一种二氢杨梅素修饰DNA药物递送系统、纳米载药系统及制备方法和应用

摘要

本发明提供了一种二氢杨梅素修饰DNA药物递送系统、纳米载药系统及制备方法和应用，属于药物化学技术领域。本发明提供了一种二氢杨梅素修饰DNA药物递送系统，包括DNA以及共价键合在所述DNA上的二氢杨梅素。本发明以二氢杨梅素作为修饰剂，通过共价键合在DNA上实现对DNA修饰，将所得二氢杨梅素修饰DNA药物递送系统作为载体，其庞大的网络结构有利于捕捉并稳定Cu2+，避免CuONPs发生团聚，最终形成纳米载药系统，能够实现靶向抑菌治疗的刺激响应CuONPs的递送。

权利要求

1.一种纳米载药系统，包括载体以及负载在所述载体上的活性成分，所述活性成分为氧化铜纳米颗粒，所述载体为二氢杨梅素修饰DNA药物递送系统；所述氧化铜纳米颗粒的粒径为100 300nm，所述纳米载药系统中氧化铜纳米颗粒的负载量为40 50wt%；

~ ~

所述二氢杨梅素修饰DNA药物递送系统包括DNA以及氢键交联在所述DNA上的二氢杨梅素；所述DNA为鲑鱼精DNA；所述DNA与二氢杨梅素的摩尔比为1：(0.2 0.5)；

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所述纳米载药系统的制备方法包括以下步骤：将DNA、二氢杨梅素与水混合，进行接枝反应，得到二氢杨梅素修饰DNA药物递送系统；

将二氢杨梅素修饰DNA药物递送系统、可溶性铜盐与水混合，进行改性处理，得到前驱体料液；所述可溶性铜盐为乙酸铜、硫酸铜或氯化铜；

将所述前驱体料液与碱性试剂混合，进行水解‑脱水反应，得到纳米载药系统；所述碱性试剂为氢氧化钠或氢氧化钾。

2.根据权利要求1所述的纳米载药系统，其特征在于，所述接枝反应的温度为65 75℃，~时间为1.5 2.5h。

~

3.权利要求1 2任一项所述纳米载药系统的制备方法，包括以下步骤：~

将DNA、二氢杨梅素与水混合，进行接枝反应，得到二氢杨梅素修饰DNA药物递送系统；

将二氢杨梅素修饰DNA药物递送系统、可溶性铜盐与水混合，进行改性处理，得到前驱体料液；所述可溶性铜盐为乙酸铜、硫酸铜或氯化铜；

将所述前驱体料液与碱性试剂混合，进行水解‑脱水反应，得到纳米载药系统；所述碱性试剂为氢氧化钠或氢氧化钾。

4.权利要求1 2任一项所述纳米载药系统或权利要求3所述制备方法制备得到的纳米~载药系统在制备抗菌剂中的应用。

说明书

一种二氢杨梅素修饰DNA药物递送系统、纳米载药系统及制备

方法和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及药物化学技术领域，尤其涉及一种二氢杨梅素修饰DNA药物递送系统、纳米载药系统及制备方法和应用。

背景技术

[0002] 近年来，随着纳米工程技术在科学研究和应用方面飞速发展，金属及其氧化物纳米颗粒在生物标记、光学传感和抗癌抑菌等医疗领域应用广泛。其中，氧化铜纳米颗粒(CuO NPs)因其纳米结构特性和价格低廉等优点在抗微生物领域备受瞩目。然而，CuO NPs很容易聚集形成较大的纳米颗粒以降低自身表面能，因而很难在水中长期存在；同时，CuO NPs易团聚也会导致细胞毒性较大，使其对正常细胞有较强的副作用。这严重限制了CuO NPs在抗菌药物和临床治疗中的应用。

发明内容

[0003] 本发明的目的在于提供一种二氢杨梅素修饰DNA药物递送系统、纳米载药系统及制备方法和应用，本发明以二氢杨梅素作为修饰剂，通过共价键合在DNA上实现对DNA修饰，将所得二氢杨梅素修饰DNA药物递送系统作为载体负载CuO NPs，能够实现靶向抑菌治疗的刺激响应CuO NPs的递送。

[0004] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

[0005] 本发明提供了一种二氢杨梅素修饰DNA药物递送系统，包括DNA以及共价键合在所述DNA上的二氢杨梅素。

[0006] 优选地，所述DNA为鲑鱼精DNA。

[0007] 优选地，所述DNA与二氢杨梅素的摩尔比为1：(0.2～0.5)。

[0008] 本发明提供了上述技术方案所述二氢杨梅素修饰DNA药物递送系统的制备方法，包括以下步骤：

[0009] 将DNA、二氢杨梅素与水混合，进行接枝反应，得到二氢杨梅素修饰DNA药物递送系统。

[0010] 优选地，所述接枝反应的温度为65～75℃，时间为1.5～2.5h。

[0011] 本发明提供了一种纳米载药系统，包括载体以及负载在所述载体上的活性成分，所述活性成分为氧化铜纳米颗粒，所述载体为上述技术方案所述二氢杨梅素修饰DNA药物递送系统或上述技术方案所述制备方法制备得到的二氢杨梅素修饰DNA药物递送系统。

[0012] 优选地，所述氧化铜纳米颗粒的粒径为100～300nm，所述纳米载药系统中氧化铜纳米颗粒的负载量为40～50wt％。

[0013] 本发明提供了上述技术方案所述纳米载药系统的制备方法，包括以下步骤：

[0014] 将二氢杨梅素修饰DNA药物递送系统、可溶性铜盐与水混合，进行改性处理，得到前驱体料液；

[0015] 将所述前驱体料液与碱性试剂混合，进行水解‑脱水反应，得到纳米载药系统。

[0016] 优选地，所述可溶性铜盐包括乙酸铜、硫酸铜或氯化铜；所述碱性试剂包括氢氧化钠或氢氧化钾。

[0017] 本发明提供了上述技术方案所述纳米载药系统或上述技术方案所述制备方法制备得到的纳米载药系统在制备抗病原体制剂中的应用。

[0018] 本发明提供了一种二氢杨梅素修饰DNA药物递送系统，包括DNA以及共价键合在所述DNA上的二氢杨梅素。本发明以二氢杨梅素(DMY)作为修饰剂，通过共价键合在DNA上实现对DNA修饰，将所得二氢杨梅素修饰DNA药物递送系统(DNA/DMY)作为载体，其庞大的网络结2+
构有利于捕捉并稳定Cu ，避免CuO NPs发生团聚，最终形成纳米载药系统(即DMY修饰DNA负载CuO纳米颗粒，简写为DNA/DMY‑CuO)，能够实现靶向抑菌治疗的刺激响应CuO NPs的递送。

附图说明

[0019] 图1为本发明中DNA/DMY‑CuO的制备流程图；

[0020] 图2为DNA、DNA/DMY和DNA/DMY‑CuO的形貌和微观结构图；

[0021] 图3为DNA、DNA/DMY和DNA/DMY‑CuO的综合结构表征图；

[0022] 图4为DNA、DNA/DMY和DNA/DMY‑CuO的热分析图以及XPS图谱；

[0023] 图5为DNA和DNA/DMY的XPS图谱中各元素分谱；

[0024] 图6为CuONPs和DNA/DMY‑CuO的稳定性测试图以及抑菌测试结果图；

[0025] 图7为经不同浓度的DNA/DMY‑CuO分散液处理24h后培养的E.coli和S.aureus菌落的生长情况图；

[0026] 图8为DNA/DMY‑CuO的抑菌测试结果图；

[0027] 图9为DNA/DMY‑CuO被限制性内切酶触发并释放CuO NPs损坏DNA和ATP的抗菌机理图。

具体实施方式

[0028] 本发明提供了一种二氢杨梅素修饰DNA药物递送系统，包括DNA以及共价键合在所述DNA上的二氢杨梅素。本发明以二氢杨梅素作为修饰剂，通过共价键合在DNA上实现对DNA修饰，将所得二氢杨梅素修饰DNA药物递送系统作为载体，其庞大的网络结构有利于捕捉并2+
稳定Cu ，避免CuO NPs发生团聚；同时，DMY对革兰氏阴性菌(E.coli)和革兰氏阳性菌(S.aureus)具有明显的靶向黏附能力，能够为CuO NPs进入细菌提供高效雷达，有利于提高CuONPs的药效。

[0029] 在本发明中，所述DNA优选为鲑鱼精DNA，本发明采用DNA作为纳米载药系统的高分子外衣。在本发明中，所述DNA与二氢杨梅素的摩尔比优选为1：(0.2～0.5)。

[0030] 本发明提供了上述技术方案所述二氢杨梅素修饰DNA药物递送系统的制备方法，包括以下步骤：

[0031] 将DNA、二氢杨梅素与水混合，进行接枝反应，得到二氢杨梅素修饰DNA药物递送系统。

[0032] 在本发明中，所述DNA、二氢杨梅素与水的用量比优选为(0.1～1.0)g：(0.10～0.25)g：50mL，更优选为(0.4～0.5)g：(0.15～0.20)g：50mL。本发明对所述DNA、二氢杨梅素与水混合的方式没有特殊限定，能够将各组分混合均匀即可。

[0033] 在本发明中，接枝反应的温度优选优选为65～75℃，更优选为70℃；时间优选为1.5～2.5h，更优选为2h。在本发明中，所述接枝反应优选在搅拌条件下进行，所述搅拌的转速优选为400～500rpm，更优选为450rpm。在本发明中，所述接枝反应过程中，较高的温度有利于促使DNA发生热解旋并暴露碱基对，二氢杨梅素与DNA上的碱基和磷酸二酯共价键合，并促进单个DNA链彼此交联形成网络结构，最终所得二氢杨梅素修饰DNA药物递送系统庞大
2+
的网络结构有利于捕捉并稳定Cu ，避免CuO NPs发生团聚。

[0034] 所述接枝反应后，本发明优选将所得产物体系冷却至室温，之后进行透析以去除体系中残余的二氢杨梅素，得到二氢杨梅素修饰DNA药物递送系统。在本发明中，所述透析采用的透析袋的截留分子量优选为5000Da，所述透析优选以去离子水为透析液，所述透析的时间优选为2～4h，更优选为3h。在本发明中，所述透析完成后，得到二氢杨梅素修饰DNA药物递送系统溶液，经干燥后即得到二氢杨梅素修饰DNA药物递送系统；所述干燥优选为冷冻干燥。

[0035] 本发明提供了一种纳米载药系统，包括载体以及负载在所述载体上的活性成分，所述活性成分为氧化铜纳米颗粒，所述载体为上述技术方案所述二氢杨梅素修饰DNA药物递送系统或上述技术方案所述制备方法制备得到的二氢杨梅素修饰DNA药物递送系统。本发明以二氢杨梅素修饰DNA药物递送系统作为载体负载氧化铜纳米颗粒，能够使氧化铜纳米颗粒具有高度分散性，避免其团聚，实现靶向抑菌治疗的刺激响应CuO NPs的递送。在本发明中，所述氧化铜纳米颗粒的粒径优选为100～300nm，所述纳米载药系统中氧化铜纳米颗粒的负载量优选为40～50wt％。

[0036] 本发明提供了上述技术方案所述纳米载药系统的制备方法，包括以下步骤：

[0037] 将二氢杨梅素修饰DNA药物递送系统、可溶性铜盐与水混合，进行改性处理，得到前驱体料液；

[0038] 将所述前驱体料液与碱性试剂混合，进行水解‑脱水反应，得到纳米载药系统。

[0039] 本发明将二氢杨梅素修饰DNA药物递送系统、可溶性铜盐与水混合，进行改性处理，得到前驱体料液。在本发明中，所述可溶性铜盐优选包括乙酸铜、硫酸铜或氯化铜。在本发明中，所述二氢杨梅素修饰DNA药物递送系统与可溶性铜盐的质量比优选为(2～3)：1，更优选为(1.6～2.5)：1。在本发明中，所述二氢杨梅素修饰DNA药物递送系统、可溶性铜盐与水混合，具体是将可溶性铜盐与水混合，然后将所得可溶性铜盐溶液滴加至所述二氢杨梅素修饰DNA药物递送系统中；所述可溶性铜盐溶液的浓度优选为8～12mg/mL，更优选为10mg/mL；所述可溶性铜盐溶液的滴加速率优选为逐滴加入。在本发明中，所述改性处理的温度优选为室温，所述改性处理的时间优选为1.5～2.5h，更优选为2h；所述改性处理在搅拌条件下进行，所述搅拌的速率优选为250～350rpm，更优选为300rpm。在本发明中，所述改性处理的过程中，铜离子通过静电作用吸附到二氢杨梅素修饰DMY网络上，反应体系颜色变为黄褐色。

[0040] 得到前驱体料液后，本发明将所述前驱体料液与碱性试剂混合，进行水解‑脱水反应，得到纳米载药系统。在本发明中，所述碱性试剂优选包括氢氧化钠或氢氧化钾。在本发明中，所述碱性试剂与可溶性铜盐的质量比优选为1：(0.5～25)，更优选为1：(1～17)。在本发明中，所述碱性试剂优选以碱性试剂水溶液的形式使用，所述碱性试剂水溶液的浓度优选为0.5～1.5mg/mL，更优选为1mg/mL。在本发明中，所述水解‑脱水反应的温度优选为室温，时间优选为1～2h，更优选为1～1.5h。本发明优选将碱性试剂过量使用，在水解‑脱水反应过程中，在碱性条件下，铜离子水解成氢氧化铜，在过量碱性试剂存在条件下，氢氧化铜进一步脱水形成氧化铜；反应体系的颜色从黄褐色转变为深黑色；以可溶性铜盐为乙酸铜为例，涉及的反应式如下所示：

[0041] Cu(CH3COO)2·2H2O+2OH‑→Cu(OH)2+2CH3COO‑+2H2O  (1)

[0042] Cu(OH)2+2H2O→Cu(OH)42‑+2H+               (2)

[0043]

[0044] 所述水解‑脱水反应后，本发明优选将所得产物体系进行透析，以去体系中残余的可溶性铜盐以及碱性试剂，得到纳米载药系统。在本发明中，所述透析采用的透析袋的截留分子量优选为5000Da，所述透析优选以去离子水为透析液，所述透析的时间优选为4h以上，更优选为4～5h。在本发明中，所述透析完成后，得到纳米载药系统分散液，经干燥后即得到纳米载药系统；所述干燥优选为冷冻干燥。

[0045] 本发明采用上述方法制备纳米载药系统，在制备CuO NPs的同时将其负载于DNA/DMY上，新形成CuO NPs表面上丰富的结晶水分子又能与DNA/DMY网络结构上的碎片分子(如DNA碱基上的‑NH2、‑OH和DMY上的C＝O、‑OH)形成共价键，收缩折叠整个药物递送系统，最终形成DMY修饰DNA负载CuO纳米颗粒(DNA/DMY‑CuO)载药系统。

[0046] 本发明提供了上述技术方案所述纳米载药系统或上述技术方案所述制备方法制备得到的纳米载药系统在制备抗菌剂中的应用。

[0047] 下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[0048] 以下实施例以及测试例中所用实验仪器和试剂分别如表1和表2所示。

[0049] 表1实验仪器

[0050]仪器名称 仪器型号 生产商
真空冷冻干燥机 Alpha 1‑2 LD Plus 德国Christ公司
紫外分光光度计 S22PC 上海棱光技术有限公司
傅里叶红外光谱仪 Spectrum100 美国PerkinElmer公司
拉曼光谱仪 DXR2 美国Thermo Fisher公司
X射线粉末衍射 D8 Advance 德国Bruker公司
同步热分析仪 TGA2 美国Mettler‑Toledo公司
纳米粒度测试仪 90Plus PALS 美国Brookhacen仪器公司
透视电子显微镜 Tecnai G2 F20 美国FEI公司
溶出仪 RC12AD 天大天发科技有限公司
电导率仪 CT‑3030 深圳市柯迪达电子有限公司

[0051] 表2实验试剂

[0052]

[0053]

[0054] 此外，超微量Na+/K+‑ATP酶测定试剂盒与总蛋白测定试剂盒(考马斯亮蓝法)购自于南京建成生物工程研究所；E.coli和S.aureus取自仲恺农业工程学院生化实验室。

[0055] 二氢杨梅素(DMY)采用水热提取法从藤茶中提取得到，包括以下步骤：

[0056] 将20g藤茶枯茎叶和400mL去离子水加入到圆底烧瓶中，搅拌均匀后使用NaOH调节体系的pH值为7，将所述圆底烧瓶置于恒温加热磁力搅拌器中，在100℃条件下水浴提取0.5h；之后趁热过滤，弃滤渣，将提取液移至旋转烧瓶中浓缩，至所得浓缩液体积为所述提取液体积的1/4，将所述浓缩液放置在4℃的冰箱中冷藏12h，过滤，弃滤液，得到DMY粗提取物；

[0057] 将所述DMY粗提取物溶于8mL无水乙醇中，搅拌均匀后过滤，弃滤渣，再将滤液缓慢倒入到400mL去离子水中，在室温(25℃)条件下静置存放，直至析出DMY晶体，得到含有DMY晶体的悬液；使用减压抽滤机对所述悬液进行抽滤，弃滤液，将滤渣放置于烘箱中鼓风干燥，得到DMY(纯度为94.3％)。

[0058] 实施例1

[0059] 图1为本发明中DNA/DMY‑CuO的制备流程图，具体如下：

[0060] 准确称取0.4g鲑鱼精DNA(DNA)溶解在含有50mL去离子水的圆底烧瓶中，加入0.2g DMY，在70℃、450rpm转速条件下搅拌2h；将所得反应溶液转移至5000Da透析袋中，采用去离子水持续透析3h，以除去多余的DMY，得到DNA/DMY溶液；

[0061] 将所述DNA/DMY溶液加入到烧杯中，采用注射器将25mL浓度为10mg/mL的乙酸铜溶液逐滴加入到所述DNA/DMY溶液中，室温(25℃)、300rpm转速条件下搅拌2h；随后将15mL浓度为1mg/mL的NaOH溶液添加入反应液中，反应液的颜色从黄褐色转变为深黑色，继续反应1h；将所得产物体系转移到5000Da透析袋中，采用去离子水持续透析4h，以除去多余的乙酸铜和NaOH，得到DNA/DMY‑CuO分散液。

[0062] 以下测试例数据采用SPSS 25.0统计软件进行统计学分析，所有结果均以数值±标准误差表示，P＜0.05判定数值具有统计学意义。

[0063] 测试例1结构表征与微观形貌观察

[0064] 采用纳米粒度测试仪测定DNA溶液、DNA/DMY溶液和DNA/DMY‑CuO分散液的Zeta电位以及DNA/DMY‑CuO分散液中DNA/DMY‑CuO的粒径分布。

[0065] 采用真空冷冻干燥机冷冻干燥DNA/DMY溶液和DNA/DMY‑CuO分散液，得到相对应固‑1体样品。在4000～400cm 范围内，根据KBr片剂法使用傅里叶红外光谱仪对DNA、DNA/DMY和DNA/DMY‑CuO进行红外分析；采用显微拉曼光谱仪对DNA、DNA/DMY和DNA/DMY‑CuO进行拉曼分析；以Cu靶Kα为辐射源，使用X射线粉末衍射仪对DNA、DNA/DMY和DNA/DMY‑CuO进行XRD分析，波长(λ)为0.154056nm，管电压40kV，管电流15mA；在N2保护下，使用同步热分析仪以10℃/min的升温速率考察DNA、DNA/DMY和DNA/DMY‑CuO在40～900℃范围内的热稳定性。采用X射线光电子能谱(XPS)和扫描电子显微镜(SEM)对DNA、DNA/DMY和DNA/DMY‑CuO进行XPS分析和微观形貌观察。

[0066] 图2为DNA、DNA/DMY和DNA/DMY‑CuO的形貌和微观结构图，现根据图2进行详细说明。

[0067] 图2中的(a)为DNA、DNA/DMY和DNA/DMY‑CuO的宏观图，结果显示，纯净的鱼精DNA溶液为无色透明溶液，但经DMY修饰后溶液转变为橙黄色，表明物质的材料成分和微观结构发生变化；DNA/DMY‑CuO为黑色溶液。

[0068] 图2中的(b)为DNA、DNA/DMY和DNA/DMY‑CuO的Zeta电位图，结果显示，DMY的引入降低了DNA骨架的表面电荷，使溶液Zeta电位由‑27.35mV转变到‑18.54mV，这主要是由于DMY与DNA上磷酸二酯键共轭体系的建立促进了磷酸根离子的质子化，从而降低DNA的磷酸化程度。相比之下，DNA/DMY‑CuO的Zeta电位重新提高到‑48.08mV，这主要与CuO NPs的形成有+关。在碱性pH条件下，Cu(OH)2上H会被解离出来，从而形成表面带负电荷的CuO键和结晶水，而DNA/DMY在CuO NPs形成过程中起到了还原和表面稳定剂的作用。值得注意的是，较强的表面负电荷有利于抑制载药系统间的团聚，保持DNA/DMY‑CuO的长期稳定性。

[0069] 图2中的(c)为DNA/DMY‑CuO的粒径分布，结果显示，DNA/DMY‑CuO的粒径为204.39nm，具有较高的均一性。

[0070] 图2中的(d)为DNA/DMY的SEM图(标尺为500nm)，(e)为DNA/DMY‑CuO的SEM图(标尺为500nm)。DMY为多酚类黄酮物质，其分子上三个六元环赋予了其刚性结构特征。在与DNA相互作用后，DMY作为DNA彼此交联的支柱与桥梁，阻止了DNA单链再次螺旋化，从而构建出机械稳定的DNA/DMY网络。因此，如图2中的(d)所示，DNA/DMY呈现出“海藻”状的微观形态特征。相比之下，图2中的(c)所示，DNA/DMY‑CuO自组装形成尺寸范围为100～200nm的均一球体。这是由于DNA/DMY‑CuO中CuONPs表面水分子能与整个DNA/DMY网络形成共价键，收缩折叠整个药物递送系统并最终形成3D立体结构。

[0071] 图2中的(f)为DNA/DMY‑CuO的SEM‑EDS面扫描图，结果显示，C、O、N和Cu元素存在于DNA/DMY‑CuO中，且Cu和O元素以高比例分布，表明DNA/DMY‑CuO中富含高纯度CuO。

[0072] 图2中的(g)为DNA/DMY‑CuO的EDS谱图和元素组成图，进一步证实DNA/DMY‑CuO中C(0.27keV)、O(0.52keV)、N(0.39keV)和Cu(0.94keV和1.05keV)元素的存在，质量百分比分别为38.12％、10.91％、43.70％和7.27％，这也为DNA/DMY‑CuO的成功合成提供了直接证据。

[0073] 图3为DNA、DNA/DMY和DNA/DMY‑CuO的综合结构表征图，其中，(i)为DNA，(ii)为DNA/DMY，(iii)为DNA/DMY‑CuO。现根据图3进行详细说明。

[0074] 图3中的(a)为DNA、DNA/DMY和DNA/DMY‑CuO的UV‑vis图谱，结果显示，DNA的特征吸收峰在262nm处，为其芳香碱基对中π‑π的能级跃迁的结果，而形成DNA/DMY‑CuO后吸收峰红移至322nm，表明共价键的形成减低了DNA磷酸骨架和碱基对的电子云密度。

[0075] 图3中的(b)为DNA、DNA/DMY和DNA/DMY‑CuO的FTIR图谱，结果显示，DNA曲线上‑1 ‑1 ‑11646cm 处的吸收峰为‑CONH‑中C＝O的伸缩振动峰，而1237cm 和1074cm 分别为磷酸基团
3‑
(PO4 )不对称振动和核糖C‑C的拉伸振动引起的。对于DNA/DMY的FTIR曲线，磷酸基团不对‑1 ‑1
称伸缩振动峰迁移至1237cm 处，并且核糖C‑C吸收峰被发现在1074cm 处。峰值向较低波数的整体转移证实DMY与DNA分子间相互作用力的形成。值得注意的是，核糖C‑C的拉伸振动‑1 ‑1
峰在DNA/DMY‑CuO曲线裂解为1092cm 处和1010cm 处吸收峰，为DNA骨架的收缩提供了依‑1
据。此外，DNA/DMY‑CuO曲线650cm 处新出现的吸收峰(Cu‑O键)证实了CuO NPs的形成，而‑1
DNA骨架中‑CONH‑的伸缩振动峰在迁移至1570cm ，表明C＝O参与了CuO NPs的形成。

[0076] 图3中的(c)为DNA、DNA/DMY和DNA/DMY‑CuO的Raman图谱，结果显示，DNA/DMY曲线‑1上1094cm 处新形成的吸收峰与DMY和DNA磷酸基团对之间共价键的形成有关，这进一步证‑1
实了DMY与DNA之间存在相互作用力。对于DNA/DMY‑CuO曲线，DNA骨架C＝O在1737cm 处的吸‑1
收峰消失并在559cm 处形成Cu‑O特征吸收峰，这主要与CuO NPs的形成有关。研究表明，DNA
2+
骨架可通过静电吸引将金属离子附着在其磷酸骨架或碱基对上，而Cu 能为芳香碱基C＝O上的成键电子提供空轨道并形成相对稳定的共价键，为后续形成CuO NPs作准备。

[0077] 图3中的(d)为DNA、DNA/DMY和DNA/DMY‑CuO的XRD图谱，结果显示，DNA曲线呈现出宽且重叠图谱，表明其为非晶相结构。DNA/DMY曲线15～25°发生部分弯曲，表明物质结构发生改变。值得注意的是，DNA/DMY‑CuO曲线中噪音折叠消失，并且出现一系列尖锐的布拉格峰，表明载药系统中形成晶体化合物。但由于载药系统的屏蔽，部分强度较弱的标准CuO峰并未检出。

[0078] 图4为DNA、DNA/DMY和DNA/DMY‑CuO的热分析图以及XPS图谱，其中，(i)为DNA，(ii)为DNA/DMY，(iii)为DNA/DMY‑CuO。图5为DNA和DNA/DMY的XPS图谱中各元素分谱。现根据图4和图5进行详细说明。

[0079] 图4中的(a)为DNA、DNA/DMY和DNA/DMY‑CuO的热分析图，结果显示，DNA、DNA/DMY和DNA/DMY‑CuO在40～150℃的重量损失为其各自表面物理吸附水蒸发导致的，失重率分别为13.97％、10.95％和8.70％。继续提升温度，DNA/DMY和DNA/DMY‑CuO热稳定性明显高于DNA，这主要是因为共价键的构建提升了磷酸骨架中的热稳定性。其中，DNA在150～400℃范围内的失重率为30.81％，而DNA/DMY和DNA/DMY‑CuO的失重率只有20.80％和16.08％。当温度升至596℃后，DNA/DMY较DNA的热稳定开始降低。DNA在600～900℃范围内的失重率为
17.28％，而DNA/DMY的失重率达到32.00％。该阶段重量损失主要对应DNA骨架中脱氧核糖与碱基的进一步分解，而DNA/DMY热稳定性的降低可能是因为DMY的插入破坏了DNA部分碱基对的氢键。此外，DNA/DMY网络机械结构也抑制DNA双链的高序扭曲，促进内部脱氧核糖与碱基的暴露。值得注意的是，相比DNA/DMY在热分解过程中(40～900℃)的总失重率为
87.28％，DNA/DMY‑CuO的总失重率只有46.62％，这是由于CuO键的高热稳定导致的，这也为CuONPs的成功合成提供了依据。

[0080] 图4中的(b)为DNA、DNA/DMY和DNA/DMY‑CuO的XPS图谱，(c)为DNA/DMY‑CuO的XPS图谱中的Cu分谱，(d)为DNA/DMY‑CuO的XPS图谱中的C分谱，(e)为DNA/DMY‑CuO的XPS图谱中的O分谱，(f)为DNA/DMY‑CuO的XPS图谱中的N分谱。图5中的(a)为DNA的XPS图谱中的C分谱，(b)为DNA的XPS图谱中的O分谱，(c)为DNA的XPS图谱中的N分谱，(d)为DNA/DMY的XPS图谱中的C分谱，(e)为DNA/DMY的XPS图谱中的O分谱，(f)为DNA/DMY的XPS图谱中的N分谱。结果显示，DNA和DNA/DMY的XPS曲线均存在C1s、O 1s和N1s信号。相比之下，新的Cu 2P强度峰出现在DNA/DMY‑CuO的XPS曲线上，表明DNA/DMY‑CuO中存在Cu元素。在DNA/DMY‑CuO高分辨率的Cu 2p分谱中，位于952.32eV和932.57eV处吸收峰与常见CuO颗粒XPS报告中Cu 2p1/2和Cu 2p3/2光谱接近(Priyadarshni N,NathP,Nagahanumaiah,Chanda N.Sustainable removal ofarsenate,arsenite and bacterial contamination from water using biochar stabilized iron and copper oxide nanoparticles and associated mechanism of the remediation process.Journal of Water Process Engineering.2020；37)，证实了DNA/DMY‑CuO中CuO NPs的存在。DNA的C 1s分谱中位于286.20eV、284.65eV和283.34eV处的子峰分别对应C(O)‑NH、C＝C和C‑O键的sp2杂化碳原子。相比之下，DNA/DMY上的C(O)‑NH峰(287.38eV)、C＝C峰(285.74eV)和C‑O峰(284.60eV)偏移至更高的结合能，这主要是因为DNA与DMY之间共价键的形成降低了C原子的外层电子密度，从而增强了碳核对1s电子的引力。值得注意的是，DNA/DMY‑CuO的C1s分谱中，位于288.68eV处新出现的C1s子峰可能是由DMY或脱氧核糖上的C＝O引起的。此外，在DNA/DMY‑CuO的O1s分谱是由位于536.06eV、
532.17eV和531.15eV处的N‑O、Cu‑O和C(O)‑NH峰组成，而DNA/DMY‑CuO的N1s分谱是由位于
400.42eV和399.07eV处的NH2峰和C(O)‑NH峰组成。这些结果表明，DNA/DMY‑CuO是由DNA、DMY和CuO NPs通过多种化学键发生相互作用自组装形成。

[0081] 测试例2接触角测量以及抑菌性能测试

[0082] (1)接触角测量

[0083] 分别取5mL浓度为40mg/mL的DNA/DMY‑CuO分散液和CuO NPs分散液，以玻璃为接触面，吸取1mL样品分散液，采用接触角仪进行接触角测量；静置保存样品24h后，吸取上清液再次进行接触角测量。

[0084] (2)抗菌活性研究

[0085] 准确称取40mg DNA/DMY‑CuO或CuO NPs，超声分散在1mL去离子水中，采用琼脂扩散法测定DNA/DMY‑CuO、CuO NPs对E.coli和S.aureus的抑菌活性。具体是在无菌超净台上，将25mL灭菌的琼脂培养基倒入灭菌的玻璃培养皿中，自然冷却至其凝固，随后吸取100μL活8 6
菌悬液(E.coli：1.0×10CFU/mL；S.aureus：1.0×10CFU/mL)并均匀接种于琼脂平板表面，使用打孔器在固体介质上挖出三个直径为6mm的圆孔，每个孔中加入80μL抗菌样品；封装培养皿，并将其放置于培养箱中，在37℃条件下孵育；24h后取出培养皿，多次实验后用交叉法测得抑菌圈的直径。

[0086] 为了进一步评价DNA/DMY‑CuO和CuO NPs的抗菌能力，以无菌水为空白对照组，测定两种药物处理E.coli和S.aureus菌液后菌落数的形成单位(the colony forming 8
unitpermL,CFU/mL)。具体是吸取20μL菌液(E.coli：1.0×10 CFU/mL；S.aureus：1.0×
5
10CFU/mL)于无菌96孔板中，加入80μL灭菌后的LB培养基，轻微摇匀后，加入100μL药品悬浊液或无菌水；封装96孔板，并将其放置在摇床，于37℃培养24h；吸取100μL含药菌液，10倍数稀释5～7次，吸取100μL每个稀释倍数的菌液，均匀涂抹在琼脂固体培养基中；封装培养皿，并置于37℃培养箱中孵化24h；之后取出培养皿，手动计算琼脂培养基中的菌落数，得到处理后菌液浓度(CFU/mL)。每个处理平行3次实验。

[0087] (3)最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)测定

[0088] 采用标准微量稀释法测定DNA/DMY‑CuO对E.coli和S.aureus的MIC和MBC。具体是将20μL的菌悬液和80μL灭菌的LB肉汤加入到96孔板孔中，然后分别加入100μL不同浓度的DNA/DMY‑CuO溶液，使药物终浓度分别为0mg/mL、0.025mg/mL、0.05mg/mL、0.10mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.5mg/mL；封装96孔板，并将其放置于摇床，37℃条件下培养24h，培养期间每隔一段时间使用酶标仪测定菌液的OD600值。培养24h后，收集100μL含药菌液并均匀涂布在25mL琼脂固体培养基表面中，37℃孵育24h，拍照并记录琼脂上菌落形成情况。其中，MIC被解释为抑制细菌生长的最低样品浓度，MBC被解释为能杀死菌液中99.9％的细菌的最低药物浓度。每个处理平行5次实验。

[0089] (4)生物扫描电镜观察

[0090] 将200μL细菌溶液(105CFU/mL)和800μLLB肉汤添加到2mL无菌离心管中，随后将1000μL的DNA/DMY‑CuO分散液放入细菌悬浮液中以获得DNA/DMY‑CuO分散液的MIC；将混合物溶液在37℃下孵育6h，然后在3000rpm条件下离心10min，将沉淀细菌固定在4℃的2.5％戊二醛中12h，然后用PBS缓冲液(pH＝7.0)洗涤3次，细菌细胞用梯度醇溶液脱水，最后将细菌细胞冷冻干燥，涂金，并通过扫描电子显微镜(日本JEOL Ltd.的JSM‑6380LV)观察。

[0091] (5)菌液电导率测定

[0092] 准确吸取4mL菌悬液于15mL无菌离心管中，3000r/min离心10min，倒去溶液，使用磷酸缓冲溶液(pH＝7.0)洗涤细菌3次，再将干净的细菌沉淀物重新分散在15mL磷酸缓冲溶液中备用。吸取2mL干净的菌悬液于5mL灭菌离心管中，然后加入2mL 2MIC DNA/DMY‑CuO分散液或等体积无菌水，充分摇匀后将离心管放置于摇床，37℃条件下进行培养；之后将含药菌液置于超速离心机，3000r/min条件下离心10min，收集1mL上清液，再用超纯水稀释至25mL，采用电导率仪测定药物处理0h、1h、2h、4h和6h后菌液的电导率。每个处理平行3次实验。

[0093] (6)胞内腺嘌呤核苷三磷酸(Na+/K+‑ATP)的测定

[0094] 采用生理盐水对4mL菌悬液进行洗涤、重悬，并定容至15mL，吸取2mL干净的菌悬液于5mL灭菌离心管中，然后加入2mL 2MIC DNA/DMY‑CuO分散液或等体积无菌水，充分摇匀后将离心管放置在摇床，在37℃条件下进行培养；之后将含药菌液置于超速离心机，3000r/min条件下离心10min，弃滤液并保留底部细菌沉淀物，加入生理盐水重悬至溶液体积为0.2mL，再使用超声粉碎机破碎细菌。根据购买的Na+/K+‑ATP试剂盒的操作说明配制指示剂和显示剂，孵化后使用超微量紫外分光光度计测定溶液在636nm处吸光度。每个处理平行3次实验。

[0095] (7)结果分析

[0096] 图6为CuO NPs和DNA/DMY‑CuO的稳定性测试图以及抑菌测试结果图，现根据图6进行详细说明。

[0097] 图6中的(a)为CuO NPs分散液和DNA/DMY‑CuO分散液静置24h的图片，(b)为CuO NPs分散液和DNA/DMY‑CuO分散液的静置24h前后的接触角结果图。如图6中的(a)所示，由于普通CuO NPs本质上是疏水的，并且较高的比表面能驱使其不断发生碰撞并团聚，因此CuO NPs在水中随着时间的推移而沉淀。相比之下，DNA/DMY‑CuO在水中保持高度稳定性和分散性，这主要是由于DNA/DMY‑CuO外层DNA骨架富含‑NH2、‑OH等多种亲水基团；此外，较强的表面负电荷也有利于抑制其团聚，使DNA/DMY‑CuO长期保持稳定性。如图6中的(b)所示，静置24h后，CuO NPs上清液接触角由原来的66.1°降至57.2°，与去离子水的接触角(58.9°)相近，表明上清液中的CuO NPs已基本沉淀下来。相比之下，DNA/DMY‑CuO上清液接触角无明显变化，表明DNA/DMY‑CuO在水中仍能够稳定存在。

[0098] 图6中的(c)为经CuO NPs处理的E.coli；(d)为经DNA/DMY‑CuO处理的E.coli；(e)为经药物处理24h后E.coli菌液的菌浓度；(f)为经CuO NPs处理的S.aureus；(g)为经DNA/DMY‑CuO处理的S.aureus；(h)为经药物处理24h后S.aureus菌液的菌浓度。如图6中的(c)和(f)所示，CuO NPs沉淀在圆孔中，三个圆孔周围均无抑菌圈；相比之下，DNA/DMY‑CuO对E.coli和S.aureus的抑菌圈分别为16.28±0.56mm和15.80±0.48mm，表明DNA/DMY‑CuO较CuO NPs具有明显的抑菌活性。通过测量与药物共培养24h后的菌浓度以进一步评估CuO NPs和DNA/DMY‑CuO的抗菌能力，如图6中的(e)和(h)所示，在无药物处理下，E.coli和7 7
S.aureus的菌浓度分别为4.9×10CFU/mL和4.2×10CFU/mL；但经CuO NPs处理后E.coli和
5 5
S.aureus的菌浓度分别降至5.9×10 CFU/mL和3.6×10 CFU/mL，表明CuO NPs对E.coli和S.aureus具有一定的抑制能力；值得注意的是，经DNA/DMY‑CuO处理后E.coli和S.aureus的菌浓度均为0CFU/mL，表明DNA/DMY‑CuO对E.coli和S.aureus具有更高的抑菌活性和整体杀伤效果。

[0099] 图7为经不同浓度的DNA/DMY‑CuO分散液处理24h后培养的E.coli和S.aureus菌落的生长情况图，其中，低菌落数被解释为低的细菌浓度和较高的药物抑菌活性。结果显示，与对照组(0mg/mL)相比，经浓度为0.50mg/mL的DNA/DMY‑CuO分散液处理24h后培养的E.coli菌落数明显减少，且药效与药浓度成正相关。当DNA/DMY‑CuO分散液浓度为5.00mg/mL时，菌液中99％的E.coli已被完全杀死，培养基无E.coli菌落生成。因此，DNA/DMY‑CuO对E.coli的MIC和MBC值分别为0.50mg/mL和5.00mg/mL。同理，DNA/DMY‑CuO对S.aureus的MIC和MBC值分别为0.50mg/mL和3.00mg/mL。

[0100] 图8为DNA/DMY‑CuO的抑菌测试结果图，图8中的(a)为DNA/DMY‑CuO与细菌外层细胞膜的相互作用示意图；(b)为DNA/DMY‑CuO处理后E.coli的扫描电镜图(标尺为1.00μm)；(c)为DNA/DMY‑CuO处理后S.aureus的扫描电镜图(标尺为1.00μm)；(d)为DNA/DMY‑CuO对E.coli胞外电导率的影响图；(e)为DNA/DMY‑CuO对S.aureus胞外电导率的影响图；(f)为不同药物处理6h后E.coli和S.aureus菌液图片，其中，(i)为经无菌水处理的E.coli菌液，(ii)为经无菌水处理的S.aureus菌液，(iii)为经DNA/DMY‑CuO处理的E.coli菌液，(iv)为经DNA/DMY‑CuO处理的S.aureus菌液；(g)为DNA/DMY‑CuO对E.coli胞内ATP含量的影响图；
(h)为DNA/DMY‑CuO对S.aureus胞内ATP含量的影响图。图中标记星号的柱状图之间的数值具有统计学差异(p<0.05)。

[0101] 如图8中的(a)所示，本发明提供的DNA/DMY‑CuO中，DMY起到交联剂的作用，同时还为DNA/DMY‑CuO高效识别E.coli和S.aureus起到雷达作用，具体的，DMY与外层细胞膜之间存在碳水相互作用，能特异性识别细菌，由于带负电荷的DNA大分子无法单独跨越生物屏障，因此，经折叠收缩的DNA纳米结构不仅表现出很高的稳定性，而且有效增加药物在细菌中的进入和滞留。

[0102] 如图8中的(b)和(c)所示，经DNA/DMY‑CuO处理后的E.coli和S.aureus菌体出现明显的细胞膜破裂、菌体扭曲畸形和菌内原生质溶出。与包裹在膜细胞器中的真核染色体不同，细菌DNA分子(例如质粒和染色体)游离在细菌原生质中，并充当直接暴露于所有酶的底物。因此，DNA/DMY‑CuO被摄取后，CuO NPs的解离由DMY的解离和降解引发，并通过限制性内切核酸酶得到进一步释放。DMY分子含六个酚羟基，使其具备微酸性，从而增加其在中性和碱性条件下被氧化甚至开环降解的风险；当DMY被解离后，暴露的DNA骨架会被游离的限制性内切核酸酶附着，并通过在相应的限制性位点破坏磷酸二酯键被进一步分解，从而彻底释放出CuO NPs。

[0103] 如图8中的(d)和(e)所示，与对照组相比，经DNA/DMY‑CuO处理后的E.coli和S.aureus菌液电导率随时间的延长而提升。与DNA/DMY‑CuO共培养6h后E.coli菌液电导率2+
提升了101.43％，S.aureus菌液电导率提升了104.90％。CuO NPs被释放后电离出大量Cu ，能进一步刺激菌内渗透压和电子失衡，从而破坏细胞膜导致细菌胞内原生质流出死亡。此
2+
外，Cu 可以通过配位衍生的相互作用影响酶的活性或损害DNA的结构，干扰并抑制细菌生长分裂的活性。如图8中的(f)所示，经ATP显示剂染色后，与DNA/DMY‑CuO共培养6h的E.coli和S.aureus菌液颜色均变淡，表明菌体中ATP含量大幅度减少。根据商业ATP试剂盒操作说明，采用超微量紫外分光光度计测定菌液在636nm处的吸光度，结果如图8中的(g)和(h)所示，与对照组(58.80gprot/L)相比，经DNA/DMY‑CuO处理后E.coli菌液的ATP含量显著降低至36.92gprot/L；同样，经DNA/DMY‑CuO处理后S.aureus菌液的ATP含量为27.42gprot/L，显著低于对照组(70.36gprot/L)。这表明DNA/DMY‑CuO能不可逆破坏ATP合成路径，减少ATP的产生，导致细菌系统能量代谢紊乱而死亡。

[0104] 图9为DNA/DMY‑CuO被限制性内切酶触发并释放CuO NPs损坏DNA和ATP的抗菌机理图，具体是基于以上抑菌机理分析，推断出图9所示DNA/DMY‑CuO对细菌的抑菌机理图。

[0105] 由以上实施例和测试例可知，本发明以鱼精DNA为母体、DMY为修饰剂制备刺激响应型DNA/DMY‑CuO，其表现出优异的分散性、亲水性和生物降解性，可作为靶向抑菌治疗。与传统的载药系统不同，DNA/DMY‑CuO的设计不需要复杂的合成步骤和附加化学交联剂。DNA/DMY‑CuO的交联机制由DMY与DNA上碱基和磷酸主链形成共价键实现，并由CuO NPs提供自组装动力。其中，DMY不仅充当DNA网络的支柱与桥梁，还起到雷达作用以高效识别E.coli和S.aureus。DMY因其结构特性能在中性介质中降解，充当DNA/DMY‑CuO释放药物的导火线。作为深入细菌内部的“载药炸弹”，DNA/DMY‑CuO可被限制性内切酶触发并释放CuO NPs，导致细菌渗透压失衡、能量代谢阻断和生长分裂停止。因此，本发明提供的DNA/DMY‑CuO特异性识别细菌有效避免了药物副作用的出现，而且多种杀菌途径的结合进一步阻止了细菌产生耐药性。因此，该靶向触发型纳米递送系统在当代治疗耐药性细菌等生物医学领域应用广泛。

[0106] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。