一种产生广谱交叉中和活性的重组新型冠状病毒RBD三聚体蛋白疫苗、其制备方法和应用转让专利
申请号 : CN202110676901.2
文献号 : CN113292640B
文献日 : 2021-12-24
发明人 : 李启明 , 梁宇 , 张靖 , 苏计国 , 韩子泊 , 邵帅 , 侯亚楠 , 张浩 , 陈实 , 靳玉琴 , 张学峰 , 杜丽芳 , 侯俊伟 , 马智静 , 雷泽华 , 郑凡 , 唐芳 , 刘兆明 , 刘宁
申请人 : 国药中生生物技术研究院有限公司
摘要 :
权利要求 :
1.一种产生广谱交叉中和活性的重组新型冠状病毒RBD三聚体蛋白,其特征在于,所述三聚体蛋白是由三个新型冠状病毒RBD区域的亚基组成,所述三聚体蛋白的氨基酸序列为如SEQ ID No.4所示的氨基酸序列。
2.一种融合蛋白,其特征在于,所述融合蛋白的氨基酸序列包含如权利要求1所述的重组新型冠状病毒RBD三聚体蛋白的氨基酸序列。
3.根据权利要求2所述的融合蛋白,其特征在于,所述融合蛋白还包含选自信号肽、标签或免疫增强肽中的一种或几种。
4.一种核酸分子,其特征在于,所述核酸分子包含编码如权利要求1所述的重组新型冠状病毒RBD三聚体蛋白,或编码如权利要求2或3所述的融合蛋白的核苷酸序列。
5.根据权利要求4所述的核酸分子,其特征在于,所述核酸分子的核苷酸序列为如SEQ ID No.9所示的核苷酸序列。
6.一种载体,其特征在于,所述载体包含如权利要求4所述的核酸分子。
7.一种宿主细胞,其特征在于,所述宿主细胞包含如权利要求4所述的核酸分子或如权利要求6所述的载体。
8.根据权利要求7所述的宿主细胞,其特征在于,所述宿主细胞为大肠杆菌、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。
9.根据权利要求8所述的宿主细胞,其特征在于,所述宿主细胞为CHO细胞。
10.如权利要求1所述的重组新型冠状病毒RBD三聚体蛋白或如权利要求2或3所述的融合蛋白的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:步骤A)制备如权利要求4所述的核酸分子,构建该核酸分子的表达载体,将表达载体转化或转染至宿主细胞内;
步骤B)利用步骤A)的产物进行蛋白质表达;
步骤C)纯化步骤B)中获得的表达产物,得到所述重组新型冠状病毒RBD三聚体蛋白或融合蛋白。
11.如权利要求1所述的重组新型冠状病毒RBD三聚体蛋白、如权利要求2或3所述的融合蛋白、如权利要求4所述的核酸分子、如权利要求6所述的载体或如权利要求7所述的宿主细胞在制备用于治疗和/或预防新型冠状病毒感染和/或新型冠状病毒引起的疾病的药物中的用途。
12.一种重组蛋白疫苗,其特征在于,所述疫苗包含如权利要求1所述的重组新型冠状病毒RBD三聚体蛋白或如权利要求2或3所述的融合蛋白,以及佐剂。
13.根据权利要求12所述的重组蛋白疫苗,其特征在于,所述佐剂为氢氧化铝、磷酸铝、MF59或CpG。
14.根据权利要求13所述的重组蛋白疫苗,其特征在于,所述佐剂为氢氧化铝。
15.如权利要求12、13或14所述的重组蛋白疫苗的制备方法,其特征在于,将纯化所得的所述重组新型冠状病毒RBD三聚体蛋白或所述融合蛋白与所述佐剂混合。
16.一种基因工程载体疫苗,其特征在于,所述基因工程载体疫苗包含如权利要求4所述的核酸分子。
17.一种核酸疫苗,其特征在于,所述核酸疫苗包含如权利要求4所述的核酸分子。
18.一种药物组合物,其特征在于,所述药物组合物包含如权利要求12、16或17所述的疫苗,以及药学上可接受的载体。
说明书 :
一种产生广谱交叉中和活性的重组新型冠状病毒RBD三聚体
蛋白疫苗、其制备方法和应用
技术领域
背景技术
种、单股正链RNA病毒,有包膜,基因组全长约为29.9kb,绝大部分编码非结构蛋白,参与病
毒复制和翻译等功能,少部分序列编码结构蛋白,如:S蛋白(spike protein,)、M蛋白
(membrane protein)、E蛋白(envelope protein)和N蛋白(nucleo protein)。此外,还有若
干附属蛋白:3a,3b,p6,7a,7b,8b,9b和orf14,这些蛋白均参与病毒组装。S、M和E蛋白构成
病毒囊膜,是病毒引起免疫反应的主要表面抗原。其中S蛋白是一种跨膜糖蛋白,分子量约
为150kDa,在病毒表面形成突出的同源三聚体。S由两个功能亚基组成,在S1和S2亚基之间
的边界处(S1/S2裂解点)被切割,这两个亚基在融合前构象中保持非共价结合。S2亚基也由
多个结构域构成,它的功能主要是介导病毒与宿主细胞的融合。远端S1亚基在结构上分为
四个不同的结构域:N端结构域(NTD)、受体结合结构域(RBD)、C端结构域1(CTD1)和C端结构
域2(CTD2),其中RBD主要负责与宿主细胞表面的受体血管紧张素转换酶2(angiotensin
converting enzyme 2,ACE2)结合,从而介导病毒侵染宿主细胞,因此S蛋白及RBD均为目前
基因工程疫苗研发的主要靶标。
和武汉公司)和北京科兴的3款新冠灭活疫苗、康希诺生物腺病毒载体疫苗以及智飞生物重
组蛋白疫苗,以及俄罗斯批准上市的“卫星V”,另外还有数十种疫苗处于临床研究不同阶
段。这些已上市的疫苗无论是来自哪种技术路线,都对疫情防控做出了不同程度的贡献,然
而由于新冠病毒的进化,不断出现各种突变,使现有疫苗的保护效果受到不同程度的影响。
Epsilon(B.1.429)突变株、Delta(B.1.617.2),Kappa(B.1.617.1)突变株。这些突变株的突
变位点主要存在于S蛋白的氨基酸序列,尤其是RBD区。因此,突变可能会提高病毒与ACE2受
体的亲和力、减弱中和抗体效应,从而增强病毒毒力和传染力,加速病毒逃逸,降低疫苗保
护效果。因此,开发一种针对多种新冠病毒流行株的广谱性疫苗已成为当务之急。
发明内容
RBD三聚体蛋白疫苗。
列相同或至少一个不同;
分情况下,形成抗原构象稳定的三聚体形式,实现RBD蛋白三聚化。利用基因工程技术重组
表达并纯化RBD三聚体蛋白后,与佐剂混合制备成疫苗。按一定剂量和剂次免疫后,可产生
针对多种新型冠状病毒流行株的保护性中和抗体,用于治疗和/或预防SARS‑CoV‑2感染和/
或新型冠状病毒疾病(COVID‑19)。由于RBD区功能明确,结构清楚,负责识别宿主细胞的
ACE2受体,同时针对RBD产生的抗体功能明确,靶点特异,最大程度避免诱导机体产生抗体
依赖的增强作用(Antibody Dependent Enhancement,ADE)。
的肽链长度至少为该RBD区域序列全长的50%~99%。
Kappa(B.1.617)新冠病毒、携带有D614G突变的新冠病毒、携带有L452R突变的新冠病毒、携
带有N501Y、P681H、69‑70del等多个突变的Alpha(B.1.1.7)新冠病毒、携带有N501Y、K417N、
E484K等突变的Beta(B.1.135)新冠病毒、携带有N501Y、E484K和K417T突变的Gamma(P.1)新
冠病毒等。上述序列可以通过NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中的数据库获得。
的序列。
的蛋白质具有与SEQ ID No.1、SEQ ID No.2或SEQ ID No.3中的氨基酸序列组成的蛋白质
相同或基本相同的免疫学活性,该新的氨基酸序列也视为包含在本发明的保护范围之内。
列。本领域技术人员可以对本说明书中所述融合蛋白的氨基酸序列以合适的方式进行随机
或者工程化的点突变,其目的可以为,例如,获得更好的亲和力和/或解离性质,表达性能的
提高,等,这些序列可以与所述重组新型冠状病毒RBD三聚体蛋白或所述融合蛋白具有相同
或基本相同的免疫学活性,而这些突变后的氨基酸序列均包含在本发明的保护范围之内。
No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3顺序连接形成的蛋白,氨基酸序列如SEQ ID No.4所示;由
上述SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.1顺序连接形成的蛋白,氨基酸序列如SEQ ID
No.5所示;由上述SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.2顺序连接形成的蛋白,氨基酸序
列如SEQ ID No.6所示;由上述SEQ ID No.2、SEQ ID No.1、SEQ ID No.2顺序连接形成的蛋
白,氨基酸序列如SEQ ID No.7所示;由上述SEQ ID No.2、SEQ ID No.2、SEQ ID No.2顺序
连接形成的蛋白,氨基酸序列如SEQ ID No.8所示,或其他任意的组合。
为,例如,Flag标签、增强型绿色荧光蛋白(eGFP)、谷胱甘肽巯基转移酶(GST),等等,其作用
可以是用于检测、纯化、分离等等。上述功能性序列可任意组合使用。
列。
主细胞中的表达。上述碱基序列的信息可通过检索已知文献或NCBI(https://
www.ncbi.nlm.nih.gov/)等数据库来获得。
等调控序列,以及耐药基因、报告基因等标记序列。
细胞株。
表达RBD三聚体蛋白或融合蛋白的细胞株。
一个实施方式中,采用离子交换和疏水层析的方法纯化上述RBD三聚体蛋白或融合蛋白。
胞进行破碎的过程,可以使用例如,超声波破碎、反复冻融破碎、化学处理法等任意合适的
破碎方法。上述对宿主细胞的收集过程也应理解为包含在所述纯化的范围之内。
染和/或新型冠状病毒引起的疾病的药物中的用途。
以为核酸疫苗,上述疫苗包含本说明书中所述核苷酸序列或编码本说明书中所述的氨基酸
序列。
等渗剂等。
物组合物。
毒(SARS‑CoV‑2)感染和/或新型冠状病毒疾病。
附图说明
CTD1和CTD2结构域;B为RBD与ACE2受体复合物结构(基于PDB代码为6m0j的坐标文件,采用
UCSF Chimera软件绘制);
130、100、70、55、35、25、15、10);
(分子量标准为:kDa:250、130、100、70、55、35、25、15、10);
子量标准为:kDa:250、130、100、70、55、35、25、15、10);
marker(分子量标准为:kDa:250、130、100、70、55、35、25、15、10);
具体实施方式
特别指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视
为包括在本发明,并且相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围的基础上对本文
所述内容进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。
“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分,而并
未排除其它元件或其它组成部分。除非另有其它明确表示,否则在整个说明书和权利要求
书中,术语“RBD”即代表新型冠状病毒的刺突蛋白的RBD结构域,其与“RBD”或“新型冠状病
毒RBD区域”可以理解为能够相互替换使用。
种、单股正链RNA病毒,有包膜,基因组全长约为29.9kb,绝大部分编码非结构蛋白,参与病
毒复制和翻译等功能,少部分序列编码结构蛋白,如:S蛋白(spike protein)、M蛋白
(membrane protein)、E蛋白(envelope protein)和N蛋白(nucleo protein),此外还有若
干附属蛋白:3a,3b,p6,7a,7b,8b,9b和orf14,这些蛋白均参与病毒组装。S、M和E蛋白构成
病毒囊膜,是病毒引起免疫反应的主要表面抗原。其中S蛋白是一种跨膜糖蛋白,分子量约
为150kDa,在病毒表面形成突出的同源三聚体。S由两个功能亚基组成,在S1和S2亚基之间
的边界处(S1/S2裂解点)被切割,这两个亚基在融合前构象中保持非共价结合。S2亚基也由
多个结构域构成,它的功能主要是介导病毒与宿主细胞的融合。远端S1亚基在结构上分为
四个不同的结构域:N端结构域(NTD)、受体结合结构域(RBD)、C端结构域1(CTD1)和C端结构
域2(CTD2),其中RBD主要负责与宿主细胞表面的受体血管紧张素转换酶2(angiotensin
converting enzyme 2,ACE2)结合,从而介导病毒侵染宿主细胞,因此S蛋白及RBD均为目前
基因工程疫苗研发的主要靶标。
基因融合和蛋白表达方法,利用融合蛋白技术,可构建和表达具有多种功能的新型目的蛋
白。
导入宿主细胞,使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员
公知的,包括但不限于:质粒;噬菌粒;柯斯质粒;人工染色体,例如酵母人工染色体(YAC)、
细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC);噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物
病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于,逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相
关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒
(如SV40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件,包括但不限于,启动子序列、转录起始
序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外,载体还可含有复制起始位点。
少疾病症状、体征或病因的能力。治疗还指缓和或减少至少一种临床症状和/或抑制或延迟
病症的进展和/或预防或延迟疾病或疾患的发作。
(B.1.617.1)突变株发生了2个位点的氨基酸突变,即L452R和E484Q。其中,E484K被认为是
导致免疫逃逸的最主要的位点突变,通过分子动力学模拟和自由能计算发现,E484K突变会
导致RBD与多个中和性单抗的亲和力显著降低,WHO列出的归类为VOC和VOI的10种突变株
中,有6种突变株均含有E484K突变。另外,L452R突变也已经被证实能够对中和抗体以及新
冠病人恢复者血清产生逃逸,10种VOC和VOI突变株中,有3株含有L452R突变。有实验证据显
示,K417N和N501Y突变能够对一部分中和抗体产生抵抗,在10种VOC和VOI突变株中,有4株
含有N501Y突变。此外,通过对目前已知的120万条SARS‑CoV‑2序列进行了进化分析,发现
E484K、L452R和N501Y是RBD中最主要的趋同进化突变,这些突变在众多不同的病毒谱系独
立出现,表明这些突变在病毒进化中具有明显的选择优势,也预示着这些突变可能会在将
来的突变株中再次独立或组合出现。因此研发一种具有跨流行株广谱保护能力的新冠疫苗
具有重要意义。
三聚化,同时不会存在较大的空间位障。基于此,截取不同突变株的新型冠状病毒S蛋白RBD
区序列片段(319~537位氨基酸),将三个RBD区片段首尾串联,形成一个新的融合蛋白。针
对新型冠状病毒原型株S蛋白RBD区序列片段(319~537位氨基酸)序列如SEQ ID No.1所
示,针对Beta(B.1.351)突变株的S蛋白RBD区序列片段(319~537位氨基酸)序列如SEQ ID
No.2所示,针对Kappa(B.1.617.1)突变株的S蛋白RBD区序列片段(319~537位氨基酸)序列
如SEQ ID No.3所示。
下:由SEQ ID No.1,SEQ ID No.2,SEQ ID No.3顺序连接形成的三聚体蛋白A,氨基酸序列
如SEQ ID No.4所示;由SEQ ID No.1,SEQ ID No.2,SEQ ID No.1顺序连接形成的三聚体蛋
白B,氨基酸序列如SEQ ID No.5所示;由SEQ ID No.1,SEQ ID No.2,SEQ ID No.2顺序连接
形成的三聚体蛋白C,氨基酸序列如SEQ ID No.6所示;由SEQ ID No.2,SEQ ID No.1,SEQ
ID No.2顺序连接形成的三聚体蛋白D,氨基酸序列如SEQ ID No.7所示;由SEQ ID No.2,
SEQ ID No.2,SEQ ID No.2顺序连接形成的三聚体蛋白E,氨基酸序列如SEQ ID No.8所示。
构象稳定的三聚体形式,且该蛋白涵盖了关键的活跃突变位点和潜在的免疫逃逸位点,理
论上推测对以此作为靶抗原的重组疫苗具备跨流行株的广谱保护能力,另外,与传统的制
备多个单价疫苗,通过多价组合来实现广谱保护的策略相比,在一种抗原分子上实现了多
价广谱保护效果,在疫苗制备的时间成本、经济成本以及疫苗产能方面具有明显的优势。
NO.4)优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示,蛋白B(氨基酸序列为SEQ ID NO.5)优化后
的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示,蛋白C(氨基酸序列为SEQ ID NO.6)优化后的核苷酸序
列如SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13或SEQ ID NO.14所示,蛋白D(氨基酸序列
为SEQ ID NO.7)优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示,蛋白E(氨基酸序列为SEQ ID
NO.8)优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.16或SEQ ID NO.17所示。
均成功得到表达,经系列层析纯化后蛋白A、蛋白B和蛋白C均获得纯度≥95%的三聚体蛋
白,蛋白D和蛋白E表达量过低经纯化后未获得纯度较高的目的蛋白。蛋白A、蛋白B和蛋白C
的SDS‑PAGE检测结果如图3所示,蛋白分子量大小在70~100kD,同时可见有部分产品相关
物质,如二聚体蛋白和单体蛋白等。
Western‑blot鉴定(结果如图4所示),所有蛋白可与RBD特异性抗体发生结合,具有良好的
生物学活性。采用TSKgel G2500PW凝胶色谱柱对纯化后的蛋白A、蛋白B和蛋白C进行分子排
阻色谱分析,所有纯化后蛋白纯度均大于90%。
细胞重组表达、层析纯化所得)和二聚体蛋白(由2个如SEQ ID No.1所示的氨基酸片段顺序
连接形成如SEQ ID No.19所示氨基酸序列的蛋白,经293FT细胞或CHO细胞重组表达、层析
纯化所得)、RBD蛋白(厂家:北京义翘神州科技有限公司;货号:40592‑V08B)、与Beta
(B.1.351)株病毒突变位点一致的RBD蛋白(K417N、E484K、N501Y;厂家:北京义翘神州科技
有限公司;货号:40592‑V08H85),与Kappa(B.1.617.1)株病毒突变位点一致的RBD蛋白
(L452R、E484Q;厂家:北京义翘神州科技有限公司;货号:40592‑V08H85),利用包被液稀释
至4μg/ml、2μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml、0.25μg/ml、0.125μg/ml、0.0625μg/ml、0.03125μg/
ml、0.015625μg/ml、0.007813μg/ml、0.003906μg/ml、0.001953μg/ml,100μl/孔,包被至96
孔酶标板上,4℃,8~12h,以空白孔为阴性对照;PBST溶液洗板后加入封闭液,37℃封闭3h;
PBST溶液洗板后分别加入稀释后的MM43单克隆抗体(厂家:北京义翘神州科技有限公司;货
号:40591‑MM43,稀释度:2000倍),或MM57单克隆抗体(厂家:北京义翘神州科技有限公司;
货号:40592‑MM57;稀释度:2000倍),或R001单克隆抗体(厂家:北京义翘神州科技有限公
司;货号:40592‑R001;稀释度:2000倍),或R117单克隆抗体(厂家:北京义翘神州科技有限
公司;货号:40592‑R117;稀释度:2000倍),100μl/孔,37℃孵育1h;PBST溶液洗板后加入稀
释后的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠或羊抗兔IgG抗体,100μl/孔,37℃孵育1h;PBST溶液
洗板后先后加入显色液A和B,室温下显色5~10min,加入终止液C;酶标仪上进行双波长
(OD450nm和630nm)读值,确定cutoff值,并绘制蛋白浓度‑吸光度值曲线。
图8所示,结果可见三聚体蛋白A与所有中和性单克隆抗体均呈不同程度的结合,其中与
MM43抗体结合活性与三聚体蛋白基本一致,与MM57和R117单克隆抗体结合活性低于三聚体
蛋白,说明三聚体蛋白既具有原型株RBD蛋白性质,又具有Beta(B.1.351)株RBD蛋白特性。
integrated trimeric form of RBD,mutI tri‑RBD),进一步对纯化后的三聚体蛋白A进一
步分析,利用SDS‑PAGE检测和Western‑blot分析,同时以三聚体蛋白为对照,结果如图9和
图10所示,可见三聚体蛋白A与三聚体蛋白分子量大小基本一致,在70~100kD之间,利用
MALDI‑TOF MS方法检测蛋白完整分子量,三聚体蛋白A分子量约为87.836kD,较理论值
(74kD)偏大,这与蛋白糖基化修饰相关,利用UPLC‑MS方法检测蛋白糖基化修饰,结果显示
重组表达的三聚体蛋白A具有较多位点的糖基化修饰。利用圆二色谱对三聚体蛋白A进行二
级结构检测,结果显示α螺旋占比为13.5%,β折叠占比为23.3%,β转角占比为11.4%,其他
为51.8%,这与理论值基本保持一致。利用UPLC‑MS方法检测二硫键形成情况,结果也显示
三聚体蛋白A中的每一个RBD单体都可形成4对二硫键,与RBD天然结构中二硫键配对结果一
致。利用量热差示扫描方法检测三聚体蛋白A的热稳定性,结果如图11所示,Tm值为47.2℃,
三聚体蛋白A具有良好的热稳定性。利用透射电镜观察蛋白形态,结果如图12所示,可见三
聚体蛋白A粒径较小,约为3‑5nm左右,但未观察到更为清晰的形态结构图像。另外,利用表
面等离子共振技术检测三聚体蛋白A与hACE受体蛋白的亲和力,结果如图13所示,经过计算
‑3
KD值为3.19×10 nM,两者具有高亲和力,证明三聚体蛋白A具有良好的生物学活性。
品,上清残留蛋白含量应低于总蛋白含量的10%,半成品每瓶按0.5ml装量无菌分装后即为
疫苗成品。
3w免疫2针,5w采血分离血清。利用假病毒微量中和试验检测免后小鼠血清针对多种假病毒
(如表2所示)的中和活性,结果如图14所示,血清抗体GMT值如表3所示,可见三聚体蛋白A可
产生针对多种假病毒的中和活性,对目前引起免疫逃逸突变株以及将来可能出现的突变株
具有一定的保护潜力,预期可产生广谱保护能力。
4
10TCID50/ml,使用Reed‑Muench法计算50%感染抑制率时血清稀释倍数,即为该血清样品
的中和抗体滴度。
视为本发明的保护范围。