基因测序分析，分析结果如图1所示，与F2代野生型斑马鱼(WT)相比，F2代vtg1敲除纯合斑马鱼的vtg1基因有7个碱基(CCCTGAG)的缺失，由此筛选出vtg1基因已被敲除的纯合F2代斑马鱼，获得与斑马鱼肝脏中DHA转运有关的vtg1基因敲除纯合品系斑马鱼；

[0060] 上述过程中，将斑马鱼胚胎养至性成熟的过程时，需根据不同发育阶段的摄食特征进行饲养，具体包括如下步骤：在胚胎孵化后5‑7天，使用研磨的蛋黄溶液投喂斑马鱼幼鱼；在胚胎孵化后7‑10天，使用蛋黄溶液和草履虫混合投喂；在胚胎孵化后10天至性成熟阶段，使用丰年虫和斑马鱼的商业饲料混合投喂。

[0061] (5)DHA含量测定：

[0062] 由于vtg1基因特异性在雌鱼体内高表达，因此本实施例在F2代斑马鱼中选取野生型雌鱼和vtg1纯合敲除雌鱼各15条，对其体重和肥满度进行测定，测定公式如下：

[0063] 肥满度＝100×鱼体重/鱼体长3

[0064] 肥满度：g/cm3，鱼体重：g，鱼体长：cm；

[0065] 随后对全鱼、肝脏和内脏(去除肝脏后内脏，下述内脏均为去除肝脏后内脏)中的DHA含量进行测定，首先提取斑马鱼全鱼、肝脏和内脏中的总脂质，方法如下：在F2代斑马鱼中选取野生型雌鱼和vtg1纯合敲除雌鱼各40条，使用MS222(150mg/L)麻醉处理，提取斑马鱼的全鱼、肝脏和内脏组织样品，每组4个平行，全鱼每个平行包含2个混样，肝脏和内脏每个平行包含8个混样；分别置于10ml玻璃管；加入6ml甲醇氯仿溶剂(1:2体积比例)对全鱼、肝脏和内脏组织进行匀浆；随后2000rpm离心10min，使用巴斯德吸管吸取下层有机相溶剂(下层溶剂已经萃取脂质成分)置于另一新玻璃管中，真空干燥去除有机试剂，即可获得全鱼、肝脏和内脏的总脂质成分。

[0066] 斑马鱼全鱼、肝脏和内脏中脂肪酸甲酯化处理(涵盖DHA甲酯化)：称取2mg上述总脂质于10ml玻璃管中，加入1ml的0.5mol/L KOH甲醇溶液，样品充分涡旋混匀后65℃水浴30min；样品冷却后加入1ml 14％三氟化硼甲醇溶液，样品混匀后75℃水浴30min；冷却室温后加入1ml纯水和1ml正己烷，随后2000rpm离心5min取上层溶剂1ml于新的玻璃管中，真空干燥去除有机试剂，至此获得全鱼、肝脏和内脏中甲酯化的脂肪酸成分。

[0067] 气相色谱检测全鱼、肝脏和内脏中脂肪酸含量：向上述甲酯化脂肪酸样品中加入300μl正己烷，涡旋混匀后，将样品转移至1.5ml离心管中，12000rpm离心2min；取100μl上层溶液于GC进样瓶的内衬管中；同时，另取39种脂肪酸标准品溶剂于GC进样瓶的内衬管中，使用气相色谱检测仪对上述样品和标准品中的脂肪酸进行检测和分析；气相色谱仪参数设置如下：长100m，内径0.25mm，厚度为0.2μm的柱子；柱温以4℃/min从120℃升至240℃，在240℃条件下维持30min；进样口温度设置为250℃；检测器温度设置为260℃。

[0068] 气相色谱检测结果分析：根据每种脂肪酸的检测峰面积，计算DHA占总脂肪酸的含量百分比。即DHA含量百分比＝FDHA/F总脂肪酸×100％，其中FDHA表示检测到的DHA峰面积，F总脂肪酸为检测到的总脂肪酸的峰面积。

[0069] 如图2所示，F2代斑马鱼中，野生型雌鱼和vtg1基因敲除雌鱼(即敲除鱼)的体重和肥满度均未表现出显著性差异，表示vtg1敲除后不会对斑马鱼的生长产生显著性影响。

[0070] 如图3、4和5所示，vtg1敲除并不会影响全鱼体内的总脂质含量，但会提高雌性斑马鱼肝脏和内脏中的脂质含量。

[0071] 如图6、7和8所示，vtg1敲除雌鱼(即敲除鱼)鱼体内的DHA含量并没有呈现显著性差异，但在肝脏中可以观察到，vtg1敲除雌鱼的肝脏DHA含量显著高于野生型组，同时，vtg1敲除雌鱼内脏中的DHA含量低于野生型组，这表示vtg1敲除雌鱼肝脏中会特异性积累DHA，由此说明肝脏特异性积累DHA的鱼类模型构建完成。

[0072] 实施例2：

[0073] 本实施例还提供了一种通过实施例1中所述鱼类模型构建方法制备得到的鱼类模型在研究DHA在鱼类肝脏特异性累积中的应用。

[0074] 综上所述，本发明基于CRISPR/Cas9基因敲除技术对鱼类肝脏中DHA转出的关键基因vtg1实施敲除，从而抑制鱼类肝脏中DHA的转出途径，但不会干扰肝脏中DHA的合成和转入途径，进而建立鱼类肝脏特异性累积DHA的动物模型，为后续针对DHA对鱼类的生理和发育影响研究，提供更精准、靶标更强的研究工具。

[0075] 上述实施例1‑2中的技术特征可进行任意组合，且组合而成的技术方案均属于本申请的保护范围。以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明的范围内。本发明要求的保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。