一种改性乳清蛋白的制备方法

摘要

本发明公开了一种改性乳清蛋白的制备方法，属于蛋白加工技术领域。该方法包括以下步骤：利用挤压对乳清蛋白预处理，得到不同挤压温度的挤出物；将所述挤出物与转谷氨酰胺酶催化交联反应，得到改性乳清蛋白。具体地，本发明通过将挤压技术结合转谷氨酰胺酶交联反应，使得挤压过程中产生的高压、高剪切力能使蛋白的结构被展开，从而暴露与TGase交联的位点，尤其是在低温(50℃)挤压更利于促进TGase催化WPI的交联程度的提高，同时实现了乳清蛋白的持水性、乳化活性和稳定性等功能提高，利于将本发明制备的改性乳清蛋白应用到不同的领域。

权利要求

1.一种挤压结合转谷氨酰胺酶处理对乳清蛋白进行改性的方法，其特征在于，包含以下步骤：

 (1)挤压乳清蛋白的制备：将乳清分离蛋白(WPI)作为原料，使用平行双螺杆挤出机进行挤压预处理；挤压参数设置为：喂料速度10g/min，物料含水量40％(w/w)，进水速度

5.5mL/min，螺杆转速240rpm；该挤出机分为4个功能分区，4个功能分区总共8个独立加热区，包括7个内置加热区、1个外部口模加热区，每一功能分区的温度保持恒定，喂料区：第一区25℃，混合区：第二区35℃、第三区45℃，蒸煮区：第四区50℃、第五区50℃、第六区50℃，出料区：第七区45℃，口模加热区：第八区25℃；挤压结束后，将获得的不同温度的挤出物冷冻干燥、研磨，得到挤压后的乳清蛋白粉末；

 (2)挤压乳清蛋白溶液的制备：将挤压的乳清蛋白粉末溶于去离子水，并在室温下磁力搅拌2h，得到40mg/mL的乳清蛋白溶液；

 (3)TGase交联挤压乳清蛋白的制备：将乳清蛋白溶液用1mol/L的氢氧化钠溶液调节至pH7.0，接着，将30U/g的TGase加入到溶液中，于50℃水浴加热4h以催化交联反应；交联反应结束后，将该交联溶液在75℃灭酶15min，于室温冷却；最后，将TGase交联WPI挤出物的样品进行冷冻干燥、研磨即得改性乳清蛋白粉。

2.一种如权利要求1所述的方法制备的改性乳清蛋白。

说明书

一种改性乳清蛋白的制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及蛋白加工领域，特别是涉及一种改性乳清蛋白的制备方法。

背景技术

[0002] 乳清蛋白是指酪蛋白被沉淀后，存在于乳清中的可溶性蛋白质的总称，约占乳蛋白质总量的18～20％。其主要成分包含α‑乳白蛋白(α‑LA)、β‑乳球蛋白(β‑LG)、免疫球蛋白
和牛血清白蛋白，分别占乳清蛋白总量的22％、60％、9％和6％。此外，还存在其他化合物，
例如乳铁蛋白、乳过氧化物酶和溶菌酶等。乳清蛋白具有很高的营养价值和多样化的功能
特性，通常作为营养强化剂、乳化剂、增稠剂、胶凝剂等被广泛用于食品加工。随着食品加工
技术的发展，乳清蛋白的原有特性已经不能满足食品工业的各种需求，因此需要对乳清蛋
白进行改性以增强其功能特性。

[0003] 目前，通常使用单一的改性方法对乳清蛋白进行改性，比如利用物理、化学或酶法。挤压技术作为一种物理改性的手段，已经被应用于食品领域。该技术利用物料在挤压过
程中受到的高温、高压、高剪切力协同作用，使蛋白质的结构发生变化，从而导致其功能特
性发生一定的改变。另外，已有研究证实转谷氨酰胺酶(TGase)是一种能够催化酰基转移反
应、交联反应和脱酰胺反应的酶，能以蛋白质中赖氨酸残基的ε‑氨基作为酰基受体，蛋白质
在分子内或分子间形成ε‑(γ‑谷氨酰胺)‑赖氨酸异肽键，使蛋白质分子发生交联反应，进
而改善蛋白质的乳化、起泡等功能特性。

[0004] 尽管有许多报道单独研究了挤压技术或TGase交联对蛋白质的影响，但目前还没有挤压技术能增加TGase交联的可及性的相关报道。因此本发明利用挤压技术结合TGase交
联对乳清蛋白进行处理，研究其结构和功能特性的变化，以提高乳清蛋白的功能特性，拓宽
其应用领域。

发明内容

[0005] 本发明的目的是针对上述现有技术存在的问题，提供一种改性乳清蛋白的制备方法，通过挤压结合TGase交联，实现了乳清蛋白的改性，提高了乳清蛋白的乳化活性和稳定
性等功能，可以将其应用到更广泛的领域。

[0006] 为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

[0007] 本发明提供一种改性乳清蛋白的制备方法，包括以下步骤：

[0008] 利用挤压对乳清蛋白预处理，得到不同挤压温度的挤出物；

[0009] 将所述挤出物与转谷氨酰胺酶催化交联反应，得到改性乳清蛋白。

[0010] 优选的是，用平行双螺杆挤出机进行挤压预处理，所述平行双螺杆挤出机的挤压参数包括：喂料速度10‑13g/min，物料含水量40‑50％(w/w)，进水速度5.0‑6.0mL/min，螺杆
转速200‑250rpm。

[0011] 优选的是，所述平行双螺杆挤出机包括4个功能分区(总共8个独立加热区)，不同功能分区的挤压温度设置为：喂料区(第一区20‑30℃)；混合区(第二区30‑40℃，第三区40‑
50℃)；蒸煮区(第四区‑第六区50‑90℃)；出料区(第七区40‑50℃，第八区20‑30℃)。

[0012] 优选的是，所述蒸煮区(第四区‑第六区)的挤压温度同时设置为45‑55℃。

[0013] 优选的是，所述转谷氨酰胺酶的添加量为25‑35U/g，催化交联反应时间为3‑5h。

[0014] 优选的是，所述挤出物转谷氨酰胺酶催化交联反应前，还包括冷冻干燥、研磨以及溶解过程，其中，溶解后的乳清蛋白浓度为30‑45mg/mL。

[0015] 优选的是，乳清蛋白溶液调整pH为7.0后，再与转谷氨酰胺酶在45‑55℃水浴加热条件下交联反应。

[0016] 优选的是，所述挤出物转谷氨酰胺酶催化交联反应后，还包括灭酶、冷却、冷冻干燥以及研磨步骤。

[0017] 本发明还提供一种利用所述的制备方法制备的改性乳清蛋白。

[0018] 本发明公开了以下技术效果：

[0019] 本发明是将乳清蛋白先进行挤压预处理，再与TGase进行交联反应。经实验发现，低温挤压(50℃)过程中产生的高压、高剪切力能使蛋白的结构被展开，从而暴露与TGase交
联的位点，更有利于促进TGase催化WPI的交联程度。同时，改善了乳清蛋白的持水、乳化等
特性，实验证明，与未经过本发明制备方法处理的WPI‑TGase(经过TGase交联的WPI)相比，
本发明制备的50℃挤压WPI‑TGase的乳化活性和乳化稳定性分别提高了63.78％和9.99％，
即从41.47％增加至67.92％、从29.82％增加至32.80％；持水性提高了97.73％，即从
0.44g/g增加至0.87g/g。因此，本发明通过将挤压结合TGase交联，不仅实现了乳清蛋白改
性，而且还提高了改性乳清蛋白的功能，更利于将其应用到不同的领域。

附图说明

[0020] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施
例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获
得其他的附图。

[0021] 图1为不同挤压温度对WPI和TGase交联后的WPI游离氨基含量的影响；

[0022] 图2为不同挤压温度对WPI分子量分布的影响；

[0023] 图3为不同挤压温度对TGase交联后的WPI分子量分布的影响；

[0024] 图4为不同挤压温度对WPI分子量分布的影响(用SDS和β‑巯基乙醇处理)；

[0025] 图5为不同挤压温度对TGase交联后的WPI分子量分布的影响(用SDS和β‑巯基乙醇处理)；

[0026] 图6为不同挤压温度对WPI粒径分布的影响；

[0027] 图7为不同挤压温度对TGase交联后的WPI粒径分布的影响；

[0028] 图8为不同挤压温度对WPI和TGase交联后的WPI平均粒径的影响；

[0029] 图9为不同挤压温度对WPI和TGase交联后的WPI游离巯基含量的影响；

[0030] 图10为不同挤压温度对WPI和TGase交联后的WPI表面疏水性的影响；

[0031] 图11为不同挤压温度对WPI和TGase交联后的WPI乳化活性的影响；

[0032] 图12为不同挤压温度对WPI和TGas交联后的WPI乳化稳定性的影响；

[0033] 图13为不同挤压温度对WPI和TGas交联后的WPI持水性的影响；

[0034] 图14为不同挤压温度对WPI二级结构的影响；

[0035] 图15为不同挤压温度对TGase交联后的WPI二级结构的影响；

[0036] 图16为未挤压WPI微观结构图(放大倍数为1000倍)；

[0037] 图17为50℃挤压WPI微观结构图(放大倍数为1000倍)；

[0038] 图18为90℃挤压WPI微观结构图(放大倍数为1000倍)；

[0039] 图19为130℃挤压WPI微观结构图(放大倍数为1000倍)；

[0040] 图20为TGase交联后的未挤压WPI微观结构图(放大倍数为1000倍)；

[0041] 图21为TGase交联后的50℃挤压WPI微观结构图(放大倍数为1000倍)；

[0042] 图22为TGase交联后的90℃挤压WPI微观结构图(放大倍数为1000倍)；

[0043] 图23为TGase交联后的130℃挤压WPI微观结构图(放大倍数为1000倍)。

具体实施方式

[0044] 现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

[0045] 应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每
个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中
间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括
或排除在范围内。

[0046] 除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的
实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所
有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的
文献冲突时，以本说明书的内容为准。

[0047] 在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实
施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

[0048] 实施例1

[0049] 一种挤压结合转谷氨酰胺酶处理对乳清蛋白进行改性的方法，包含以下步骤：

[0050] (1)挤压乳清蛋白的制备：将乳清分离蛋白(WPI)作为原料，使用平行双螺杆挤出机进行挤压预处理。挤压参数设置为：喂料速度10g/min，物料含水量40％(w/w)，进水速度
5.0mL/min，螺杆转速200rpm。该挤出机分为4个功能分区(总共8个独立加热区，包括7个内
置加热区、1个外部口模加热区)，每一功能分区的温度保持恒定：喂料区(第一区20℃)；混
合区(第二区30℃，第三区40℃)；蒸煮区(第四区50℃，第五区50℃，第六区50℃)；出料区
(第七区40℃，第八区(口模加热区)20℃)。挤压结束后，将获得的不同温度的挤出物冷冻干
燥、研磨，得到挤压后的乳清蛋白粉末。

[0051] (2)挤压乳清蛋白溶液的制备：将挤压的乳清蛋白粉末溶于去离子水，并在室温下磁力搅拌2h，得到30mg/mL的乳清蛋白溶液；

[0052] (3)TGase交联挤压乳清蛋白的制备：将乳清蛋白溶液用1mol/L的氢氧化钠溶液调节至pH7.0，接着，将25U/g的TGase加入到溶液中，于45℃水浴加热3h以催化交联反应。交联
反应结束后，将该交联溶液在75℃灭酶15min，于室温冷却。最后，将TGase交联WPI挤出物的
样品进行冷冻干燥、研磨即得改性乳清蛋白粉。

[0053] 实施例2一种挤压结合转谷氨酰胺酶处理对乳清蛋白进行改性的方法，包含以下步骤：

[0054] (1)挤压乳清蛋白的制备：将乳清分离蛋白(WPI)作为原料，使用平行双螺杆挤出机进行挤压预处理。挤压参数设置为：喂料速度10g/min，物料含水量40％(w/w)，进水速度
5.5mL/min，螺杆转速240rpm。该挤出机分为4个功能分区(总共8个独立加热区，包括7个内
置加热区、1个外部口模加热区)，每一功能分区的温度保持恒定：喂料区(第一区25℃)；混
合区(第二区35℃，第三区45℃)；蒸煮区(第四区50℃，第五区50℃，第六区50℃)；出料区
(第七区45℃，第八区(口模加热区)25℃)。挤压结束后，将获得的不同温度的挤出物冷冻干
燥、研磨，得到挤压后的乳清蛋白粉末。

[0055] (2)挤压乳清蛋白溶液的制备：将挤压的乳清蛋白粉末溶于去离子水，并在室温下磁力搅拌2h，得到40mg/mL的乳清蛋白溶液；

[0056] (3)TGase交联挤压乳清蛋白的制备：将乳清蛋白溶液用1mol/L的氢氧化钠溶液调节至pH7.0，接着，将30U/g的TGase加入到溶液中，于50℃水浴加热4h以催化交联反应。交联
反应结束后，将该交联溶液在75℃灭酶15min，于室温冷却。最后，将TGase交联WPI挤出物的
样品进行冷冻干燥、研磨即得改性乳清蛋白粉。

[0057] 实施例3一种挤压结合转谷氨酰胺酶处理对乳清蛋白进行改性的方法，包含以下步骤：

[0058] (1)挤压乳清蛋白的制备：将乳清分离蛋白(WPI)作为原料，使用平行双螺杆挤出机进行挤压预处理。挤压参数设置为：喂料速度13g/min，物料含水量50％(w/w)，进水速度
6.0mL/min，螺杆转速250rpm。该挤出机分为4个功能分区(总共8个独立加热区，包括7个内
置加热区、1个外部口模加热区)，分为4个功能分区(总共8个独立加热区，包括7个内置加热
区、1个外部口模加热区)，每一功能分区的温度保持恒定：喂料区(第一区30℃)；混合区(第
二区40℃，第三区50℃)；蒸煮区(第四区90℃，第五区90℃，第六区90℃)；出料区(第七区50
℃，第八区(口模加热区)30℃)。挤压结束后，将获得的不同温度的挤出物冷冻干燥、研磨，
得到挤压后的乳清蛋白粉末。

[0059] (2)挤压乳清蛋白溶液的制备：将挤压的乳清蛋白粉末溶于去离子水，并在室温下磁力搅拌2h，得到40mg/mL的乳清蛋白溶液；

[0060] (3)TGase交联挤压乳清蛋白的制备：将乳清蛋白溶液用1mol/L的氢氧化钠溶液调节至pH7.0，接着，将30U/g的TGase加入到溶液中，于50℃水浴加热4h以催化交联反应。交联
反应结束后，将该交联溶液在75℃灭酶15min，于室温冷却。最后，将TGase交联WPI挤出物的
样品进行冷冻干燥、研磨即得改性乳清蛋白粉。

[0061] 实施例4挤压温度对TGase交联WPI(WPI‑TGase)游离氨基含量的影响

[0062] 1)游离氨基含量的测定

[0063] 蛋白样品用去离子水稀释至5mg/mL的最终浓度。将3mL的邻苯二甲醛试剂分别加入到100μL的稀释后的蛋白样品中并迅速混合，然后在室温下避光静置5min，最后在340nm
波长处记录吸光度值，并通过吸光度值计算样品的游离氨基含量。用去离子水(100μL)代替
蛋白样品作为试剂空白。标准曲线通过使用L‑亮氨酸(0.1～0.5mg/mL)作为标准获得：y＝
2
1.362x‑0.0094，R＝0.9996。

[0064] 2)在实施例2的基础上，改变蒸煮区的挤压温度条件为50℃、70℃、90℃、110℃、130℃，研究挤压温度对TGase交联WPI游离氨基含量的影响，具体试验结果见图1。

[0065] 由图1可知，低温挤压预处理(50℃和70℃)能增加蛋白样品的游离氨基含量(P<0.05)。加入TGase后，能催化WPI分子内和分子间发生交联反应，诱导ε‑(γ‑谷氨酰胺)赖氨
酸异肽键的形成，导致未挤压、50℃挤压、70℃挤压这三组蛋白样品的游离氨基含量降低(P
<0.05)。尽管50℃挤压WPI‑TGase和70℃挤压WPI‑TGase的游离氨基含量与WPI‑TGase的游
离氨基含量相比没有显著性差异(P<0.05)，但是50℃和70℃挤压蛋白样品组的游离氨基含
量降低的幅度均高于未挤压的WPI，表明50℃和70℃挤压的蛋白样品经TGase交联被消耗的
游离氨基含量要更大，即低温挤压(50℃和70℃)后的蛋白可能与TGase交联的程度更大。

[0066] 随着挤压温度(90～130℃)的进一步增加，挤压WPI与挤压WPI‑TGase的游离氨基含量没有显著性差异(P>0.05)，即高温挤压后的WPI与TGase交联的程度不大。

[0067] 实施例5挤压温度对TGase交联WPI分子量分布的影响

[0068] 1)尺寸排阻色谱的测定

[0069] 通过尺寸排阻色谱研究蛋白质分子量的分布。高效液相色谱仪配备了TSK G2000‑SW分析柱(7.5mm×60cm，1mm)和TSK保护柱(7.5mm×7.5cm)。先将蛋白样品用去离子水稀释
至最终浓度5mg/mL，然后使用0.45μm滤膜过滤。将样品分为两组进行测量，其中一组使用含
有87.5％十二烷基硫酸钠(SDS)和4.17％β‑巯基乙醇的溶液稀释，以破坏样品中的非共价
键和二硫键；另一组则不作任何处理。用含0.1％三氟乙酸的30％乙腈溶液作为流动相，以
0.5mL/min的洗脱流速，将色谱柱平衡和洗脱。紫外吸收检测器的检测波长设置为280nm。

[0070] 2)在实施例2的基础上，改变蒸煮区的挤压温度条件为50℃、70℃、90℃、110℃、130℃，研究挤压温度对TGase交联WPI分子量分布的影响，具体试验结果见图2‑图3。

[0071] 如图2所示，经过挤压后的WPI在23.74min时出现了第一个峰，表示有大分子聚合物的形成。随着挤压温度的升高，峰高逐渐降低。这是由于在检测前，需要先用0.45μm的滤
膜过滤，所以导致经过高温挤压(90℃、11℃0和130℃挤压)后WPI产生的大分子不溶性聚集
物被滤过，不能被检测出来。通过看第二个峰(β‑LG)的峰高逐渐降低，也说明了有大分子物
质的生成导致β‑LG的消耗。如图3所示，50℃挤压WPI‑TGase与70℃挤压WPI‑TGase的峰高相
较于图2中对应的峰要高。表明经过TGase交联后的挤压WPI中，50℃和70℃的挤出物更有利
于与TGase交联。

[0072] 添加SDS和β‑巯基乙醇以清除二硫键对结果的影响，结果如图4和图5所示。

[0073] 如图4所示，经过挤压处理形成的蛋白质聚集体消失了。说明挤压过程中形成的大分子物质可能是由于二硫键引起的。通过图5的放大部分可以看出，随着挤压温度的增加，
峰高逐渐降低，且50℃挤压WPI‑TGase与70℃挤压WPI‑TGase的峰高略高于WPI‑TGase。这表
明50℃和70℃的挤出物与TGase交联的程度要大于WPI与TGase交联的程度，可以形成更多
的聚集体。并且，50℃比70℃的挤压温度更有利于蛋白暴露出TGase交联的位点。

[0074] 实施例6挤压温度对TGase交联WPI粒径分布的影响

[0075] 1)粒径的测定

[0076] 用磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液，pH7.0，浓度为0.01mol/L)稀释蛋白样品浓度至1mg/mL，然后用粒度分析仪进行测定。

[0077] 2)在实施例2的基础上，改变蒸煮区的挤压温度条件为50℃、70℃、90℃、110℃、130℃，研究挤压温度对TGase交联WPI粒径分布的影响，具体试验结果见图6‑图8。

[0078] 由图6可知，随着挤压温度(90～130℃)的增加，粒径分布逐渐向右偏移，即平均粒径逐渐增加(如图8所示)。经过TGase交联后，所有蛋白样品的粒径分布都整体向右偏移(如
图7所示)。这说明蛋白样品与TGase发生了交联，使得粒径分布发生了变化。

[0079] 由于110℃挤压和130℃挤压这两组的数据要远远大于未挤压、50℃挤压、70℃挤压这三组数据，所以导致这三组数据都差异不显著，因此，将未挤压、50℃挤压、70℃挤压、
90℃挤压这四组数据单独进行显著性分析，如图8放大图所示。50℃和70℃挤压WPI的平均
粒径和未经挤压的WPI没有显著性差异(P>0.05)，但是经过TGase交联后，50℃和70℃挤压
WPI‑TGase的平均粒径要显著大于未经挤压的WPI‑TGase(P<0.05)。这表明低温挤压(50℃、
70℃)的WPI与TGase交联后生成的聚合物多于未挤压的WPI，即交联程度要大于未挤压的
WPI。而高温挤压(90～130℃)后的WPI与经过TGase交联的挤压WPI‑TGase平均粒径没有显
著性差异，表明高温挤压后的蛋白样品不利于与TGase的交联。

[0080] 实施例7挤压温度对TGase交联WPI游离巯基含量的影响

[0081] 1)游离巯基含量的测定

[0082] 蛋白样品用pH8.0的标准缓冲液(0.086mol/L Tris，0.09mol/L甘氨酸和4mmol/L Na2EDTA)稀释至终浓度为2mg/mL，然后以3000g离心10min，取上清液用于测定。向3mL上清
液中加入30μL Ellman's试剂溶液(4mg DTNB/mL标准缓冲液)并迅速混合，然后在室温下避
光静置15min，最后在412nm波长处记录吸光度。以不加蛋白样品作为空白。Ellman's试剂的
4
摩尔消光系数为1.36×10。游离巯基(SH)含量表示为：

[0083]

[0084] 其中，A412表示样品在412nm波长处的吸光度值；D代表稀释倍数；C代表样品的浓度(mg/mL)。

[0085] 2)在实施例2的基础上，改变蒸煮区的挤压温度条件为50℃、70℃、90℃、110℃、130℃，研究挤压温度对TGase交联WPI游离巯基含量的影响，具体试验结果见图9。

[0086] 由图9可知，随着挤压温度的增加，挤压WPI和挤压WPI‑TGase的游离巯基含量都呈下降趋势，都小于未挤压的WPI和WPI‑TGase的游离巯基含量(P<0.05)。在挤压温度为130℃
时，挤压WPI的游离巯基含量最少。这是因为蛋白在高温挤压过程中会通过消耗大量的游离
巯基形成二硫键，再由二硫键交联形成大分子量的蛋白质‑蛋白质和/或蛋白质‑非蛋白质
聚合物。经过TGase交联后，游离巯基会在TGase催化过程中通过氧化反应形成二硫键。并且
可以看出，低温挤压(50℃和70℃)后与TGase交联，会明显降低游离巯基的含量(P<0.05)，
所以可以间接表明低温挤压更有利于与TGase交联。

[0087] 实施例8挤压温度对TGase交联WPI表面疏水性的影响

[0088] 1)表面疏水性的测定

[0089] 将蛋白样品用PBS缓冲液(pH7.0，浓度为0.01mol/L)稀释到0.2～1.0mg/mL，取20μL ANS溶液(浓度为8mmol/L)加入到4mL的稀释蛋白样品中，振荡混合并在暗处反应15min。
设定激发波长为390nm，发射波长为470nm，狭缝宽度为5nm。测得的荧光强度作为纵坐标、蛋
白浓度为横坐标，进行线性回归分析，得到的初始斜率作为蛋白样品的表面疏水性。

[0090] 2)在实施例2的基础上，改变蒸煮区的挤压温度条件为50℃、70℃、90℃、110℃、130℃，研究挤压温度对TGase交联WPI表面疏水性的影响，具体试验结果见图10。

[0091] 由图10可知，50℃挤压WPI的表面疏水性要显著高于未挤压的WPI(P<0.05)。这可能是，挤压过程中，在高压及高剪切力的作用下，蛋白内部部分疏水性氨基酸暴露，导致蛋
白表面疏水性增加。但是随着挤压温度的增加，挤压WPI的表面疏水性逐渐降低。这可能是
由于在挤压过程中高温使蛋白质产生聚集，从而将大多数疏水位点限制在聚集体内部。

[0092] 加入TGase后，50℃和70℃挤压WPI‑TGase的表面疏水性与未挤压WPI‑TGase相比显著升高(P<0.05)，分别增加了18.58％和4.91％。这可能是因为低温挤压使得TGase交联
程度增加，暴露出更多的疏水性氨基酸并增加了与ANS结合位点的可及性，从而提高了其表
面疏水性。而经过TGase交联的高温挤压(110℃和130℃)WPI与没有TGase交联的高温挤压
WPI相比，表面疏水性没有显著性差异(P>0.05)，表明高温挤压不利于与TGase交联，这与分
子排阻色谱等指标得出的结论一致。

[0093] 实施例9挤压温度对TGase交联WPI乳化特性的影响

[0094] 1)乳化特性的测定

[0095] 首先将3mL 0.5mg/mL的蛋白样品溶液和1mL豆油混合在一起，然后使用高速乳化机以10000rpm的速度均质乳化2min。然后，分别从管底吸取50μL乳状液放置0min和10min
后，立即与5mL 0.1％的SDS溶液混合，在500nm处记录吸光度。以0.1％的SDS溶液作为试剂
空白。乳化活性(EAI，m2/g)和乳化稳定性(ESI，％)采用以下公式计算：

[0096]

[0097] 其中A0表示乳状液放置0min后测定的吸光度，D表示稀释倍数100，φ表示乳状液的油相体积分数0.25，C表示乳化前蛋白质溶液的浓度(mg/mL)，T表示浊度2.303。

[0098]

[0099] 其中A0表示乳状液放置0min后测定的吸光度，A10表示在乳状液放置10min后测定的吸光度。

[0100] 2)在实施例2的基础上，改变蒸煮区的挤压温度条件为50℃、70℃、90℃、110℃、130℃，研究挤压温度对TGase交联WPI乳化特性的影响，具体试验结果见图11和图12。

[0101] 由图11可知，经过挤压预处理的WPI乳化活性比未挤压预处理的WPI乳化活性显著增加(P<0.05)，且50℃挤压WPI的乳化活性比未挤压预处理的WPI乳化活性增加了62.29％。
Mozafarpour等人通过挤压大豆蛋白，也发现了经过挤压处理的蛋白的乳化活性显著高于
未处理的大豆蛋白。另外，随着挤压温度的增加，挤压WPI的乳化活性逐渐降低。这可能是由
于随着挤压温度的增加，会导致聚集体的形成，因此，一些暴露的疏水基团被掩埋在蛋白内
部，改变了挤压WPI表面的疏水性和亲水性氨基酸分布，从而改变了蛋白的界面性质。与未
挤压WPI‑TGase相比，挤压WPI‑TGase(50～90℃挤压)的乳化活性显著增加(P<0.05)。50℃
挤压WPI‑TGase的乳化活性比未挤压WPI‑TGase提高了63.78％，即从41.47％增加至
67.92％。但是，与未经TGase交联的WPI和挤压WPI相比，经过TGase处理的WPI‑TGase和挤压
WPI‑TGase的乳化活性显著降低(P<0.05)。其原因可能是高摩尔质量和伸展的蛋白质结构，
减缓了蛋白质的界面吸附能力，促进了其在界面区域中的聚集，因此，导致交联后的WPI和
挤压WPI的乳化活性降低。

[0102] 从图12可以看出，与未挤压WPI相比，高温挤压(90℃、110℃、130℃)后的蛋白具有最高的乳化稳定性，分别增加了27.34％、39.06％、35.16％。大分子量聚集体的增加可能导
致蛋白质的柔韧性变差，降低了蛋白在油/水界面的吸附能力，并防止了油滴重新聚集，从
而提高蛋白的乳化稳定性。经过TGase交联处理后，WPI‑TGase、50℃挤压WPI‑TGase、70℃挤
压WPI‑TGase的乳化稳定性显著性增加(P<0.05)，而高温挤压(90～130℃)后交联的样品乳
化稳定性则差异不显著(P>0.05)。这同样说明了低温挤压(50℃和70℃)有利于TGase交联
形成更大的刚性结构，导致交联后蛋白的乳化稳定性的增加。

[0103] 实施例10挤压温度对TGase交联WPI持水性的影响

[0104] 1)持水性的测定

[0105] 称取约0.2g(m0)蛋白样品于10mL离心管内并称量(m1)，加入5mL去离子水，旋涡混合30s，然后在室温下静置24h。随后，以3000g离心15min，吸干上清液，称量(m2)。每个样品
重复3次。

[0106]

[0107] 2)在实施例2的基础上，改变蒸煮区的挤压温度条件为50℃、70℃、90℃、110℃、130℃，研究挤压温度对TGase交联WPI持水性的影响，具体试验结果见图13。

[0108] 由图13可以看出，与未经挤压预处理的WPI相比，随着挤压温度的增加，挤压WPI的持水性呈上升的趋势(P<0.05)。130℃挤压WPI的持水性比未经挤压预处理的WPI持水性显
著增加了1695.29％。这表明增加挤压的温度可以显著提高WPI的持水性。高温挤压可使蛋
白原有的空间结构变得更加致密，孔隙率小(见图16‑图23)，因此致密的蛋白网络截留了水
分，使得持水性增加。经过TGase交联后，在50～90℃的温度范围内，挤压WPI‑TGase的持水
性较挤压WPI的持水性显著性增加(P<0.05)，且均比未挤压预处理的WPI‑TGase的持水性要
高，而110℃和130℃挤压WPI‑TGase的持水性则没有显著性变化(P>0.05)。与未经挤压处理
的WPI‑TGase相比，50℃挤压WPI‑TGase的持水性提高了97.73％，即从0.44g/g增加至
0.87g/g。这表明与高温挤压的WPI相比，低温挤压处理的WPI更有利于与TGase交联形成连
续的网状结构去截留水分。

[0109] 实施例11挤压温度对TGase交联WPI二级结构的影响

[0110] 1)二级结构的测定

[0111] 利用FTIR光谱仪在室温下对蛋白样品进行全波数(4000～400cm‑1)的光谱扫描。将约2mg冻干蛋白样品与200mg KBr在研钵中混合研磨成均匀的粉末，并压成薄片。然后，在32
‑1 ‑1
次扫描中记录光谱，分辨率为4cm 。对蛋白样品中酰胺Ⅰ带(1700～1600cm )的二级结构变
化(α‑螺旋、β‑折叠、β‑转角和无规卷曲)进行了定量分析。

[0112] 2)在实施例2的基础上，改变蒸煮区的挤压温度条件为50℃、70℃、90℃、110℃、130℃，研究挤压温度对TGase交联WPI二级结构的影响，具体试验结果见图14和图15。

[0113] 由图14可以看出，经过挤压预处理后，α‑螺旋的含量显著降低(P<0.05)。这可能归因于较高的挤出温度下蛋白质二级结构的剧烈变化，从而降低了蛋白的螺旋度。
Tomczynska‑Mleko等发现WPI在加热的过程中发生变性，从而降低了α‑螺旋结构的含量。与
未经挤压预处理的WPI相比，50～90℃挤压WPI的β‑折叠含量是显著增加的，而90～130℃挤
压WPI的β‑转角含量是显著增加的(P<0.05)。根据Beck等研究发现，豌豆蛋白中β‑转角结构
的含量，在挤压后增加是由于形成了由β‑转角结构的分子间氢键组成的聚集体。因此，挤压
处理后WPI中β‑转角结构比例的增加，表明了分子间聚集体的形成。此外，β‑折叠的含量在
经过挤压处理后增加，说明蛋白质分子结构由折叠变得展开，分子结构由有序向无序转变，
从而促进埋藏在蛋白内部的疏水性基团的暴露。

[0114] 由于低温挤压后的WPI有利于与TGase交联，故50℃和70℃挤压WPI‑TGase的α‑螺旋和β‑折叠含量比未交联的挤压WPI要显著降低，β‑转角含量则显著升高(P<0.05)，而90～
130℃挤压WPI‑TGase的二级结构变化与未TGase交联时相比，差异不明显(如图14和图15所
示)。同时，Zhang等人也研究发现，当添加0.1％的TGase时，α‑螺旋结构会向β‑转角结构转
变来促进蛋白质分子链的伸展。

[0115] 实施例12挤压温度对TGase交联WPI微观结构的影响

[0116] 1)扫描电子显微镜的测定

[0117] 使用钨灯丝扫描电子显微镜在5kV的加速电压下观察蛋白样品微观结构的变化。在观察之前，使用离子溅射仪将蛋白样品镀金。然后以1000倍拍摄图像。

[0118] 2)在实施例2的基础上，改变蒸煮区的挤压温度条件为50℃、70℃、90℃、110℃、130℃，研究挤压温度对TGase交联WPI微观结构的影响，具体试验结果见图16‑图23。

[0119] 如图16‑图23所示，相比经过挤压预处理的样品，未经挤压预处理的WPI呈现出碎片化的状态。而经过挤压预处理的样品，随着挤压温度的增加，挤压WPI逐渐形成大的聚集
体。这是因为蛋白在高温挤压(90℃、110℃、130℃)过程中经历了聚集和交联，导致形成了
大分子量的蛋白质‑蛋白质和/或蛋白质‑非蛋白质聚合物。在低温挤压(50℃)下，挤压WPI
并没有形成大的聚合物，而是被剪切成更小的碎片，以及在蛋白表面形成了一些卷曲的结
构，这为暴露一些TGase交联位点提供了可能。蛋白经过TGase交联后，与未经挤压预处理的
WPI‑TGase相比，50℃挤压WPI‑TGase的交联效果更好，将原先的蛋白碎片交联成一个整体。
对于90℃挤压WPI‑TGase样品，可以看出，存在大的聚集体没有被交联的情况。而130℃挤压
WPI‑TGase样品被交联的效果微乎甚微。

[0120] 以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出
的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。