一种基于多结合位点适配体的凝血酶电化学传感器

摘要

本发明公开了一种基于多结合位点适配体的凝血酶电化学传感器。传感器的适配体DNA序列为：5'‑SH‑(CH2)6‑TTTTTTTTTTGGTTGGTGTGGTTGGTTTTTAGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT‑‑MB‑3'，且DNA识别链的末端标记有电化学活性物质。本发明的一种基于多结合位点适配体的凝血酶电化学传感器的适配体DNA引入了双识别的策略，双识别位点的适配体能更快速有效地特异性识别全血中的凝血酶，凝血酶的不同部位达到高的特异性，并且在DNA链的末端标记有电化学活性物质(亚甲基蓝)，从而将化学信号转化成电信号，实现对凝血酶的高灵敏、高选择性检测。

权利要求

1.一种基于多结合位点适配体的凝血酶电化学传感器，其特征在于：所述凝血酶电化学传感器为三电极体系，包括参比电极、对电极和工作电极，所述参比电极为Ag/AgCl，所述对电极为铂丝，所述工作电极为修饰有适配体的金电极，所述适配体的DNA序列为：

5'‑SH‑(CH2)6‑TTTTTTTTTTGGTTGGTGTGGTTGGTTTTTAGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT‑MB‑3'，所述工作电极的制备方法包括如下步骤：S1：将适配体DNA溶液与TCEP溶液反应还原二硫键，并用PBS缓冲溶液将其稀释得复合物溶液；S2：在打磨清洗后的金电极表面滴加上述复合物溶液，在室温下反应，S3：将步骤S2反应后得到的金电极浸泡到MCH溶液中，在金电极表面自组装单分子层，占据非特异性吸附的位点，进行表面的封闭，清洗金电极后用氮气吹干，得工作电极；其中，步骤S1中适配体DNA溶液与TCEP溶液的摩尔比为0.01:2。

2.如权利要求1所述的一种基于多结合位点适配体的凝血酶电化学传感器，其特征在于：金电极的打磨清洗过程具体如下：经过Al2O3粉末打磨后，分别在浓度为0.5 M的氢氧化钠溶液和0.5 M的硫酸的溶液中清洗干净。

说明书

一种基于多结合位点适配体的凝血酶电化学传感器

技术领域

[0001] 本发明涉及电化学传感器技术领域，尤其涉及一种基于多结合位点适配体的凝血酶电化学传感器。

背景技术

[0002] 凝血酶是一种多功能丝氨酸蛋白酶，是血管稳态的重要调节分子。凝血酶不仅能够调控凝血过程及伤口愈合，还是阿尔茨海默病、白血病以及血栓栓塞性疾病等病理过程的必需酶，在伤口愈合、血管止血、炎症、组织黏合、动脉硬化等过程中也发挥了重要作用。此外，凝血酶对肿瘤细胞的生长具有调节作用，浓度较低时促进生长，浓度较高时抑制其生长，甚至产生凋亡效应，在激活正常细胞的致瘤性和恶性细胞转移方面也扮演着重要角色。
凝血酶含量是衡量机体凝血功能异常一种指标。因此，建立灵敏、快速的凝血酶检测方法具有重要意义。

[0003] 适配体(aptamer)是通过指数富集的配体系统进化技术(Systematic evolution ofligands by exponential enrichment，SELEX)，经体外筛选得到的结构化的寡核苷酸序列(RNA或DNA)，与相应的靶标分子(蛋白质，病毒，细菌，细胞，重金属离子等)有严格的识别能力和高度的亲和力。近年来，基于适配体与传感器建立了一系列凝血酶检测方法，包括利用离子体共振原理的三明治结构传感器检测法、电化学发光生物测定法、比色法、荧光法、双重猝灭法等。这些方法具有一定的灵敏度，但存在传感器稳定性差、操作复杂、触发条件不可控等问题。因此，建立一种新的高灵敏、快速的凝血酶检测方法具有重要意义。

[0004] 目前，凝血酶的适配体主要有2种(Apt15，Apt29)。一种含有15个特异性碱基(TBA15：GGTTGGTGTGGTTGG)的序列(图1a)，它与凝血酶的纤维蛋白原识别位点特异性结合，结合作用弱(Kd≈100nmol/L)，但抗凝作用强；另一种是含有29个特异性碱基(TBA29：AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT)的序列(图1b)，它与凝血酶的肝素识别位点相互作用,结合作用强(Kd≈0.5nmol/L)，但抗凝作用弱。虽然，Apt15与凝血酶的亲和力小于Apt29，但Apt15选择性更强。

[0005] 电化学适配体传感器(Electrochemical aptamer‑based,E‑AB)能在未经处理的复杂样本体系中实现对特定活性分子的高精度测试，能更好地实时监测在活体内的药物。适配体主要依靠氢键，范德华力，疏水作用等分子间作用力形成独特的三维空间结构(如发夹结构，G四联体等结构)，这些高度结构化的核酸适配体能够紧密地结合靶标分子，从而可以实现高选择性地识别目标分子。MB氧化还原活性分子作为非常经典的信号分子，在生物传感器中的应用也十分广泛。基于适配体的电化学传感器(图2)检测原理是：测试时，氧化还原信号分子(这里为亚甲基蓝，MB)发生氧化还原反应，从而产生感应电流，当适配体与靶标物质结合时，适配体的构象发生改变，使得MB与电极表面的距离也随之变化，从而影响电子转移速率，使电流信号发生变化，最终，可通过电流的变化判断出靶标物质的浓度等信息。

[0006] 所以构建了一种能与凝血酶分子进行高亲和力、高特异性地结合的DNA探针，应用于这一传感器平台，具有高选择性，高灵敏度并且快速地检测全血中的凝血酶，在疾病的早期诊断中具有潜在的应用价值。

发明内容

[0007] 本发明的目的在于，针对现有技术的上述不足，提出一种高灵敏的、快速的实现凝血酶检测的基于多结合位点适配体的凝血酶电化学传感器。

[0008] 本发明的一种基于多结合位点适配体的凝血酶电化学传感器，适配体DNA序列为：

[0009] 5'‑SH‑(CH2)6‑TTTTTTTTTTGGTTGGTGTGGTTGGTTTTTAGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT‑‑MB‑3'，且DNA识别链的末端标记有电化学活性物质。

[0010] 进一步的，所述电化学活性物质包括亚甲基蓝。

[0011] 进一步的，电化学传感器的工作电极的制备方法包括如下步骤：S1：将适配体DNA溶液与TCEP溶液反应还原二硫键，并用PBS缓冲溶液将其稀释得复合物溶液；S2：在打磨清洗后的金电极表面滴加上述复合物溶液，在室温下反应，S3：将金电极浸泡到MCH溶液中，在金表面自组装单分子层，占据非特异性吸附的位点，进行表面的封闭，清洗金电极后用氮气吹干，得工作电极。

[0012] 进一步的，金电极的打磨清洗过程具体如下：经过Al2O3粉末打磨后，分别在浓度为0.5M的氢氧化钠溶液和0.5M的硫酸的溶液中清洗干净。

[0013] 进一步的，步骤S1中DNA溶液与TCEP溶液的摩尔比为0.01:2。

[0014] 本发明的一种基于多结合位点适配体的凝血酶电化学传感器的适配体DNA引入了双识别的策略，双识别位点的适配体能更快速有效地特异性识别全血中的凝血酶，为适配体的高灵敏、高选择性检测提供了新的思路，凝血酶的不同部位达到高的特异性，并且在DNA链的末端标记有电化学活性物质(亚甲基蓝)，从而将化学信号转化成电信号，实现对凝血酶的高灵敏、高选择性检测，该传感器可用于全血样本中凝血酶的检测，具有潜在的临床应用价值，更为重要的是，该方法采用了双识别的模式，提高了传感器的选择性。并且该方法不需要任何酶或纳米材料的参与，十分的简便快捷。

附图说明

[0015] 图1a为凝血酶的适配体Apt15的序列图；

[0016] 图1b为凝血酶的适配体Apt29的序列图；

[0017] 图2为基于适配体的电化学传感器示意图；

[0018] 图3a为对比例1的APT15传感器在PBS中的稳定性；

[0019] 图3b为对比例1为APT15传感器在加入凝血酶前后的信号变化(图中拐点为加入凝血酶的时间点)；

[0020] 图4a为APT15、APT29和APT‑unite传感器在0.1M的tris buffer溶液对凝血酶的结合速率图；

[0021] 图4b为APT15、APT29和APT‑unite传感器在全血中对凝血酶的结合速率图。

具体实施方式

[0022] 以下是本发明的具体实施例并结合附图，对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。

[0023] 材料与试剂

[0024] 磷酸缓冲盐溶液(PBS)、三(2‑羧乙基)膦(TCEP)、6‑疏基己醇(MCH)、凝血酶均由Sigma‑Aldrich公司提供。高效液相色谱(HPLC)纯化的寡核苷酸序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。整个实验过程均采用超纯水(电阻率为18.2MΩ·cm)，本工作中涉及的其他试剂均为分析级。用到的核酸序列如下：

[0025] Aptamer‑15(APT15)：

[0026] 5'‑SH‑(CH2)6‑TTTTTTTTTTGGTTGGTGTGGTTGG‑MB‑3'；

[0027] Aptamer‑29(APT29)：

[0028] 5'‑SH‑(CH2)6‑TTTTTTTTTTAGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT‑‑MB‑3'；

[0029] Aptamer‑unite(APT‑unite)：

[0030] 5'‑SH‑(CH2)6‑TTTTTTTTTTGGTTGGTGTGGTTGGTTTTTAGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT‑‑MB‑3'；

[0031] 实施例1：

[0032] (1)合成适配体DNA：

[0033] 5'‑SH‑(CH2)6‑TTTTTTTTTTGGTTGGTGTGGTTGGTTTTTAGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT‑‑MB‑3'，

[0034] (2)适配体DNA在电极表面的固定

[0035] 适配体DNA在基底上的固定是整个适配体传感器构建的开始也是关键，固定方法直接影响作为识别元件的适配体的分布密度和结合性能，从而影响适配体传感器的灵敏度和检测的准确性。本实验采用的是基于巯基和金原子化学反应的自组装法。首先将金电极(AuE，2mm)经过Al2O3粉末打磨后，分别在浓度为0.5M的氢氧化钠溶液和0.5M的硫酸的溶液中清洗干净。

[0036] 将100μM的DNA适配体溶液与20mM的三(2‑羧乙基)膦(TCEP)溶液反应1h还原二硫键，并用1×磷酸缓冲盐溶液(PBS)缓冲溶液将其稀释。接着，在电极表面滴加上述复合物，在室温下反应2h。随后，将电极浸泡到20mM的6‑疏基己醇(MCH)溶液中，在金表面自组装单分子层(SAM)，占据非特异性吸附的位点，进行表面的封闭。将电极用1×PBS缓冲溶液清洗电极后用氮气吹干。

[0037] (3)凝血酶的电化学检测

[0038] 通过传统的三电极体系(Ag/AgCl作为参比电极，铂丝作为对电极，金电极为工作电极)，使用方波伏安法(SWV)进行测试。考察传感器在全血环境中对于凝血酶分子的电信号响应，建立其与凝血酶浓度的数学对应关系。

[0039] 对比例1

[0040] 将适配体DNA换成

[0041] 5'‑SH‑(CH2)6‑TTTTTTTTTTGGTTGGTGTGGTTGG‑MB‑3'。

[0042] 图3a为对比例1的APT15传感器在PBS中的稳定性；

[0043] 图3b为对比例1为APT15传感器在加入凝血酶前后的信号变化(图中拐点为加入凝血酶的时间点)。

[0044] 对比例2

[0045] 将适配体DNA换成

[0046] 5'‑SH‑(CH2)6‑TTTTTTTTTTAGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT‑‑MB‑3'。

[0047] 采用三种适配体分别制备三种传感器(APT15(对比例1)、APT29(对比例2)和APT‑unite(实施例1))，在0.1M的tris buffer溶液中使用SWV测定。在未加入凝血酶时，观察到三组传感器都有很好的稳定性，如图4a中所示。加入相同浓度的凝血酶后，APT15传感器峰电流变化速率较APT‑unit缓慢。而APT29传感器峰电流变化大小比APT‑unit小很多。这表明APT‑unite传感器相比于APT15和APT29具有更高的灵敏度。

[0048] 采用三种适配体分别制备三种传感器(APT15、APT29和APT‑unite)，在血液中使用SWV测定。加入相同浓度的凝血酶后,APT15变化剧烈，如图4b中所示，但大约需要2.5h时间靶标与适配体的结合达到稳定状态；APT29传感器峰电流缓慢变化，直到大约4h后靶标与适配体的结合才能达到稳定状态，而APT‑unite传感器峰电流在30min内就基本达到一个稳定，显著地提高了结合速率。

[0049] 以上未涉及之处，适用于现有技术。

[0050] 虽然已经通过示例对本发明的一些特定实施例进行了详细说明，但是本领域的技术人员应该理解，以上示例仅是为了进行说明，而不是为了限制本发明的范围，本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例来做出各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的方向或者超越所附权利要求书所定义的范围。本领域的技术人员应该理解，凡是依据本发明的技术实质对以上实施方式所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围。

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