环状RNA circ-26782在制备脊髓损伤诊疗药物中的应用

摘要

本发明公开了环状RNA circ‑26782在制备脊髓损伤诊疗药物中的应用，属于生物医药技术领域。本发明通过构建大鼠脊髓损伤半切模型，取损伤不同时间点的脊髓组织，通过RNA‑seq及生物信息学分析，挑选损伤后表达变化明显的circRNAs。针对筛选到的circRNAs设计特异性的背向引物，再通过PCR验证以及测序鉴定，得知环状RNA circ‑26782在脊髓损伤后表达持续下降。因此，可以通过下调或者抑制机体circ‑26782的表达，促进神经元轴突再生，进而有利于中枢神经损伤修复。

权利要求

1.环状RNA circ‑26782抑制剂在制备脊髓损伤治疗药物中的应用，所述环状RNA circ‑26782的cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，首尾连接成环状结构。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述环状RNA circ‑26782抑制剂为核酸。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述核酸为siRNA，该siRNA的序列如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示。

说明书

环状RNA circ‑26782在制备脊髓损伤诊疗药物中的应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物医药技术领域，具体涉及环状RNA circ‑26782在制备脊髓损伤诊疗药物中的应用。

背景技术

[0002] 中枢神经损伤修复是长期以来尚未解决的医学难题，损伤后如何提高神经元的再生能力促进轴突再生一直是神经再生研究领域中最受关注的热点。脊髓损伤后机体会发生一系列细胞和分子水平上的变化，涉及多种细胞，包括神经元细胞、星形胶质细胞、少突细胞、小胶质细胞、血管内皮细胞等，影响轴突损伤后的再生微环境。当神经损伤轴突断裂后，轴突顺行、逆行运输中断，远端轴突溃变，近端轴突回缩。但轴突可以通过再生的方法，与靶细胞可以形成功能性的突触，这也是脊髓损伤后运动和神经功能恢复的基础和目标。一般来说，脊髓损伤后，损伤轴突再生或/和芽生并不少见，但由于胶质瘢痕的形成、轴突生长抑制因子的存在、神经营养因子分泌的不足以及神经元内在生长状态等因素的影响，神经损伤后轴突再生比较困难。因此，促进脊髓损伤后轴突再生是治疗脊髓损伤首要解决的问题。

[0003] 环状RNA（Circular RNAs，circRNAs）是一类新的具有闭合环状结构的内源性非编码RNA，与线性RNAs（信使RNAs[mRNAs]）、microRNAs（miRNAs）相比，circRNAs不具有5’帽状和3’尾状结构，而其共价闭环结构则是通过反向剪接产生的。越来越多的研究支持circRNAs通过充当miRNA海绵，与RNA结合蛋白相互作用，调节转录，从而影响了包括癌症、心血管疾病和神经系统疾病等多种疾病的发生发展。目前关于circRNAs的研究主要集中在癌症方面，其在中枢神经系统损伤修复中的作用鲜有报道，尤其是在神经轴突再生调节方面。

发明内容

[0004] 本发明的目的是提供环状RNA circ‑26782在制备脊髓损伤诊断试剂或治疗药物中的应用。

[0005] 为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

[0006] 环状RNA circ‑26782在制备脊髓损伤诊断试剂中的应用，所述环状RNA circ‑26782的cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，首尾连接成环状结构。

[0007] 进一步地，所述脊髓损伤为中枢神经系统脊髓损伤。

[0008] 进一步地，所述诊断试剂还包括检测所述环状RNA circ‑26782的引物对，该引物对序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。

[0009] 环状RNA circ‑26782在筛选脊髓损伤治疗药物中的应用。

[0010] 进一步地，所述脊髓损伤为中枢神经系统脊髓损伤。

[0011] 环状RNA circ‑26782抑制剂在制备脊髓损伤治疗药物中的应用。

[0012] 进一步地，所述脊髓损伤为中枢神经系统脊髓损伤。

[0013] 进一步地，所述环状RNA circ‑26782抑制剂为小分子化合物、蛋白、多肽、多糖、糖蛋白、糖肽或核酸中的一种或几种。

[0014] 进一步地，所述核酸为siRNA，该siRNA的序列如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示。

[0015] 本发明通过构建大鼠脊髓损伤半切模型，取损伤不同时间点的脊髓组织，通过RNA‑seq及生物信息学分析，挑选损伤后表达变化明显的circRNAs。针对筛选到的circRNAs设计特异性的背向引物，再通过PCR验证以及测序鉴定，得知环状RNA circ‑26782在脊髓损伤后表达持续下降。另外，在原代培养的E14脊髓神经元中，设计siRNA干扰circ‑26782的表达，可以明显促进神经元轴突的生长。

附图说明

[0016] 图1 为实施例1中circ‑26782在大鼠脊髓损伤后脊髓组织中不同时间点的表达变化（以GAPDH为内参）。

[0017] 图2为实施例2中circ‑26782的siRNA 对原代培养E14脊髓神经元中circ‑26782表达的影响（以GAPDH为内参）。

[0018] 图3为实施例2 中circ‑26782的siRNA干扰circ‑26782对E14脊髓神经元轴突的影响。

具体实施方式

[0019] 本发明构建大鼠脊髓损伤半切模型，取损伤不同时间点的脊髓组织，通过RNA‑seq及生物信息学分析，挑选损伤后表达变化明显的circRNAs。针对筛选到的circRNAs设计特异性的背向引物，再通过PCR验证以及测序鉴定，获得一种新的环状RNA circ‑26782。在原代培养的E14脊髓神经元中，设计siRNA干扰circ‑26782的表达，可以明显促进神经元轴突的生长。

[0020] 以下通过实施例说明本发明的具体步骤，但不受实施例限制。

[0021] 在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

[0022] 下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

[0023] 在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。

[0024] 实施例1

[0025] circ‑26782的表达与鉴定

[0026] 对SD（Sprague Dawley）大鼠脊髓半切损伤后不同时间点（0 d、1 d、3 d、7 d、14 d、21 d和28 d）的脊髓组织进行RNA‑seq。根据测序结果挑选全部由外显子组成且环 > 500 nt的表达差异明显的circRNAs。测序结果分析筛选出来的circRNA，进一步通过PCR验证circRNA的存在。根据circRNAs引物设计原则对这些circRNAs设计背向引物，每个circRNA使用NCBI设计引物。根据引物信息选择不同的退火温度进行PCR扩增，再通过琼脂糖凝胶电泳选出条带大小与预期相符的circRNAs，送公司测序，并将测序结果与原始序列比对验证其是否跨越环化位点。最终得到与预期条带大小一致且测序鉴定过环化位点的circRNAs，并挑选其中的circ‑26782进行进一步研究，circ‑26782的cDNA序列如SEQ ID NO:1所示。

[0027] 一、脊髓组织RNA提取

[0028] 取鼠脊髓T 9半切损伤后不同时间点（0 d、1 d、3 d、7 d、14 d、21 d和28 d）的损®伤处近端5 mm脊髓组织按TRIZOL Reagent（Thermo fisher）说明书提取组织RNA。大鼠脊® 
髓损伤后不同时间点的损伤组织放入1.5 mL RNase‑free EP管，加入1 mL TRIZOLReagent（Thermo fisher）；将EP管置于冰中并使用电动匀浆器将组织匀浆，冰上裂解5 min。 加入三氯甲烷200 µL，涡旋剧烈振荡20 s，室温静置5 min；13000 rpm，4 ℃ 离心15 min。小心仔细吸取上清，加入异丙醇500 µL，上下颠倒轻柔混匀，室温静置10 min，13000 rpm，4 ℃离心15 min，弃除上清。加入1 mL 75%乙醇，轻轻洗涤沉淀，4 ℃离心13000 rpm，5 min；去除上清，吹干。加入适量RNase‑free H2O，65 ℃促溶10 min；检测RNA的OD值及浓度，‑80 ℃保存备用。

[0029] 二、RNA逆转录合成cDNA

[0030] 使用逆转录试剂盒（Vazyme R312‑01），将500 ng的RNA逆转录为cDNA。

[0031] 冰上操作，每个反应体系20 µL，如下：

[0032]试剂 使用量
5 × gDNA wiper Mix 2 µL
10 × RT Mix 2 µL
HiScript®III Enzyme Mix 2 µL
Random hexamers 1 µL
Total RNA 500 ng
RNase‑free H2O up to 20 µL

[0033] 反应程序为：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 sec，4 ℃ ∞。

[0034] 三、qRT‑PCR

[0035] 根据circRNAs引物设计原则设计circRNAs qRT‑PCR引物序列。

[0036] circ‑26782 qRT‑PCR引物

[0037] circ‑26782‑F      5’ ‑ acgagagccattctgcaaca ‑3’ （SEQ ID NO:2）[0038] circ‑26782‑R      5’ ‑ atgccacaatccagagacaagt ‑3’ （SEQ ID NO:3）[0039] 将逆转录反应得到的cDNA，按照1∶5稀释，进行如下qRT‑PCR反应。

[0040] (1) 按下列组份配制qRT‑PCR反应液：

[0041] 试剂 使用量2 × AceQ qPCR SYBR Green Master Mix (Without ROX) 5 µL
Primer F (10 µM) 0.5 µL
Primer R (10 µM) 0.5µL
Template DNA/cDNA 1 µL
RNase‑free H2O 3 µL
Total 10 µL

[0042] (2) 反应液混匀，Real‑time PCR仪反应程序如下：

[0043] Stage 1：           95 ℃  5 min

[0044] Stage 2：           Cycle： 40

[0045] 95 ℃  10 sec

[0046] 60 ℃  30 sec

[0047] Stage 3：           95 ℃  15 sec

[0048]                    60 ℃  1 min

[0049] 95℃  15 sec

[0050] (3) 反应设置3个复孔，内参为GAPDH，程序结束后，查看溶解曲线与扩增曲线，舍去误差较大的实验数据，根据具体实验要求，对数据进行统计分析。

[0051] (4) 考察上述circRNA在大鼠脊髓损伤后受损脊髓组织中不同时间点的表达变化，结果如图1所示，表明circ‑26782在脊髓损伤后表达持续下降，* P < 0.05，** P  < 0.01。

[0052] 实施例2

[0053] circRNA的功能验证

[0054] 一、原代E14天脊髓神经元的培养

[0055] 1. 取SD 孕鼠（E14）用乙醚麻醉，颈椎脱臼处死后75％酒精消毒，快速带进细胞房，取出胎鼠，将带有胎盘的胎鼠取出置于冰块上大皿中，破开羊膜，取出胎鼠，将胎鼠置于预先放有预冷的Hanks解剖液（碧云天公司，货号:：C0218；2%青链霉素+2.5 μg/mL两性霉素）的中皿中，断头，将胎鼠身子放入一个新的放有预冷的Hanks解剖液的中皿中；于体视显微镜下完整分离脊髓并剥膜，将脊髓组织放入一个预先加了Hanks解剖液的小皿中。

[0056] 2. 待全部胎鼠脊髓取出后，弃小皿中Hanks解剖液，显微剪剪碎脊髓组织，加入预温的0.125%的胰酶3 mL ，37度消化30分钟，每5分钟晃动一下小皿。

[0057] 3. 弃胰酶，加入新鲜DMEM/F12完全培养基3 mL终止消化，吹打10‑15次形成单细胞悬液，静置2‑3 min。（如果还有组织沉淀下来，取上清置于新离心管，重新加入2 mL DMEM/F12完全培养基，吹打10‑15次形成单细胞悬液），取上清液过400目筛网（过筛前，用完培在反面湿润）。

[0058] 4. 1200 rpm×5 min 离心去除上清液，加入10 mL DMEM/F12完全培养基重悬细胞，混匀。

[0059] 5. 取1 mL细胞悬液至一新的15 mL离心管中，加入9 mL DMEM/F12完全培养基，吹打混匀，取10 μL细胞悬液计数。

[0060] 6. 1200 rpm×5 min 离心去除上清液，根据细胞浓度加入合适体积的6
Neurobasal完全培养基重悬细胞，按每孔3×10个细胞接种至6孔板中，37 ℃ ，5% CO2培养箱培养。

[0061] 二、E14天脊髓神经元转染

[0062] 将取材的神经元计数，吸取一定量的细胞与siRNA混合，充分混匀，使其最终浓度6
达到每管100 µL 混合液中含有2.5×10 神经元细胞 + 200 nM的siRNA, 其中细胞体积为 90 µL，siRNA体积为10 µL。然后参照NEPA21（NEPAGENE公司） 原代神经元细胞电转染操作步骤进行电转。

[0063] circ‑26782 siRNA如下所示：

[0064] 正义链: 5’ ‑ gggaaagaauugagggccgtt ‑3’ （SEQ ID NO:4）[0065] 反义链: 5’ ‑ cggcccucaauucuuuccctt ‑3’ （SEQ ID NO:5）[0066] 三、神经元细胞RNA提取、逆转录及qRT‑PCR

[0067] 神经元细胞分别转染特异性针对circ‑26782 siRNA及其对照siRNA Negative ®Control（Ctrl），48 h后，收细胞，按TRIZOL Reagent（Thermo fisher）说明书提取神经元细胞RNA，逆转录，进行qRT‑PCR，方法同实施例1中所述。

[0068] 结果如图2所示，siRNA处理48h后，circ‑26782 siRNA可以显著干扰circ‑26782在神经元细胞中的表达，** P < 0.01。

[0069] 四、神经元细胞免疫组化和轴突长度测量

[0070] 将玻片置入24孔板，用多聚赖氨酸4摄氏度包被过夜，去离子水清洗三遍，紫外照射30 min后备用。将电转后的神经元细胞培养在玻片上，密度适度均匀。 48 h用复温的 PBS 清洗一遍，然后用神经元细胞固定液（4%多聚甲醛 + 0.2%戊二醛 + 1×PHEM + 0.1%Triton X‑100，现用现配并复温，每孔 300 μL）固定细胞 30 min，PBS 清洗 3 遍，每遍 5 min。用细胞封闭液（提前复温，每孔 300 μL）37℃封闭 1 h；加入一抗（Tuj1, 1:1000、GFAP, 1:1000）4℃过夜。第二天从冰箱取出培养皿，回收一抗并用PBS清洗3遍以上，每次5min。避光孵育相应的二抗2h，然后使用Hoechst染核15min，PBS洗三遍，封片后拍照。神经元轴突长度使用image‑pro plus 6.0 （美国MEDIA CYBERNETICS公司）进行测量。

[0071] 结果如图3所示，相比于对照组，circ‑26782 siRNA处理48h后可以显著促进神经元轴突的生长，** P < 0.01。