硝基还原酶响应的诊疗一体化探针及其制备方法与应用转让专利
申请号 : CN202110522757.7
文献号 : CN113292541B
文献日 : 2022-04-05
发明人 : 李丽红 , 张琪 , 任国栋 , 张敏 , 刁海鹏 , 刘文 , 王浩江 , 王斌
申请人 : 山西医科大学
摘要 :
权利要求 :
1.一种硝基还原酶响应的诊疗一体化探针,其特征在于,结构通式如下:式中,R为甲基、乙基、丙基中的任意一种。
2.一种权利要求1所述的硝基还原酶响应的诊疗一体化探针的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
步骤1,在有机溶剂中加入双氧水和三氟乙酸酐进行反应;
步骤2,反应结束后,加入近红外荧光染料继续反应;
步骤3,反应结束后,对反应液进行分离提纯,即可得到所述诊疗一体化探针。
3.根据权利要求2所述的一种硝基还原酶响应的诊疗一体化探针的制备方法,其特征在于:所述步骤1中有机溶剂至少为四氢呋喃、N,N‑二甲基甲酰胺、二氯甲烷、氯仿、乙腈、甲醇中的一种;所述步骤2中的近红外荧光染料的结构式为:式中,R为甲基、乙基、丙基中的任意一种。
4.根据权利要求2所述的一种硝基还原酶响应的诊疗一体化探针的制备方法,其特征在于:所述步骤1中的反应时间为10 100 min,反应温度为‑10 30 ℃;所述步骤2中的反应~ ~
时间为0.5 6 h,反应温度为0 40 ℃。
~ ~
5.根据权利要求2所述的一种硝基还原酶响应的诊疗一体化探针的制备方法,其特征在于:所述步骤1中有机溶剂的体积为1 20 mL,步骤2中近红外荧光染料与步骤1中的双氧~
水和三氟乙酸酐的摩尔比为1:3 9:4 12。
~ ~
6.根据权利要求2所述的一种硝基还原酶响应的诊疗一体化探针的制备方法,其特征在于:所述步骤3中对反应液进行分离提纯的具体过程为,将反应液用二氯甲烷和水进行萃取,萃取后将有机相进行减压蒸馏,残渣经柱硅胶色谱柱分离,柱硅胶色谱柱分离的洗脱剂为体积比为20:1的二氯甲烷和甲醇。
7.根据权利要求4所述的一种硝基还原酶响应的诊疗一体化探针的制备方法,其特征在于:所述步骤1的最佳反应时间为30min,最佳反应温度为0 ℃;所述步骤2的最佳反应时间为2 h,最佳反应温度为25 ℃。
8.根据权利要求5所述的一种硝基还原酶响应的诊疗一体化探针的制备方法,其特征在于:所述步骤1中有机溶剂的最佳体积为2 mL,所述步骤2中近红外荧光染料与步骤3中的双氧水和三氟乙酸酐的最佳摩尔比为1:6:8。
说明书 :
硝基还原酶响应的诊疗一体化探针及其制备方法与应用
技术领域
背景技术
量、降低死亡率的必由之路。诊疗一体化是一种兼具疾病的诊断和监测及药物治疗的新型
生物医学技术,可同时具备肿瘤监测、抗肿瘤治疗、疗效评估等多重功能。缺氧是肿瘤微环
境的重要特征之一,也是研究肿瘤早期诊断和治疗的关键靶点,缺氧微环境下,肿瘤细胞发
生一系列代谢和生物学特性改变,包括硝基还原酶高表达,由此可见,发展硝基还原酶响应
的诊疗一体化探针对于恶性肿瘤的早期诊断和有效治疗都将具有重大的意义。
光敏剂利用光能将分子氧转化并产生活性氧,然后通过多因素机制杀死肿瘤细胞的新型肿
瘤治疗模式。光动力治疗具有非侵入性、副作用少、抗癌谱广等优点,在临床肿瘤治疗中具
有广阔的应用前景。而合成具有光敏能力的近红外荧光探针则可在体内同时进行肿瘤的近
红外成像和治疗,为肿瘤的诊疗一体化提供新的技术手段。
发明内容
离的洗脱剂为体积比为20:1的二氯甲烷和甲醇。
附图说明
一体化探针(10μM)与硝基还原酶(400ng/mL)在NADH(250μM)存在下反应后的吸收光谱。
450ng/mL;NADH浓度为250μM。
合并通道。
2
光辐照时间从下到上依次为0,1,2,3,4,5,6,7,8和9min,功率密度为0.25W/cm ;图9B为荧
光光谱随激光功率密度的变化,图中激光功率密度从下到上依次为0,0.05,0.10,0.15,
2
0.20和0.25W/cm,辐照时间为5min。
具体实施方式
0.1mmol)溶于二氯甲烷(2mL)后加入上述溶液中继续反应2h,反应液用二氯甲烷和水萃取,
有机相减压蒸干得到粗产物,用二氯甲烷/甲醇(20:1,V/V)作为洗脱剂经柱硅胶色谱柱分
离,得到诊疗一体化探针,为紫色粉末。
2H,),7.64‑7.61(m,3H),7.25(s,1H),6.81(d,1H,J=15.6Hz),4.51(t,2H,J=7.2Hz),2.82
(t,2H,J=6.0Hz),2.76(t,2H,J=6.0Hz),2.00(m,4H),1.90(s,6H),1.12(t,3H,J=
13
7.2Hz). C NMR(100MHz,298K,CD3OD):δ180.2,157.8,152.2,148.4,146.4,143.0,141.2,
134.4,129.1,128.5,128.1,127.9,127.4,122.7,119.5,115.3,113.8,110.6,107.7,70.1,
+ +
51.6,29.2,26.4,23.6,21.3,19.9,10.2.高分辨质谱:C28H29N2O3 ,M ;计算值:441.2173;测
定值:441.2171(图3)。
溶液(PBS,0.01M)中,然后加入25μL NADH母液和不同量的硝基还原酶溶液,再用PBS定容至
5mL。37℃反应10分钟后,测试其紫外‑可见吸收光谱和荧光发射光谱。荧光发射光谱测定时
以660nm激发,激发和发射狭缝宽度分别为20nm和10nm。
后的吸收光谱。图5所示为诊疗一体化探针对硝基还原酶的荧光响应图,硝基还原酶的浓度
范围为0‑450ng/mL。图5中硝基还原酶的浓度从下到上依次为0,25,50,75,100,125,150,
200,250,300,350,400和450ng/mL。以上实验说明诊疗一体化探针对硝基还原酶表现出显
著的荧光增强响应。
12、24、36和48h后移除培养基,细胞用PBS清洗三次,再与本发明制备的诊疗一体化探针(10
μM)共孵育30min后置于激光共聚焦显微镜成像。成像激发波长为635nm,发射波长的收集范
围为650‑750nm。
肿瘤细胞的缺氧状态进行荧光成像。
氧微环境的荧光增强响应是由于缺氧微环境中过表达的硝基还原酶所引起的。
7
以1×10个/mL的密度进行稀释,稀释完成后放置于冰上,用6%水合氯醛麻醉裸鼠,取200μ
L细胞悬液经皮下注射到裸鼠右侧腋下,每隔一天称量裸鼠体重并测量肿瘤大小,按公式V
2 3
=a*b/2(a为长径,b为短径)计算肿瘤体积,待体积超过50mm时进行成像实验。
750nm。
光逐渐变强,在4h肿瘤部位荧光强度达到最大。
探针P1(10μM)与硝基还原酶(400ng/mL)、NADH(250μM)在37℃摇床中反应10min,向反应体
系中加入活化好的DCFH‑DA(5nM),然后用660nm激光照射反应液一定时间后测试荧光光谱,
荧光激发波长为490nm。
0,1,2,3,4,5,6,7,8和9min,激光功率密度为0.25W/cm ;图9B所示为荧光光谱随激光功率
2
密度的变化。图中激光功率密度从下到上依次为0,0.05,0.10,0.15,0.20和0.25W/cm ,激
光辐照时间为5min。可以看出,随着激光辐照时间的延长或者激光功率密度的增大,体系在
530nm处的荧光均逐渐增强,表明诊疗一体化探针与硝基还原酶反应体系在660nm激光照射
下具有产生活性氧的能力,可用于光动力治疗。
2
诊疗一体化探针(10μM)并孵育30min,随后用PBS清洗3次。激光组用660nm激光(0.25W/cm)
照射10min,对照组不予光照,然后分别加入商品化的Calcein‑AM和PI试剂,继续避光30min
后用荧光显微镜观察。
大量死亡,与上述MTT结果一致,再次证实了诊疗一体化探针对缺氧肿瘤细胞的光动力杀伤
性能。
2
L相对应的药物,激光组在注射药物2h后通过660nm激光(0.25W/cm)照射10min,治疗5次。
在21天的治疗期内,每隔一天记录裸鼠的体重和肿瘤体积,待上述实验结束后剖出肿瘤并
拍照。
测肝功能指标天冬氨酸转氨酶(AST)和丙氨酸转氨酶(ALT)以及肾功能指标尿素氮(BUN);
完成上述操作后将裸鼠处死,取出心、肝、脾、肺、肾以及肿瘤,用4%的多聚甲醛固定,石蜡
包埋切片后用苏木精和曙红进行染色,在荧光显微镜下观察。
在正常范围内;图15所示为不同组裸鼠在治疗21天后各主要脏器及肿瘤组织的病理切片分
析,结果显示各主要脏器无明显异常,这些结果均表明诊疗一体化探针P1具有良好的生物
安全性,基于该探针的光动力治疗无明显副作用。
行替换或改变均在本发明的保护范围之内。