新城疫病毒疫苗

摘要

本发明涉及生物技术领域，具体而言，提供了一种新城疫病毒疫苗。制备新城疫病毒疫苗的蛋白，包括新城疫病毒的F蛋白和新城疫病毒的HN蛋白，其中，编码F蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1(基因Ⅶ型)或SEQID NO.3(基因Ⅱ型)所示，编码HN蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2(基因Ⅱ型)或SEQ ID NO.4(基因Ⅶ型)所示。该蛋白适用于真核细胞表达系统，简化了新城疫病毒疫苗活性成分制备的工艺，同时降低了成本。并且，该蛋白具有广谱抗原性，可以实现良好的交叉保护效果。

权利要求

1.一种制备新城疫病毒疫苗的蛋白组，其特征在于，所述蛋白组为如下的a）‑b）中的任一种：a）SEQ ID NO.1编码的F蛋白和SEQ ID NO.2编码的HN蛋白；

b）SEQ ID NO.3编码的F蛋白和SEQ ID NO.4编码的HN蛋白。

2.一种制备新城疫病毒疫苗的蛋白，其特征在于，所述蛋白为如下的c）‑d）中的任一种：c）SEQ ID NO.5编码的融合蛋白；

d）SEQ ID NO.6编码的融合蛋白。

3.权利要求1所述蛋白组或权利要求2所述蛋白的应用，其中所述应用为如下A）‑C）的任一种：A）制备新城疫病毒疫苗；

B）制备新城疫病毒抗体；

C）制备新城疫病毒诊断抗原。

4.与权利要求1所述蛋白组或权利要求2所述蛋白相关的生物材料，其特征在于，所述生物材料为如下a）‑d）任一种：a）核酸分子，编码权利要求1或2所述的蛋白；

b）表达盒，含有a）核酸分子；

c）重组载体，含有a）核酸分子或b）表达盒；

d）真核细胞，含有a）核酸分子、b）表达盒或c）重组载体。

5.根据权利要求4所述的生物材料，其特征在于，所述核酸分子如A）‑D）任一种：A）SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；

B）SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；

C）SEQ ID NO.5；

D）SEQ ID NO.6。

6.根据权利要求4所述的生物材料，其特征在于，所述重组载体选自pcDNA3.1、pEE6.4、pEE12.4或pGL4.13。

7.根据权利要求4所述的生物材料，其特征在于，所述真核细胞为CHO。

8.一种新城疫病毒疫苗，其特征在于，活性成分为权利要求1所述的蛋白组或权利要求

2所述的蛋白。

9.根据权利要求8所述的新城疫病毒疫苗，其特征在于，还包括佐剂。

10.根据权利要求9所述的新城疫病毒疫苗，其特征在于，所述佐剂为纳米佐剂。

11.根据权利要求9所述的新城疫病毒疫苗，其特征在于，所述佐剂包括氢氧化铝胶、矿物油、卡波姆、Gel01、Gel02、蜂胶、ISA206或ISA760VG。

说明书

新城疫病毒疫苗

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种新城疫病毒疫苗。

背景技术

[0002] 新城疫病毒(New castle Disease Virus，NDV)属于副黏病毒科，腮腺炎病毒属的单股负链RNA病毒，是危害养禽业最重要的传染性病毒之一。目前的新城疫病毒疫苗主要有以下形式：1、鸡胚生产灭活疫苗，缺点是工艺复杂、污染环境、成本高；2、将致病相关蛋白利用分子生物学技术进行重组表达制备亚单位疫苗，缺点是操作繁琐、保护能力差。

[0003] 在中国，新城疫病毒的流行基因型以基因Ⅱ型、基因Ⅶ或两种亚型同时存在的情况为主，然而，目前技术对于两个亚型交叉保护效果不佳，并且防疫成本较高，这给临床防控造成了很大的压力。

[0004] 有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

[0005] 本发明的第一目的在于提供一种制备新城疫病毒疫苗的蛋白。

[0006] 本发明的第二目的在于提供上述蛋白的应用。

[0007] 本发明的第三目的在于提供上述蛋白的相关生物材料。

[0008] 本发明的第四目的在于提供一种新城疫病毒疫苗。

[0009] 为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

[0010] 一种制备新城疫病毒疫苗的蛋白，包括新城疫病毒的F蛋白和新城疫病毒的HN蛋白，其中，其中，编码F蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1(基因Ⅶ型)或SEQ ID NO.3(基因Ⅱ型)所示，编码HN蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2(基因Ⅱ型)或SEQ ID NO.4(基因Ⅶ型)所示。

[0011] 进一步地，所述蛋白为如下的a)‑d)中的任一种：

[0012] a)SEQ ID NO.1编码的F蛋白和SEQ ID NO.2编码的HN蛋白；

[0013] b)SEQ ID NO.3编码的F蛋白和SEQ ID NO.4编码的HN蛋白；

[0014] c)SEQ ID NO.5编码的融合蛋白；

[0015] d)SEQ ID NO.6编码的融合蛋白。

[0016] 上述蛋白的应用为如下A)‑D)的任一种：

[0017] A)制备新城疫病毒疫苗；

[0018] B)制备新城疫病毒抗体；

[0019] C)制备检测新城疫病毒的试剂盒；

[0020] D)制备新城疫病毒诊断抗原。

[0021] 与上述蛋白相关的生物材料，包括如下a)‑d)任一种：

[0022] a)核酸分子，编码上述蛋白；

[0023] b)表达盒，含有a)核酸分子；

[0024] c)重组载体，含有a)核酸分子或b)表达盒；

[0025] d)真核细胞，含有a)核酸分子、b)表达盒或c)重组载体。

[0026] 进一步地，所述核酸分子如A)‑E)任一种：

[0027] A)SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；

[0028] B)SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；

[0029] C)SEQ ID NO.5；

[0030] D)SEQ ID NO.6；

[0031] E)与A)‑D)任一项核酸分子具有75％以上同一性，且编码上述蛋白的核酸分子。

[0032] 进一步地，所述重组载体包括pcDNA3.1、pEE6.4、pEE12.4或pGL4.13。

[0033] 进一步地，所述真核细胞为CHO。

[0034] 一种新城疫病毒疫苗，活性成分包括上述蛋白；

[0035] 进一步地，还包括佐剂。

[0036] 进一步地，所述佐剂包括氢氧化铝胶、矿物油、卡波姆、Gel01、Gel02、纳米佐剂、蜂胶、ISA206或ISA760VG。

[0037] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：

[0038] 本申请提供一种用于制备新城疫病毒疫苗的蛋白，该蛋白适用于真核细胞表达系统，蛋白可以稳定高产量表达，直接应用于相关技术，简化了新城疫病毒疫苗活性成分制备的工艺，同时降低了成本，其相关的生物材料均可作为生物模块直接应用，适合大规模批量生产。同时，该蛋白具有广谱抗原性，可以实现良好的交叉保护效果。这使得应用其制备的疫苗成本低同时免疫效果好。

具体实施方式

[0039] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。

[0040] 除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。

[0041] 本发明首先提供一种制备新城疫病毒疫苗的蛋白，该蛋白包括新城疫病毒的F蛋白和新城疫病毒的HN蛋白，其中，编码F蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3所示，编码HN蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4所示。

[0042] 需要说明的是，SEQ ID NO.1编码的F蛋白来源于新城疫病毒基因Ⅶ型；SEQ ID NO.3编码的F蛋白来源于新城疫病毒基因Ⅱ型；SEQ ID NO.2编码的HN蛋白来源于新城疫病毒基因Ⅱ型；SEQ ID NO.4编码的HN蛋白来源于新城疫病毒基因Ⅶ型，同时，SEQ ID NO.1‑4的序列均独立地为在天然Ⅶ型或Ⅱ型的基础上进行了优化和改进得到的。

[0043] 该蛋白可以为F蛋白和HN蛋白的混合物，也可以为F蛋白和HN蛋白的融合蛋白，无论哪种方式，均可对新城疫病毒产生良好的免疫效果。

[0044] 该蛋白适用于真核细胞表达系统，简化了新城疫病毒疫苗活性成分制备的工艺，同时降低了成本。并且，该蛋白具有广谱抗原性，可以实现良好的交叉保护效果。这使得应用其制备的疫苗成本低同时免疫效果好。

[0045] 编码基因Ⅶ型F蛋白的序列如下：

[0046] ATGGGCAGCAAGCCCAGCACCAGGATCCCCGCCCCCCTGATGCTGATCACCAGGATCATGCCCATCCTGGGCTGCATCTGCCCCACCAGCAGCCTGGACGGCAGGCCCCTGGCCGCCGCCGGCATCGTGGTGACCGGCGACAAGGCCGTGAACGTGTACACCAGCAGCCAGACCGGCAGCATCATCGTGAAGCTGCTGCCCAACATGCCCAGGGACAAGGAGGCCTGCGCCAAGGCCCCCCTGGAGGCCTACAACAGGACCCTGACCACCCTGCTGACCCCCCTGGGCGACAGCATCAGGAAGATCCAGGGCAGCGTGAGCACCAGCGGCGGCAGGAGGCAGAAGAGGTTCATCGGCGCCGTGATCGGCAGCGTGGCCCTGGGCGTGGCCACCGCCGCCCAGATCACCGCCGCCGCCGCCCTGATCCAGGCCAACCAGAACGCCGCCAACATCCTGAGGCTGAAGGAGAGCATCGCCGCCACCAACGAGGCCGTGCACGAGGTGACCGACGGCCTGAGCCAGCTGAGCGTGGCCGTGGGCAAGATGCAGCAGTTCGTGAACGACCAGTTCAACAACACCGCCAGGGAGCTGGACTGCATCAAGATCACCCAGCAGGTGGGCGTGGAGCTGAACCTGTACCTGACCGAGCTGACCACCGTGTTCGGCCCCCAGATCACCAGCCCCGCCCTGACCCAGCTGACCATCCAGGCCCTGTACAACCTGGCCGGCGGCAACATGGACTACCTGCTGACCAAGCTGGGCATCGGCAACAACCAGCTGAGCAGCCTGATCGGCAGCGGCCTGATCACCGGCTACCCCATCCTGTACGACAGCCAGACCCAGCTGCTGGGCATCCAGGTGAACCTGCCCAGCGTGGGCAACCTGAACAACATGAGGGCCACCTACCTGGAGACCCTGAGCGTGAGCACCACCAAGGGCTACGCCAGCGCCCTGGTGCCCAAGGTGGTGACCCAGGTGGGCAGCGTGATCGAGGAGCTGGACACCAGCTACTGCATCGAGAGCGACCTGGACCTGTACTGCACCAGGATCGTGACCTTCCCCATGAGCCCCGGCATCTACAGCTGCCTGAGCGGCAACACCAGCGCCTGCATGTACAGCAAGACCGAGGGCGCCCTGACCACCCCCTACATGGCCCTGAAGGGCAGCGTGATCGCCAACTGCAAGATCACCACCTGCAGGTGCATCGACCCCCCCGGCATCATCAGCCAGAACTACGGCGAGGCCGTGAGCCTGATCGACAGGCACAGCTGCAACGTGCTGAGCCTGGACGGCATCACCCTGAGGCTGAGCGGCGAGTTCGACGCCACCTACCAGAAGAACATCAGCATCCTGGACAGCCAGGTGATCGTGACCGGCAACCTGGACATCAGCACCGAGCTGGGCAACGTGAACAACAGCATCAGCAACGCCCTGGACAAGCTGGAGGAGAGCAACAACAAGCTGGAGAAGGTGAACGTGAGGCTGACCAGCACCAGCGCCCTGATCACCTACATCGTGCTGACCGTGATCAGCCTGGTGCTGGGCGCCCTGAGCCTGGGCCTGGCCTGCTACCTGATGTACAAGCAGAAGGCCCAGCAGAAGACCCTGCTGTGGCTGGGCAACAACACCCTGGACCAGATGAGGGCCACCACCAGGGCC(SEQ ID NO.1)。

[0047] 编码基因Ⅱ型HN蛋白的序列如下：

[0048] ATGGACAGGGCCGTGAGCCAGGTGGCCCTGGAGAACGACGAGAGGGAGGCCAAGAACACCTGGAGGCTGATCTTCAGGATCGCCATCCTGTTCCTGACCGTGGTGACCCTGGCCATCAGCGTGGCCAGCCTGCTGTACAGCATGGGCGCCAGCACCCCCAGCGACCTGGTGGGCATCCCCACCAGGATCAGCAGGGCCGAGGAGAAGATCACCAGCACCCTGGGCAGCAACCAGGACGTGGTGGACAGGATCTACAAGCAGGTGGCCCTGGAGAGCCCCCTGGCCCTGCTGAACACCGAGACCACCATCATGAACGCCATCACCAGCCTGAGCTACCAGATCAACGGCGCCGCCAACAACAGCGGCTGGGGCGCCCCCATCCACGACCCCGACTACATCGGCGGCATCGGCAAGGAGCTGATCGTGGACGACGCCAGCGACGTGACCAGCTTCTACCCCAGCGCCTTCCAGGAGCACCTGAACTTCATCCCCGCCCCCACCACCGGCAGCGGCTGCACCAGGATCCCCAGCTTCGACATGAGCGCCACCCACTACTGCTACACCCACAACGTGATCCTGAGCGGCTGCAGGGACCACAGCCACAGCTACCAGTACCTGGCCCTGGGCGTGCTGAGGACCAGCGCCACCGGCAGGGTGTTCTTCAGCACCCTGAGGAGCATCAACCTGGACGACACCCAGAACAGGAAGAGCTGCAGCGTGAGCGCCACCCCCCTGGGCTGCGACATGCTGTGCAGCAAGGTGACCGAGACCGAGGAGGAGGACTACAACAGCGCCGTGCCCACCAGGATGGTGCACGGCAGGCTGGGCTTCGACGGCCAGTACCACGAGAAGGACCTGGACGTGACCACCCTGTTCGGCGACTGGGTGGCCAACTACCCCGGCGTGGGCGGCGGCAGCTTCATCGACAGCAGGGTGTGGTTCAGCGTGTACGGCGGCCTGAAGCCCAACAGCCCCAGCGACACCGTGCAGGAGGGCAAGTACGTGATCTACAAGAGGTACAACGACACCTGCCCCGACGAGCAGGACTACCAGATCAGGATGGCCAAGAGCAGCTACAAGCCCGGCAGGTTCGGCGGCAAGAGGATCCAGCAGGCCATCCTGAGCATCAAGGTGAGCACCAGCCTGGGCGAGGACCCCGTGCTGACCGTGCCCCCCAACACCGTGACCCTGATGGGCGCCGAGGGCAGGATCCTGACCGTGGGCACCAGCCACTTCCTGTACCAGAGGGGCAGCAGCTACTTCAGCCCCGCCCTGCTGTACCCCATGACCGTGAGCAACAAGACCGCCACCCTGCACAGCCCCTACACCTTCAACGCCTTCACCAGGCCCGGCAGCATCCCCTGCCAGGCCAGCGCCAGGTGCCCCAACAGCTGCGTGACCGGCGTGTACACCGACCCCTACCCCCTGATCTTCTACAGGAACCACACCCTGAGGGGCGTGTTCGGCACCATGCTGGACGGCGTGCAGGCCAGGCTGAACCCCGCCAGCGCCGTGTTCGACAGCACCAGCAGGAGCAGGATCACCAGGGTGAGCAGCAGCAGCACCAAGGCCGCCTACACCACCAGCACCTGCTTCAAGGTGGTGAAGACCAACAAGACCTACTGCCTGAGCATCGCCGAGATCAGCAACACCCTGTTCGGCGAGTTCAGGATCGTGCCCCTGCTGGTGGAGATCCTGAAGGACGACGGCGTGAGGGAGGCCAGGAGCGGC

[0049] (SEQ ID NO.2)。

[0050] 编码基因Ⅱ型F蛋白的序列如下：

[0051] ATGGGCAGCAGGCCCAGCACCAAGAACCCCGCCCCCATGATGCTGACCATCAGGGTGGCCCTGGTGCTGAGCTGCATCTGCCCCGCCAACAGCATCGACGGCAGGCCCCTGGCCGCCGCCGGCATCGTGGTGACCGGCGACAAGGCCGTGAACATCTACACCAGCAGCCAGACCGGCAGCATCATCGTGAAGCTGCTGCCCAACCTGCCCAAGGACAAGGAGGCCTGCGCCAAGGCCCCCCTGGACGCCTACAACAGGACCCTGACCACCCTGCTGACCCCCCTGGGCGACAGCATCAGGAGGATCCAGGAGAGCGTGACCACCAGCGGCGGCGGCAGGCAGGGCAGGCTGATCGGCGCCATCATCGGCGGCGTGGCCCTGGGCGTGGCCACCGCCGCCCAGATCACCGCCGCCGCCGCCCTGATCCAGGCCAAGCAGAACGCCGCCAACATCCTGAGGCTGAAGGAGAGCATCGCCGCCACCAACGAGGCCGTGCACGAGGTGACCGACGGCCTGAGCCAGCTGGCCGTGGCCGTGGGCAAGATGCAGCAGTTCGTGAACGACCAGTTCAACAAGACCGCCCAGGAGCTGGACTGCATCAAGATCGCCCAGCAGGTGGGCGTGGAGCTGAACCTGTACCTGACCGAGCTGACCACCGTGTTCGGCCCCCAGATCACCAGCCCCGCCCTGAACAAGCTGACCATCCAGGCCCTGTACAACCTGGCCGGCGGCAACATGGACTACCTGCTGACCAAGCTGGGCGTGGGCAACAACCAGCTGAGCAGCCTGATCGGCAGCGGCCTGATCACCGGCAACCCCATCCTGTACGACAGCCAGACCCAGCTGCTGGGCATCCAGGTGACCCTGCCCAGCGTGGGCAACCTGAACAACATGAGGGCCACCTACCTGGAGACCCTGAGCGTGAGCACCACCAGGGGCTTCGCCAGCGCCCTGGTGCCCAAGGTGGTGACCCAGGTGGGCAGCGTGATCGAGGAGCTGGACACCAGCTACTGCATCGAGACCGACCTGGACCTGTACTGCACCAGGATCGTGACCTTCCCCATGAGCCCCGGCATCTACAGCTGCCTGAGCGGCAACACCAGCGCCTGCATGTACAGCAAGACCGAGGGCGCCCTGACCACCCCCTACATGACCATCAAGGGCAGCGTGATCGCCAACTGCAAGATGACCACCTGCAGGTGCGTGAACCCCCCCGGCATCATCAGCCAGAACTACGGCGAGGCCGTGAGCCTGATCGACAAGCAGAGCTGCAACGTGCTGAGCCTGGGCGGCATCACCCTGAGGCTGAGCGGCGAGTTCGACGTGACCTACCAGAAGAACATCAGCATCCAGGACAGCCAGGTGATCATCACCGGCAACCTGGACATCAGCACCGAGCTGGGCAACGTGAACAACAGCATCAGCAACGCCCTGAACAAGCTGGAGGAGAGCAACAGGAAGCTGGACAAGGTGAACGTGAAGCTGACCAGCACCAGCGCCCTGATCACCTACATCGTGCTGACCATCATCAGCCTGGTGTTCGGCATCCTGAGCCTGATCCTGGCCTGCTACCTGATGTACAAGCAGAAGGCCCAGCAGAAGACCCTGCTGTGGCTGGGCAACAACACCCTGGACCAGATGAGGGCCACCACCAAGATG(SEQ ID NO.3)。

[0052] 编码基因Ⅶ型HN蛋白的序列如下：

[0053] ATGGACAGGGCCGTGGACAGGGTGGTGCTGGAGAACGAGGAGAGGGAGGCCAAGAACACCTGGAGGCTGGTGTTCAGGATCGCCGTGCTGCTGCTGATGGTGATGACCCTGGCCATCAGCGCCGCCGCCCTGGCCTACAGCACCGGCGCCAGCACCCCCCACGACCTGGCCGGCATCAGCACCATGATCAGCAAGACCGAGGACAAGGTGAGCAGCAGCCTGAGCAGCAGCCAGGACGTGATCGACAGGATCTACAAGCAGGTGGCCCTGGAGAGCCCCCTGGCCCTGCTGAACACCGAGAGCATCATCATGAACGCCATCACCAGCCTGAGCTACCAGATCAACGGCGCCGCCAACAACAGCGGCTGCGGCGCCCCCGTGCACGACCCCGACTACATCGGCGGCATCGGCAAGGAGCTGATCGTGGACGACATCAGCGACGTGACCAGCTTCTACCCCAGCGCCTACCAGGAGCACCTGAACTTCATCCCCGCCCCCACCACCGGCAGCGGCTGCACCAGGATCCCCAGCTTCGACATGAGCACCACCCACTACTGCTACACCCACAACGTGATCCTGAGCGGCTGCAGGGACCACAGCCACAGCCACCAGTACCTGGCCCTGGGCGTGCTGAGGACCAGCGCCACCGGCAGGGTGTTCTTCAGCACCCTGAGGAGCATCAACCTGGACGACACCCAGAACAGGAAGAGCTGCAGCGTGAGCGCCACCCCCCTGGGCTGCGACATGCTGTGCAGCAAGGTGACCGGCACCGAGGAGGAGGACTACAAGAGCGTGGCCCCCACCAGCATGGTGCACGGCAGGCTGGGCTTCGACGGCCAGTACCACGAGAAGGACCTGGACACCGCCGTGCTGTTCAAGGACTGGGTGGCCAACTACCCCGGCGTGGGCGGCGGCAGCTTCATCGACGACAGGGTGTGGTTCCCCGTGTACGGCGGCCTGAAGCCCAACAGCCCCAGCGACACCGCCCAGGAGGGCAAGTACGTGATCTACAAGAGGCACAACAACACCTGCCCCGACGAGCAGGACTACCAGATCAGGATGGCCAAGAGCAGCTACAAGCCCGGCAGGTTCGGCGGCAAGAGGGTGCAGCAGGCCATCCTGAGCATCAAGGTGAGCACCAGCCTGGGCAAGGACCCCGTGCTGACCATCCCCCCCAACACCATCACCCTGATGGGCGCCGAGGGCAGGATCCTGACCGTGGGCACCAGCCACTTCCTGTACCAGAGGGGCAGCAGCTACTTCAGCCCCGCCCTGCTGTACCCCATGACCGTGAACAACAAGACCGCCACCCTGCACAGCCCCTACACCTTCGACGCCTTCACCAGGCCCGGCAGCGTGCCCTGCCAGGCCAGCGCCAGGTGCCCCAACAGCTGCATCACCGGCGTGTACACCGACCCCTACCCCCTGATCTTCCACAGGAACCACACCCTGAGGGGCGTGTTCGGCACCATGCTGGACGACGAGCAGGCCAGGCTGAACCCCGTGAGCGCCGTGTTCGACAACATCAGCAGGAGCAGGGTGACCAGGGTGAGCAGCAGCAGCACCAAGGCCGCCTACACCACCAGCACCTGCTTCAAGGTGGTGAAGACCAACAAGGCCTACTGCCTGAGCATCGCCGAGATCAGCAACACCCTGTTCGGCGAGTTCAGGATCGTGCCCCTGCTGGTGGAGATCCTGAAGGACGACAGCGTG(SEQ ID NO.4)。

[0054] 编码基因Ⅱ型F蛋白和Ⅶ型HN蛋白的序列如下：

[0055] ATGGGCAGCAGGCCCAGCACCAAGAACCCCGCCCCCATGATGCTGACCATCAGGGTGGCCCTGGTGCTGAGCTGCATCTGCCCCGCCAACAGCATCGACGGCAGGCCCCTGGCCGCCGCCGGCATCGTGGTGACCGGCGACAAGGCCGTGAACATCTACACCAGCAGCCAGACCGGCAGCATCATCGTGAAGCTGCTGCCCAACCTGCCCAAGGACAAGGAGGCCTGCGCCAAGGCCCCCCTGGACGCCTACAACAGGACCCTGACCACCCTGCTGACCCCCCTGGGCGACAGCATCAGGAGGATCCAGGAGAGCGTGACCACCAGCGGCGGCGGCAGGCAGGGCAGGCTGATCGGCGCCATCATCGGCGGCGTGGCCCTGGGCGTGGCCACCGCCGCCCAGATCACCGCCGCCGCCGCCCTGATCCAGGCCAAGCAGAACGCCGCCAACATCCTGAGGCTGAAGGAGAGCATCGCCGCCACCAACGAGGCCGTGCACGAGGTGACCGACGGCCTGAGCCAGCTGGCCGTGGCCGTGGGCAAGATGCAGCAGTTCGTGAACGACCAGTTCAACAAGACCGCCCAGGAGCTGGACTGCATCAAGATCGCCCAGCAGGTGGGCGTGGAGCTGAACCTGTACCTGACCGAGCTGACCACCGTGTTCGGCCCCCAGATCACCAGCCCCGCCCTGAACAAGCTGACCATCCAGGCCCTGTACAACCTGGCCGGCGGCAACATGGACTACCTGCTGACCAAGCTGGGCGTGGGCAACAACCAGCTGAGCAGCCTGATCGGCAGCGGCCTGATCACCGGCAACCCCATCCTGTACGACAGCCAGACCCAGCTGCTGGGCATCCAGGTGACCCTGCCCAGCGTGGGCAACCTGAACAACATGAGGGCCACCTACCTGGAGACCCTGAGCGTGAGCACCACCAGGGGCTTCGCCAGCGCCCTGGTGCCCAAGGTGGTGACCCAGGTGGGCAGCGTGATCGAGGAGCTGGACACCAGCTACTGCATCGAGACCGACCTGGACCTGTACTGCACCAGGATCGTGACCTTCCCCATGAGCCCCGGCATCTACAGCTGCCTGAGCGGCAACACCAGCGCCTGCATGTACAGCAAGACCGAGGGCGCCCTGACCACCCCCTACATGACCATCAAGGGCAGCGTGATCGCCAACTGCAAGATGACCACCTGCAGGTGCGTGAACCCCCCCGGCATCATCAGCCAGAACTACGGCGAGGCCGTGAGCCTGATCGACAAGCAGAGCTGCAACGTGCTGAGCCTGGGCGGCATCACCCTGAGGCTGAGCGGCGAGTTCGACGTGACCTACCAGAAGAACATCAGCATCCAGGACAGCCAGGTGATCATCACCGGCAACCTGGACATCAGCACCGAGCTGGGCAACGTGAACAACAGCATCAGCAACGCCCTGAACAAGCTGGAGGAGAGCAACAGGAAGCTGGACAAGGTGAACGTGAAGCTGACCAGCACCAGCGCCCTGATCACCTACATCGTGCTGACCATCATCAGCCTGGTGTTCGGCATCCTGAGCCTGATCCTGGCCTGCTACCTGATGTACAAGCAGAAGGCCCAGCAGAAGACCCTGCTGTGGCTGGGCAACAACACCCTGGACCAGATGAGGGCCACCACCAAGATGGAAATGGACAGGGCCGTGGACAGGGTGGTGCTGGAGAACGAGGAGAGGGAGGCCAAGAACACCTGGAGGCTGGTGTTCAGGATCGCCGTGCTGCTGCTGATGGTGATGACCCTGGCCATCAGCGCCGCCGCCCTGGCCTACAGCACCGGCGCCAGCACCCCCCACGACCTGGCCGGCATCAGCACCATGATCAGCAAGACCGAGGACAAGGTGAGCAGCAGCCTGAGCAGCAGCCAGGACGTGATCGACAGGATCTACAAGCAGGTGGCCCTGGAGAGCCCCCTGGCCCTGCTGAACACCGAGAGCATCATCATGAACGCCATCACCAGCCTGAGCTACCAGATCAACGGCGCCGCCAACAACAGCGGCTGCGGCGCCCCCGTGCACGACCCCGACTACATCGGCGGCATCGGCAAGGAGCTGATCGTGGACGACATCAGCGACGTGACCAGCTTCTACCCCAGCGCCTACCAGGAGCACCTGAACTTCATCCCCGCCCCCACCACCGGCAGCGGCTGCACCAGGATCCCCAGCTTCGACATGAGCACCACCCACTACTGCTACACCCACAACGTGATCCTGAGCGGCTGCAGGGACCACAGCCACAGCCACCAGTACCTGGCCCTGGGCGTGCTGAGGACCAGCGCCACCGGCAGGGTGTTCTTCAGCACCCTGAGGAGCATCAACCTGGACGACACCCAGAACAGGAAGAGCTGCAGCGTGAGCGCCACCCCCCTGGGCTGCGACATGCTGTGCAGCAAGGTGACCGGCACCGAGGAGGAGGACTACAAGAGCGTGGCCCCCACCAGCATGGTGCACGGCAGGCTGGGCTTCGACGGCCAGTACCACGAGAAGGACCTGGACACCGCCGTGCTGTTCAAGGACTGGGTGGCCAACTACCCCGGCGTGGGCGGCGGCAGCTTCATCGACGACAGGGTGTGGTTCCCCGTGTACGGCGGCCTGAAGCCCAACAGCCCCAGCGACACCGCCCAGGAGGGCAAGTACGTGATCTACAAGAGGCACAACAACACCTGCCCCGACGAGCAGGACTACCAGATCAGGATGGCCAAGAGCAGCTACAAGCCCGGCAGGTTCGGCGGCAAGAGGGTGCAGCAGGCCATCCTGAGCATCAAGGTGAGCACCAGCCTGGGCAAGGACCCCGTGCTGACCATCCCCCCCAACACCATCACCCTGATGGGCGCCGAGGGCAGGATCCTGACCGTGGGCACCAGCCACTTCCTGTACCAGAGGGGCAGCAGCTACTTCAGCCCCGCCCTGCTGTACCCCATGACCGTGAACAACAAGACCGCCACCCTGCACAGCCCCTACACCTTCGACGCCTTCACCAGGCCCGGCAGCGTGCCCTGCCAGGCCAGCGCCAGGTGCCCCAACAGCTGCATCACCGGCGTGTACACCGACCCCTACCCCCTGATCTTCCACAGGAACCACACCCTGAGGGGCGTGTTCGGCACCATGCTGGACGACGAGCAGGCCAGGCTGAACCCCGTGAGCGCCGTGTTCGACAACATCAGCAGGAGCAGGGTGACCAGGGTGAGCAGCAGCAGCACCAAGGCCGCCTACACCACCAGCACCTGCTTCAAGGTGGTGAAGACCAACAAGGCCTACTGCCTGAGCATCGCCGAGATCAGCAACACCCTGTTCGGCGAGTTCAGGATCGTGCCCCTGCTGGTGGAGATCCTGAAGGACGACAGCGTG[0056] (SEQ ID NO.6)。

[0057] 编码基因Ⅱ型HN蛋白和Ⅶ型F蛋白的序列如下：

[0058] ATGGGCAGCAAGCCCAGCACCAGGATCCCCGCCCCCCTGATGCTGATCACCAGGATCATGCCCATCCTGGGCTGCATCTGCCCCACCAGCAGCCTGGACGGCAGGCCCCTGGCCGCCGCCGGCATCGTGGTGACCGGCGACAAGGCCGTGAACGTGTACACCAGCAGCCAGACCGGCAGCATCATCGTGAAGCTGCTGCCCAACATGCCCAGGGACAAGGAGGCCTGCGCCAAGGCCCCCCTGGAGGCCTACAACAGGACCCTGACCACCCTGCTGACCCCCCTGGGCGACAGCATCAGGAAGATCCAGGGCAGCGTGAGCACCAGCGGCGGCAGGAGGCAGAAGAGGTTCATCGGCGCCGTGATCGGCAGCGTGGCCCTGGGCGTGGCCACCGCCGCCCAGATCACCGCCGCCGCCGCCCTGATCCAGGCCAACCAGAACGCCGCCAACATCCTGAGGCTGAAGGAGAGCATCGCCGCCACCAACGAGGCCGTGCACGAGGTGACCGACGGCCTGAGCCAGCTGAGCGTGGCCGTGGGCAAGATGCAGCAGTTCGTGAACGACCAGTTCAACAACACCGCCAGGGAGCTGGACTGCATCAAGATCACCCAGCAGGTGGGCGTGGAGCTGAACCTGTACCTGACCGAGCTGACCACCGTGTTCGGCCCCCAGATCACCAGCCCCGCCCTGACCCAGCTGACCATCCAGGCCCTGTACAACCTGGCCGGCGGCAACATGGACTACCTGCTGACCAAGCTGGGCATCGGCAACAACCAGCTGAGCAGCCTGATCGGCAGCGGCCTGATCACCGGCTACCCCATCCTGTACGACAGCCAGACCCAGCTGCTGGGCATCCAGGTGAACCTGCCCAGCGTGGGCAACCTGAACAACATGAGGGCCACCTACCTGGAGACCCTGAGCGTGAGCACCACCAAGGGCTACGCCAGCGCCCTGGTGCCCAAGGTGGTGACCCAGGTGGGCAGCGTGATCGAGGAGCTGGACACCAGCTACTGCATCGAGAGCGACCTGGACCTGTACTGCACCAGGATCGTGACCTTCCCCATGAGCCCCGGCATCTACAGCTGCCTGAGCGGCAACACCAGCGCCTGCATGTACAGCAAGACCGAGGGCGCCCTGACCACCCCCTACATGGCCCTGAAGGGCAGCGTGATCGCCAACTGCAAGATCACCACCTGCAGGTGCATCGACCCCCCCGGCATCATCAGCCAGAACTACGGCGAGGCCGTGAGCCTGATCGACAGGCACAGCTGCAACGTGCTGAGCCTGGACGGCATCACCCTGAGGCTGAGCGGCGAGTTCGACGCCACCTACCAGAAGAACATCAGCATCCTGGACAGCCAGGTGATCGTGACCGGCAACCTGGACATCAGCACCGAGCTGGGCAACGTGAACAACAGCATCAGCAACGCCCTGGACAAGCTGGAGGAGAGCAACAACAAGCTGGAGAAGGTGAACGTGAGGCTGACCAGCACCAGCGCCCTGATCACCTACATCGTGCTGACCGTGATCAGCCTGGTGCTGGGCGCCCTGAGCCTGGGCCTGGCCTGCTACCTGATGTACAAGCAGAAGGCCCAGCAGAAGACCCTGCTGTGGCTGGGCAACAACACCCTGGACCAGATGAGGGCCACCACCAGGGCCGAAATGGACAGGGCCGTGAGCCAGGTGGCCCTGGAGAACGACGAGAGGGAGGCCAAGAACACCTGGAGGCTGATCTTCAGGATCGCCATCCTGTTCCTGACCGTGGTGACCCTGGCCATCAGCGTGGCCAGCCTGCTGTACAGCATGGGCGCCAGCACCCCCAGCGACCTGGTGGGCATCCCCACCAGGATCAGCAGGGCCGAGGAGAAGATCACCAGCACCCTGGGCAGCAACCAGGACGTGGTGGACAGGATCTACAAGCAGGTGGCCCTGGAGAGCCCCCTGGCCCTGCTGAACACCGAGACCACCATCATGAACGCCATCACCAGCCTGAGCTACCAGATCAACGGCGCCGCCAACAACAGCGGCTGGGGCGCCCCCATCCACGACCCCGACTACATCGGCGGCATCGGCAAGGAGCTGATCGTGGACGACGCCAGCGACGTGACCAGCTTCTACCCCAGCGCCTTCCAGGAGCACCTGAACTTCATCCCCGCCCCCACCACCGGCAGCGGCTGCACCAGGATCCCCAGCTTCGACATGAGCGCCACCCACTACTGCTACACCCACAACGTGATCCTGAGCGGCTGCAGGGACCACAGCCACAGCTACCAGTACCTGGCCCTGGGCGTGCTGAGGACCAGCGCCACCGGCAGGGTGTTCTTCAGCACCCTGAGGAGCATCAACCTGGACGACACCCAGAACAGGAAGAGCTGCAGCGTGAGCGCCACCCCCCTGGGCTGCGACATGCTGTGCAGCAAGGTGACCGAGACCGAGGAGGAGGACTACAACAGCGCCGTGCCCACCAGGATGGTGCACGGCAGGCTGGGCTTCGACGGCCAGTACCACGAGAAGGACCTGGACGTGACCACCCTGTTCGGCGACTGGGTGGCCAACTACCCCGGCGTGGGCGGCGGCAGCTTCATCGACAGCAGGGTGTGGTTCAGCGTGTACGGCGGCCTGAAGCCCAACAGCCCCAGCGACACCGTGCAGGAGGGCAAGTACGTGATCTACAAGAGGTACAACGACACCTGCCCCGACGAGCAGGACTACCAGATCAGGATGGCCAAGAGCAGCTACAAGCCCGGCAGGTTCGGCGGCAAGAGGATCCAGCAGGCCATCCTGAGCATCAAGGTGAGCACCAGCCTGGGCGAGGACCCCGTGCTGACCGTGCCCCCCAACACCGTGACCCTGATGGGCGCCGAGGGCAGGATCCTGACCGTGGGCACCAGCCACTTCCTGTACCAGAGGGGCAGCAGCTACTTCAGCCCCGCCCTGCTGTACCCCATGACCGTGAGCAACAAGACCGCCACCCTGCACAGCCCCTACACCTTCAACGCCTTCACCAGGCCCGGCAGCATCCCCTGCCAGGCCAGCGCCAGGTGCCCCAACAGCTGCGTGACCGGCGTGTACACCGACCCCTACCCCCTGATCTTCTACAGGAACCACACCCTGAGGGGCGTGTTCGGCACCATGCTGGACGGCGTGCAGGCCAGGCTGAACCCCGCCAGCGCCGTGTTCGACAGCACCAGCAGGAGCAGGATCACCAGGGTGAGCAGCAGCAGCACCAAGGCCGCCTACACCACCAGCACCTGCTTCAAGGTGGTGAAGACCAACAAGACCTACTGCCTGAGCATCGCCGAGATCAGCAACACCCTGTTCGGCGAGTTCAGGATCGTGCCCCTGCTGGTGGAGATCCTGAAGGACGACGGCGTGAGGGAGGCCAGGAGCGGC(SEQ ID NO.5)。

[0059] 在一种优选地实施方式中，F蛋白选自基因Ⅱ型，HN蛋白选自基因Ⅶ型，或者，F蛋白选自基因Ⅶ型，HN蛋白选自基因Ⅱ型。两种形式的蛋白可以实现两种亚型病毒的同时免疫，实现交叉保护。具体地，可以为如下a)‑d)中的任一种：

[0060] a)SEQ ID NO.1编码的F蛋白和SEQ ID NO.2编码的HN蛋白；

[0061] b)SEQ ID NO.3编码的F蛋白和SEQ ID NO.4编码的HN蛋白；

[0062] c)SEQ ID NO.5编码的融合蛋白；

[0063] d)SEQ ID NO.6编码的融合蛋白。需要说明地是，SEQ ID NO.5为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2通过linker(GAA)连接得到的融合蛋白编码序列；SEQ ID NO.6为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4通过linker(GAA)连接得到的融合蛋白编码序列。上述连接方式在不影响F蛋白和HN蛋白构象和功能的前提下，可以有效避免过长linker的使用，降低分子生物学操作难度。

[0064] 上述蛋白可以应用于新城疫病毒的相关领域，例如制备疫苗或抗体，制备检测试剂盒，或者制备诊断抗原等等。

[0065] 本发明提供与上述蛋白相关的生物材料，包括核酸分子、表达盒、重组载体和真核细胞等。

[0066] “表达盒”包含多核苷酸序列，多核苷酸序列编码待表达的蛋白和控制其表达的序列如启动子以及任选地增强子序列，包括顺式作用转录性控制单元的任何组合。

[0067] 在一种实施方式中，核酸分子如A)‑E)任一种：

[0068] A)SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；

[0069] B)SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；

[0070] C)SEQ ID NO.5；

[0071] D)SEQ ID NO.6；

[0072] E)与A)‑D)任一项核酸分子具有75％以上同一性，且编码上述蛋白的核酸分子。

[0073] 重组载体包括pcDNA3.1、pEE6.4、pEE12.4或pGL4.13。真核细胞为CHO。采用CHO细胞表达体系，可以生产得到与天然蛋白分子相接近的蛋白分子，且可以稳定大量表达，这既提高了蛋白生产安全性，又简化了生产步骤，同时避免原核表达系统操作繁琐，生产蛋白与天然蛋白差异较大，需要复性等操作的问题。

[0074] 本发明还提供了一种新城疫病毒疫苗，该疫苗的活性成分为本发明上述提供的蛋白。该疫苗免疫效果好，成本低，广谱性强。

[0075] 在一些实施方式中，该疫苗还包括佐剂，例如所述佐剂例如可以为但不限于为氢氧化铝胶、矿物油、卡波姆、Gel01、Gel02、纳米佐剂、蜂胶、ISA206或ISA760VG等，所述新城疫疫苗优选使用矿物油佐剂，可以更有效地提高疫苗的抗原缓释作用和免疫原性。

[0076] 在一种实施方式中，以F蛋白选自SEQ ID NO.1，HN蛋白选自SEQ ID NO.2为例，蛋白的制备和疫苗的制备为如下方法：

[0077] 方案一，分别扩增得到SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2两段序列，利用酶切酶连反应将SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2两段序列分别与载体pcDNA3.1连接构建重组载体pcDNA3.1‑HC‑F和pcDNA3.1‑HC‑HN，将pcDNA3.1‑HC‑F和pcDNA3.1‑HC‑HN分别转染至CHO细胞中，利用G418多次加压筛选，经单克隆筛选分别得到CHO‑F细胞和CHO‑HN细胞，将细胞表达的F蛋白和HN蛋白分别纯化，按照质量比1：1配置，与佐剂混合乳化得到新城疫病毒疫苗。

[0078] 方案二，扩增得到SEQ ID NO.5目标片段，通过酶连反应将其与pcDNA3.1连接构建重组载体pcDNA3.1‑HC‑F‑HN，将重组载体转染至CHO细胞中，利用G418多次加压筛选，经单克隆筛选得到CHO‑F‑HN细胞，将细胞表达的F‑HN蛋白纯化，与佐剂混合乳化得到新城疫病毒疫苗。

[0079] 下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

[0080] 实施例1

[0081] Ⅶ型F蛋白SEQ ID NO.1，构建得到CHO‑F(Ⅶ)；Ⅱ型HN蛋白SEQ ID NO.2，构建得到CHO‑HN(Ⅱ)；两种蛋白混合制备疫苗，得到疫苗1。

[0082] 从Geenbank上下载当前流行、近5年流行的新城疫Ⅶ型F基因、Ⅱ型HN基因序列进行比对分析，根据CHO细胞密码子的偏嗜性，将新城疫Ⅶ型F基因、Ⅱ型HN基因序列分别进行密码子的优化和修饰，分别得到SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，两个基因均具有高度的广谱性，同时可以提高目的蛋白F、HN蛋白的表达水平。经设计酶切位点分别人工合成F、HN基因。

[0083] 将上述编码F、HN蛋白的核苷酸序列(C端具有His标签)，F通过NotI和EcoRI位点，HN通过KpnI和XhoI位点，分别插入克隆到真核转移载体pcDNA3.1上。利用T4 DNA连接酶在16℃过夜连接后获得连接产物，经大肠杆菌感受态DH5a转化后涂布于含有氨节青霉素的LB平板中，37℃培养过夜后挑取阳性菌落在含有氨节青霉素的LB培养基中培养，提取质粒，鉴定无误后备用。

[0084] 将上述两种质粒分别转染至生长良好全悬浮的CHO细胞，3日后进行细胞传代，并在培养基内加入800μg/ml的G418，加压至活率在30％左右时，停止加压。用常规的培养基培养，换入新的贴壁培养基培养7天，当细胞活率达到90％以上时，再加压筛选一次，同样细胞活率达到90％。

[0085] 阳性克隆挑选和检测：培养7天后的平板中，将贴壁生长的细胞挑至96孔板中，利用贴壁培养基培养7天后，加入100mL悬浮培养基MSX表达培养2天，空板中培养基用于点杂交检测，将其中高表达克隆转至24孔板，利用贴壁培养基培养2天后换为MSX培养，培养基用于蛋白质印迹法检测，根据实验结果最终得到高表达克隆株。所有细胞的培养条件为37℃，5％CO2。

[0086] 将经过筛选的CHO细胞在CHO培养基(含25μM MSX)或其它适宜培养基重悬细胞，细6 6
胞接种密度为0.3×10～0.5×10VC/ml，接种细胞于合适体积的细胞摇瓶，并置于37±1℃，含5％CO2摇床中进行摇瓶培养48～72小时，继续传代扩增培养细胞。

[0087] 根据需要进行逐级生物反应器培养发酵，一般进行5～8倍放大，放大到特定体积时进行抗原的表达，在37±1℃培养至第5日将温度降至32±1℃，pH调整至7.5±0.1，并以适宜转速进行培养，在第4日和第9日加入10％起始工作体积的Efficient Feed，每日检测葡萄糖浓度，当葡萄糖浓度低于2.5g/L时，补充葡萄糖到3～4g/L。当蛋细胞活率低于80％时，收获上清即为所需抗原。

[0088] 通过优化该细胞株的培养条件、补料时间，补料量最终获得了1.1～1.6mg/ml的F、HN蛋白表达。

[0089] 去细胞碎片将表达的定量后，与白油混合制备成疫苗，最终疫苗成品中(F、HN蛋白含量为50μg+50μg)/mL，免疫3‑4周龄SPF鸡，100μl/只，结果显示免疫21日后，免疫组、对照苗(市场销售基因Ⅱ型)，对基因Ⅶ型HI抗体(log2为底的对数)分别为9.02±0.9、4.44±0.4；对基因Ⅱ型HI抗体(log2为底的对数)分别为9.91±1.1、6.99±0.9。免疫21日后攻毒，攻毒后7日，免疫组在攻毒前和攻毒后抗体滴度显著高于对照苗，对照苗为基因Ⅱ型对基因Ⅶ型保护效果相对一般(见表1)。

[0090] 表1不同疫苗免疫后抗体滴度(HI)

[0091]

[0092]

[0093] 实施例2

[0094] Ⅱ型F蛋白SEQ ID NO.3，构建得到CHO‑F(Ⅱ)；Ⅶ型HN蛋白SEQ ID NO.4，构建得到CHO‑HN(Ⅶ)；得到两种蛋白混合制备疫苗，得到疫苗2。

[0095] 从Geenbank上下载当前流行、近5年流行的新城疫Ⅱ型F基因、Ⅶ型HN基因序列进行比对分析，根据CHO细胞密码子的偏嗜性，将新城疫Ⅱ型F基因、Ⅶ型HN基因序列进行密码子的优化和修饰，分别得到SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4，使该基因具有高度的广谱性，同时提高目的蛋白F、HN蛋白的表达水平。经设计酶切位点分别人工合成F、HN基因。

[0096] 将上述编码F、HN蛋白的核苷酸序列(C端具有His标签)，F通过XbaI和XhoI位点，HN通过KpnI和XhoI位点，插入克隆到真核转移载体pcDNA3.1上。利用T4 DNA连接酶在16℃过夜连接后获得连接产物，经大肠杆菌感受态DH5a转化后涂布于含有氨节青霉素的LB平板中，37℃培养过夜后挑取阳性菌落在含有氨节青霉素的LB培养基中培养，提取质粒，鉴定无误后备用。

[0097] 将上述两种质粒分别转染至生长良好全悬浮的CHO细胞，3日后进行细胞传代，并在培养基内加入800μg/ml的G418，加压至活率在30％左右时，停止加压。用常规的培养基培养，换入新的贴壁培养基培养7天，当细胞活率达到90％以上时，再加压筛选一次，同样细胞活率达到90％。

[0098] 阳性克隆挑选和检测:培养7天后的平板中，将贴壁生长的细胞挑至96孔板中，利用贴壁培养基培养7天后，加入100mL悬浮培养基MSX表达培养2天，空板中培养基用于点杂交检测，将其中高表达克隆转至24孔板，利用贴壁培养基培养2天后换为MSX培养，培养基用于蛋白质印迹法检测，根据实验结果最终得到高表达克隆株。所有细胞的培养条件为37℃，5％CO2。

[0099] 将经过筛选的CHO细胞在CHO培养基(含25μM MSX)或其它适宜培养基重悬细胞，细6 6
胞接种密度为0.3×10～0.5×10VC/ml，接种细胞于合适体积的细胞摇瓶，并置于37±1℃，含5％CO2摇床中进行摇瓶培养48～72小时，继续传代扩增培养细胞。

[0100] 根据需要进行逐级生物反应器培养发酵，一般进行5～8倍放大，放大到特定体积时进行抗原的表达，在37±1℃培养至第5日将温度降至32±1℃，pH调整至7.5±0.1，并以适宜转速进行培养，在第4日和第9日加入10％起始工作体积的Efficient Feed，每日检测葡萄糖浓度，当葡萄糖浓度低于2.5g/L时，补充葡萄糖到3～4g/L。当蛋细胞活率低于80％时，收获上清即为所需抗原。

[0101] 通过优化该细胞株的培养条件、补料时间，补料量最终获得了1.1～1.6mg/ml的F、HN蛋白表达。

[0102] 去细胞碎片将表达的定量后，与白油混合制备成疫苗，最终疫苗成品中(F、HN蛋白含量为50μg+50μg)/mL，免疫3‑4周龄SPF鸡，100μl/只，结果显示免疫21日后，免疫组、对照苗(市场销售基因Ⅱ型)，对基因Ⅱ型HI抗体(log2为底的对数)分别为9.42±0.8、6.99±0.4；对基因Ⅶ型HI抗体(log2为底的对数)分别为9.89±1.1、4.44±0.4。免疫21日后攻毒，攻毒后7日免疫组、对照苗、对照组，免疫组在攻毒前和攻毒后抗体滴度显著高于对照苗，对照苗为基因Ⅱ型对基因Ⅶ型保护效果相对一般(见表2)。

[0103] 表2不同疫苗免疫后抗体滴度(HI)

[0104]

[0105] 实施例3

[0106] Ⅱ型F蛋白和Ⅶ型HN蛋白，融合基因SEQ ID NO.6，构建得到CHO‑F(Ⅱ)‑HN(Ⅶ)；融合蛋白制备疫苗，得到疫苗3。

[0107] 从Geenbank上下载当前流行、近5年流行的新城疫Ⅱ型F基因、Ⅶ型HN基因序列进行比对分析，根据CHO细胞密码子的偏嗜性，将新城疫Ⅱ型F基因、Ⅶ型HN基因序列进行密码子的优化和修饰，使该基因具有高度的广谱性，用新城疫病毒天然通过linker(GAA)将F和HN融合表达蛋白。经设计酶切位点分工合成F+HN基因。

[0108] 将上述编码F+HN蛋白的核苷酸序列(C端具有His标签)，F+HN通过HindIII和SmaI插入克隆到真核转移载体pcDNA3.1上。利用T4 DNA连接酶在16℃过夜连接后获得连接产物，经大肠杆菌感受态DH5a转化后涂布于含有氨节青霉素的LB平板中，37℃培养过夜后挑取阳性菌落在含有氨节青霉素的LB培养基中培养，提取质粒，鉴定无误后备用。

[0109] 将该质粒转染至生长良好全悬浮的CHO细胞，3日后进行细胞传代，并在培养基内加入800μg/ml的G418，加压至活率在30％左右时，停止加压。用常规的培养基培养，换入新的贴壁培养基培养7天，当细胞活率达到90％以上时，再加压筛选一次，同样细胞活率达到90％。

[0110] 阳性克隆挑选和检测:培养7天后的平板中，将贴壁生长的细胞挑至96孔板中，利用贴壁培养基培养7天后，加入100mL悬浮培养基MSX表达培养2天，空板中培养基用于点杂交检测，将其中高表达克隆转至24孔板，利用贴壁培养基培养2天后换为MSX培养，培养基用于蛋白质印迹法检测，根据实验结果最终得到高表达克隆株。所有细胞的培养条件为37℃，5％CO2。

[0111] 将经过筛选的CHO细胞在CHO培养基(含25μM MSX)或其它适宜培养基重悬细胞，细6 6
胞接种密度为0.3×10～0.5×10VC/ml，接种细胞于合适体积的细胞摇瓶，并置于37±1℃，含5％CO2摇床中进行摇瓶培养48～72小时，继续传代扩增培养细胞。

[0112] 根据需要进行逐级生物反应器培养发酵，一般进行5～8倍放大，放大到特定体积时进行抗原的表达，在37±1℃培养至第5日将温度降至32±1℃，pH调整至7.5±0.1，并以适宜转速进行培养，在第4日和第9日加入10％起始工作体积的Efficient Feed，每日检测葡萄糖浓度，当葡萄糖浓度低于2.5g/L时，补充葡萄糖到3～4g/L。当蛋细胞活率低于80％时，收获上清即为所需抗原。

[0113] 通过优化该细胞株的培养条件、补料时间，补料量最终获得了1.2～1.4mg/ml的F+HN融合蛋白表达。

[0114] 去细胞碎片将表达的定量后，与白油混合制备成疫苗，最终疫苗成品中(F+HN融合蛋白含量为100μg)/mL，免疫3‑4周龄SPF鸡，100μl/只，结果显示免疫21日后，免疫组、对照苗(市场销售基因Ⅱ型)，对基因Ⅱ型HI抗体(log2为底的对数)分别为9.92±0.9、6.99±0.9；对基因Ⅶ型HI抗体(log2为底的对数)分别为9.84±1.3、4.44±0.4。免疫21日后攻毒，攻毒后7日免疫组、对照苗、对照组，免疫组在攻毒前和攻毒后抗体滴度显著高于对照苗，对照苗为基因Ⅱ型对基因Ⅶ型保护效果相对一般(见表3)。

[0115] 表3不同疫苗免疫后抗体滴度(HI)

[0116]

[0117] 实施例4

[0118] Ⅱ型HN蛋白和Ⅶ型F蛋白，融合基因SEQ ID NO.5，构建得到CHO‑HN(Ⅱ)‑F(Ⅶ)，融合蛋白制备疫苗，得到疫苗4。

[0119] 从Geenbank上下载当前流行、近5年流行的新城疫Ⅱ型HN基因、Ⅶ型F基因序列进行比对分析，根据CHO细胞密码子的偏嗜性，将新城疫Ⅱ型HN基因、Ⅶ型F基因序列进行密码子的优化和修饰，使该基因具有高度的广谱性，用新城疫病毒天然通过linker(GAA)将F和HN融合表达蛋白。经设计酶切位点分工合成F+HN基因。

[0120] 将上述编码F+HN蛋白的核苷酸序列(C端具有His标签)，HN+F通过HindIII和SmaI插入克隆到真核转移载体pcDNA3.1上。利用T4 DNA连接酶在16℃过夜连接后获得连接产物，经大肠杆菌感受态DH5a转化后涂布于含有氨节青霉素的LB平板中，37℃培养过夜后挑取阳性菌落在含有氨节青霉素的LB培养基中培养，提取质粒，鉴定无误后备用。

[0121] 将该质粒转染至生长良好全悬浮的CHO细胞，3日后进行细胞传代，并在培养基内加入800μg/ml的G418，加压至活率在30％左右时，停止加压。用常规的培养基培养，换入新的贴壁培养基培养7天，当细胞活率达到90％以上时，再加压筛选一次，同样细胞活率达到90％。

[0122] 阳性克隆挑选和检测:培养7天后的平板中，将贴壁生长的细胞挑至96孔板中，利用贴壁培养基培养7天后，加入100mL悬浮培养基MSX表达培养2天，空板中培养基用于点杂交检测，将其中高表达克隆转至24孔板，利用贴壁培养基培养2天后换为MSX培养，培养基用于蛋白质印迹法检测，根据实验结果最终得到高表达克隆株。所有细胞的培养条件为37℃，5％CO2。

[0123] 将经过筛选的CHO细胞在CHO培养基(含25μM MSX)或其它适宜培养基重悬细胞，细6 6
胞接种密度为0.3×10～0.5×10VC/ml，接种细胞于合适体积的细胞摇瓶，并置于37±1℃，含5％CO2摇床中进行摇瓶培养48～72小时，继续传代扩增培养细胞。

[0124] 根据需要进行逐级生物反应器培养发酵，一般进行5～8倍放大，放大到特定体积时进行抗原的表达，在37±1℃培养至第5日将温度降至32±1℃，pH调整至7.5±0.1，并以适宜转速进行培养，在第4日和第9日加入10％起始工作体积的Efficient Feed，每日检测葡萄糖浓度，当葡萄糖浓度低于2.5g/L时，补充葡萄糖到3～4g/L。当蛋细胞活率低于80％时，收获上清即为所需抗原。

[0125] 通过优化该细胞株的培养条件、补料时间，补料量最终获得了1.2～1.4mg/ml的F+HN融合蛋白表达。

[0126] 去细胞碎片将表达的定量后，与白油混合制备成疫苗，最终疫苗成品中(HN+F融合蛋白含量为100μg)/mL，免疫3‑4周龄SPF鸡，100μl/只，结果显示免疫21日后，免疫组、对照苗(市场销售基因Ⅱ型)，对基因Ⅱ型HI抗体(log2为底的对数)分别为，9.12±0.4、6.99±0.9；对基因Ⅶ型HI抗体(log2为底的对数)分别为9.36±1.0、7.26±0.8。免疫21日后攻毒，攻毒后7日免疫组、对照苗、对照组，免疫组在攻毒前和攻毒后抗体滴度显著高于对照苗，对照苗为基因Ⅱ型对基因Ⅶ型保护效果相对一般(见表4)。

[0127] 表4不同疫苗免疫后抗体滴度(HI)

[0128]

[0129] 实施例5

[0130] 对疫苗1、疫苗2、疫苗3、疫苗4、对照苗、对照组的抗体水平比较比较分析显示，本发明构建的4种疫苗均为细胞表达的蛋白，经超滤浓缩后抗原纯度在70％以上，免疫动物后具有良好的安全性；从免疫效力的角度看，本发明构建的4种疫苗对新城疫基因Ⅱ型、基因Ⅶ型均具有良好的保护，且与现有市场销售的相比效力差异极显著。现有销售疫苗对基因Ⅶ型保护效力有限(见表5)。

[0131] 表5不同疫苗的效力HI抗体水平比较

[0132]

[0133] 实施例6

[0134] 除了疫苗1、疫苗2、疫苗3、疫苗4在疫苗的安全性和免疫效力具有显著优势外，在不考虑常规生产方法中鸡胚处理费用，其成本也具有很大的优势，本发明与鸡胚或BHK‑21细胞生产方法节省成本近50％(见表6)。

[0135] 表6本发明和常规生产方法成本对比

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[0138] 尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。