一种高效脱氮的反硝化细菌及其应用

摘要

本发明涉及环境微生物及污水处理技术领域，公开了一种高效脱氮的反硝化细菌及其应用。本发明从污水中分离出一株在缺氧、好氧条件下均可高效脱氮的反硝化细菌，其繁殖能力强、反硝化活性高，具有高耐受硝态氮和亚硝态氮的能力，提高了脱氮效率，利用本发明所述的微生物菌株制备的脱氮菌剂，可应用于污水处理系统、水产养殖水体、自然水体等，同时适应于缺氧条件和好氧条件，应用前景广阔。

权利要求

1.一种高效脱氮的反硝化细菌，其特征在于，其为卓贝尔氏菌（Zobellella denitrificans）LBSW21‑01，保藏编号为CGMCC No.22730。

2.保藏编号为CGMCC No.22730的卓贝尔氏菌LBSW21‑01在水体脱氮处理和制备水体脱氮的微生物菌剂中的应用。

3.一种污水脱氮的微生物菌剂，其特征在于，包括保藏编号为CGMCC No.22730的卓贝尔氏菌LBSW21‑01。

4.根据权利要求3所述微生物菌剂，其特征在于，其为液体菌剂或固体菌剂，液体菌剂

9 10 10 11

菌体数量为2×10‑4×10 cfu/mL，固体菌剂菌体数量为3×10 ‑2×10 cfu/g。

5.一种水体脱氮的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，保藏编号为CGMCC No.22730的卓贝尔氏菌LBSW21‑01接种至反硝化液体培养基中活化，然后更换反硝化液体培养基制备种子液，将种子液接种至发酵培养基中发酵获得液体微生物菌剂。

6.根据权利要求5所述制备方法，其特征在于，还包括将所制备液体微生物菌剂添加甘油、硅藻土和淀粉制备成固体微生物菌剂。

7.根据权利要求5所述制备方法，其特征在于，所述发酵培养基包括玉米浆干粉、柠檬酸钠、硝酸钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和微量元素。

8.一种水体脱氮处理方法，其特征在于，将保藏编号为CGMCC No.22730的卓贝尔氏菌LBSW21‑01或由其制备的微生物菌剂投入到预处理水体中驯化，然后在好氧或缺氧的条件下进行脱氮处理。

9.根据权利要求8所述处理方法，其特征在于，在脱氮处理过程中以柠檬酸钠和/或丁二酸钠为碳源进行碳源补充，维持C/N比不低于4。

说明书

一种高效脱氮的反硝化细菌及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及环境微生物及水体处理技术领域，更具体的说是涉及一种高效脱氮的反硝化细菌及其应用。

背景技术

[0002] 随着人类生产生活的快速发展，高氮污染已成为全世界高度关注的重大问题，总氮排放量已经远远超出受纳水体的环境容量，总氮超标导致水体富营养化，诱发藻类异常增殖、导致水质恶化。因此，如何削减水库水体氮素污染成为水环境领域的热点问题。

[0003] 近几年，我国污水年排放量持续增加，2015年污水年排放量仅466.62亿立方米，2018年突破500亿立方米，2019年增至554.65亿立方米，同比增长6.4％，污水处理厂作为污水处理的重要环节，是去除废水有机物、氮素的重要场所，而硝酸盐(硝态氮)是污水处理厂尾水中氮的主要形式，深度脱氮迫在眉睫。

[0004] 生物脱氮是一种高效、经济、环保的脱氮方法，在水体修复和污水处理过程中经常利用反硝化细菌进行硝酸盐的脱除。众多研究表明反硝化细菌需要在缺氧条件下(溶解氧0.2mg/L～0.5mg/L)才能够达到较优异的脱氮效果，近几年有研究发现部分反硝化细菌可在好氧条件下进行反硝化作用，但是脱氮效果却不理想，耐受浓度明显较低，处理效率慢，如专利201910234181.7(申请日2019.03.26)公布的一株卓贝尔氏菌，其在好氧条件下能去除水体中的硝酸盐和亚硝酸，但是耐受浓度较低(<200mg/L)，且处理速度较慢，48h才能将低浓度的硝酸盐和亚硝酸盐脱除，这表明好氧条件下，具有高效反硝化作用的菌剂还未被发现；同时，好氧反硝化细菌的发现，为实现同步硝化反硝化提供了可能，硝化过程和反硝化过程可在好氧池内同时进行，节约了整个反应过程的时间、运行费用、碳源使用量、碱液投加量等，同时减少了缺氧池的基建费用，较传统的脱氮工艺具有明显的优势。

[0005] 此外，亚硝态氮对于微生物来说是一种毒性物质，高浓度的亚硝态氮对反硝化细菌的生长和反应起到抑制作用，现有的反硝化细菌均未有高耐受亚硝态氮的作用，从而导致了在脱除高浓度亚硝态氮时效率较差。

[0006] 因此，从自然中筛选出提高耐受(亚)硝态氮水平、脱氮(硝态氮+亚硝态氮+总氮)效率更高，同时可在缺氧和好氧条件下脱氮的微生物菌株以适用不同条件处理体系成为研究的重点之一。

发明内容

[0007] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种高效脱氮的反硝化细菌，使得所述反硝化细菌不仅具有更高的硝态氮和亚硝态氮的耐受性，且可以同时在好氧和缺氧条件下高效脱氮；

[0008] 本发明的另外一个目的在于提供上述反硝化细菌在水体处理以及微生物菌剂等相关领域的应用。

[0009] 为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

[0010] 一种高效脱氮的反硝化细菌，其为卓贝尔氏菌(Zobellella denitrificans)LBSW21‑01，保藏编号为CGMCC No.22730。

[0011] 经过长期研究，本发明从污水中筛选得到一株在缺氧、好氧条件下都可高效脱氮的微生物菌株，将该菌株命名为LBSW21‑01，其繁殖快、活性强，经试验发现该菌株可应用于多种污水处理系统、自然水体和养殖水体，可有效脱除水中的硝态氮、亚硝态氮和总氮。

[0012] 菌株LBSW21‑01，对其进行了16SrDNA测序，其核苷酸序列如Seq ID No:1所示，该序列为菌株的16S rDNA的全序列，所测得的16SrDNA序列进行BLAST比对。该菌株的形态特征如下，菌落乳白色，边缘整齐，湿润状态，缺氧、好氧条件都可快速生长。经鉴定，在分子水平上确定为卓贝尔氏菌(Zobellella denitrificans)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏编号为CGMCC No.22730。

[0013] 本发明分离获得的卓贝尔氏菌LBSW21‑01，该菌株分别接种至以硝态氮、亚硝态氮为唯一氮源的培养基中，30℃静置培养，分别在0h、24h时，取出培养液2mL，离心，测定上清液中硝态氮、亚硝态氮和氨氮，结果显示卓贝尔氏菌LBSW21‑01分别对水体中硝酸钾、亚硝‑酸钠均有快速高效的去除效果。在以硝态氮为唯一氮源培养基中，该菌株培养24h后对NO3‑N及总氮的脱除率为100％，其中硝态氮的最高耐受浓度高达1500mg/L；在以亚硝态氮为唯‑
一氮源培养基中，该菌株培养24h后对NO2‑N及总氮的脱除率为100％，其中亚硝态氮的最高耐受浓度高达600mg/L。

[0014] 同时，本发明卓贝尔氏菌LBSW21‑01在低温15℃仍然能够进行反硝化作用脱氮；在好氧和缺氧条件下，卓贝尔氏菌LBSW21‑01在16h均可以高效完成脱氮。

[0015] 鉴于上述卓贝尔氏菌LBSW21‑01的优异效果，本发明提供了该菌在水体脱氮处理和制备水体脱氮的微生物菌剂中的应用，所述水体包括但不限于各种需要脱氮的污水、自然水体和养殖水体。

[0016] 本发明还提供了一种水体脱氮的微生物菌剂的制备方法，保藏编号为CGMCC No.22730的卓贝尔氏菌LBSW21‑01接种至反硝化液体培养基中活化，然后更换反硝化液体培养基制备种子液，将种子液接种至发酵培养基中发酵获得液体微生物菌剂。

[0017] 其中，所述反硝化液体培养基包括KNO3、柠檬酸钠、NaHPO4、MgSO4·7H2O、K2HPO4、微量元素和水，所述微量元素包括EDTA、ZnSO4、CaCl2、MnSO4、FeSO4、Na6MoO2、CuSO4和CoCl2。

[0018] 优选地，反硝化液体培养基配方为：KNO3 0.1‑1.2％，柠檬酸钠0.15‑2.0％，NaHPO4 0.05‑0.2％，MgSO4·7H2O 0.002‑0.005％，K2HPO4 0.05‑0.2％，蒸馏水余量，pH 7.0‑7.4，微量元素2‑4ml/L，121℃灭菌20min。所述微量元素配方为：EDTA 2‑8％、ZnSO4 0.1‑0.3％、CaCl2 0.3‑1.0％、MnSO4 0.2‑1.0％、FeSO4 0.2‑1.0％、Na6MoO2 0.05‑0.2％、CuSO4 0.1‑
0.2％、CoCl2 0.1‑0.2％，定容于100ml的容量瓶中，现配现用。

[0019] 作为优选，所述发酵培养基包括玉米浆干粉、柠檬酸钠、硝酸钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和微量元素。更优选地，包括玉米浆干粉0.5‑1％，柠檬酸钠0.5‑1.2％，硝酸钾0.2‑0.6％，磷酸二氢钾0.1‑0.3％，磷酸氢二钠0.05‑0.2％，微量元素(同上记载)2‑4ml/L，pH 
7.0‑7.4，121℃灭菌20min。

[0020] 作为优选，所述发酵可分为种子发酵罐发酵和发酵罐发酵两步，两者区别在于发酵规格不同，可根据实际需要选择使用。在本发明具体实施方式中，所述液体微生物菌剂制备过程如下：

[0021] (1)菌种活化：取1‑5uL冻存的卓贝尔氏菌接种于含有5mL反硝化液体培养基中，置于28‑37℃培养箱静置培养8‑20h；

[0022] (2)液体种子制备：将上述活化的菌种转接至200mL反硝化液体培养基中，置于28‑37℃培养箱静置培养8‑20h；

[0023] (3)种子发酵罐：将上述制备好的液体种子按照5％‑10％v/v的接种量接入装液量为60‑70％的30L种子罐中扩大培养，搅拌速度为50‑140rpm，培养温度为28‑37℃，发酵罐压0.01‑0.2MPa，发酵周期为6‑20h；

[0024] (4)发酵罐发酵：将上述获得的种子发酵罐菌液按照5％‑10％v/v的接种量接入装液量为60‑70％的300L发酵罐的培养基中培养，培养基及培养条件与种子罐发酵相同；发酵9 10
结束后菌体数量达到2×10‑4×10 cfu/mL，将发酵完成后培养液出罐后即得液体菌剂。

[0025] 此外，本发明在制备液体微生物菌剂基础上还可以添加甘油、硅藻土和淀粉制备成固体微生物菌剂；将上述发酵完成后的液体菌剂按照1‰‑1％v/v加入甘油，按照质量比添加2‑4％的硅藻土、1‑3％的玉米淀粉吸附处理液体菌剂发酵液后，对液体菌剂发酵液进行离心、分离得到固体菌体，进行干化处理后获得菌粉，菌粉的含水率控制在10％以下，经10 11
检测有效活菌数为3×10 ‑2×10 cfu/g。

[0026] 根据应用，本发明还提供了一种水体脱氮处理方法，将保藏编号为CGMCC No.22730的卓贝尔氏菌LBSW21‑01或由其制备的微生物菌剂投入到预处理水体中驯化，然后在好氧和/缺氧的条件下进行脱氮处理。液体微生物菌剂参考使用量为为0.5％‑1％；固体微生物菌剂参考使用量为0.5‰‑1‰。应用上述卓贝尔氏菌或由其制备的微生物菌剂进行缺氧/好氧反硝化脱氮时，调节水体溶氧为0.1‑5mg/L(溶解氧0.2～0.5mg/L为缺氧条件)，pH为6.5‑8.0，温度控制在15℃‑35℃。

[0027] 在水体脱氮时，需要监测水体碳源消耗情况，本发明所述卓贝尔氏菌能够保证在C/N比达到4时即可达到目前规定的脱氮效果，而当C/N比达到6时即可100％脱除。同时，对比甘油、丁二酸钠、超级碳、酒精、葡萄糖、柠檬酸钠等不同碳源对于反硝化作用的影响发现，柠檬酸钠和丁二酸钠相比其他碳源有更好的促进作用。因此，在脱氮处理过程中以柠檬酸钠和/或丁二酸钠为碳源进行碳源补充，维持C/N比不低于4。

[0028] 由以上技术方案可知，本发明从污水中分离出一株在缺氧、好氧条件下均可高效脱氮的反硝化细菌，其繁殖能力强、反硝化活性高，具有高耐受硝态氮和亚硝态氮的能力，利用本发明所述的微生物菌株制备的脱氮菌剂，可应用于污水处理系统、水产养殖水体、自然水体等，同时适应于缺氧条件和好氧条件，应用前景广阔。

[0029] 生物保藏说明

[0030] LBSW21‑01，分类命名：Zobellella denitrificans，于2021年6月17日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.22730。

附图说明

[0031] 图1为本发明所述的固体培养基上的卓贝尔氏菌；

[0032] 图2为本发明所述卓贝尔氏菌在不同碳源下的反硝化效果影响示意图；纵坐标为氮的浓度mg/L；

[0033] 图3为本发明所述卓贝尔氏菌在不同碳源比对反硝化效果影响示意图；纵坐标为氮的浓度mg/L；

[0034] 图4为本发明所述卓贝尔氏菌对不同浓度亚硝态氮的耐受程度示意图；纵坐标为‑氮的浓度mg/L；图例200、400、600表示NO2‑N浓度，单位mg/L；

[0035] 图5本发明所述卓贝尔氏菌对不同浓度硝态氮的耐受程度示意图；纵坐标为氮的‑浓度mg/L；图例系列1‑7依次表示NO3‑N浓度分别为200、400、600、800、1200、1500、1800mg/L；

[0036] 图6为本发明所述卓贝尔氏菌15℃时反硝化脱氮效果示意图；

[0037] 图7为本发明所述卓贝尔氏菌在好氧条件下反硝化效果示意图；

[0038] 图8为本发明所述卓贝尔氏菌在缺氧条件下反硝化效果示意图。

具体实施方式

[0039] 本发明公开了一种高效脱氮的反硝化细菌及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述反硝化细菌及其应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述反硝化细菌及其应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

[0040] 在水体脱氮过程中，投加固体菌剂前可加入相应的营养盐进行活化，可促进卓贝尔氏菌快速生长繁殖；营养盐包括：NaHPO4，MgSO4·7H2O，K2HPO4，CaCl2，MnSO4和FeSO4；

[0041] 具体的活化方法为：固体菌剂按用量接种于营养盐液体中，其中固体菌剂按照1‑5‰固体菌剂的接种量进行接种，活化条件为溶氧0.1‑5mg/L，pH7.0‑7.5，温度28℃‑35℃，活化6h‑8h；

[0042] 活化过程中营养盐溶液组成如下：NaHPO4 0.05‑0.2％，MgSO4·7H2O 0.002‑0.005％，K2HPO4 0.05‑0.2％，CaCl2 0.3‑1.0％、MnSO4 0.2‑1.0％、FeSO4 0.2‑1.0％。

[0043] 更优选的，首次投加菌剂后，每隔7‑10d补加一次菌剂，补加量与首次投加量相同，连续投加3次效果更佳。使用本发明所述反硝化菌剂能快速适应水体环境，使系统稳定运行。

[0044] 此外，本发明中提到的总氮，是指硝态氮、亚硝态氮和氨氮之和。

[0045] 下面结合实施例，进一步阐述本发明。

[0046] 实施例1：菌株筛选过程

[0047] (1)菌种驯化：从山东省滨州市博兴县某污水处理厂中取缺氧池污泥置于反硝化液体培养基中，设置初始硝态氮浓度为100mg/L，35℃静置培养，每24h取样检测硝态氮、氨氮、亚硝态氮，当三氮之和低于20mg/L时，继续补加KNO3来逐步提高硝态氮浓度200、300、400、500、600mg/L，以此来逐步驯化提高其降解能力和耐受性；

[0048] (2)菌种分离、纯化：采用双层平板法进行菌种分离。将反硝化固体培养基(液体培养基的基础上添加1.5‑2％琼脂和1％溴百里酚蓝的酒精溶液)倒置固体平板，待冷却后，按‑1 ‑2 ‑7照梯度稀释10 、10 ……10 进行涂布平板，之后用冷却至40℃左右的1.5％灭菌琼脂在其上方倒置薄薄的一层，将涂布的菌种覆盖，起到隔绝氧气的作用，放置于35℃恒温培养箱中培养，待长出菌落后，挑选培养基变蓝处菌落，进行划线纯化，得到反硝化菌种，如图1。

[0049] 实施例2：制备微生物菌剂

[0050] (1)菌种活化：取1‑5uL冻存的卓贝尔氏菌接种于含有5mL反硝化液体无菌培养基中，置于28‑37℃培养箱静置培养8‑20h；

[0051] 反硝化液体培养基配方为：KNO3 0.1％，柠檬酸钠0.15％，NaHPO4 0.1％，MgSO4·7H2O 0.005％，K2HPO4 0.1％，蒸馏水余量，pH 7.0‑7.4，微量元素2ml/L，121℃灭菌20min。

[0052] 微量元素配方为：EDTA 5％、ZnSO4 0.2％、CaCl2 0.5％、MnSO4 0.3％、FeSO4 0.4％、Na6MoO2 0.1％、CuSO4 0.15％、CoCl2 0.15％，定容于100ml的容量瓶中，现配现用。

[0053] (2)液体种子制备：将上述活化的菌种转接至200mL反硝化液体培养基中，置于28‑37℃培养箱静置培养8‑20h；

[0054] (3)种子发酵罐：将上述制备好的液体种子按照10％v/v的接种量接入装液量为60％的30L种子罐中扩大培养，搅拌速度为50‑140rpm，培养温度为28‑37℃，发酵罐亚
0.05MPa发酵周期为12h；

[0055] 种子罐中培养基配方为：玉米浆干粉0.7％，柠檬酸钠0.1％，硝酸钾0.4％，磷酸二氢钾0.2％，磷酸氢二钠0.1％，微量元素2ml/L，pH7.0‑7.4，121℃灭菌20min。

[0056] (4)发酵罐发酵：将上述获得的种子液按照5％‑10％v/v的接种量接入装液量为60‑70％的300L发酵罐的培养基中培养，培养基及培养条件与种子罐发酵相同；发酵结束后
10
菌体数量达到2*10 cfu/mL，将发酵完成后培养液出罐后即得液体菌剂；

[0057] 制备获得上述的液体菌剂后，在其基础上还可以获得菌体菌剂，其制备方法如下：

[0058] (5)固体菌剂制备：发酵结束后，将上述发酵完成后的菌液按照1‰‑1％v/v加入甘油，按照质量比添加2‑4％的硅藻土、1‑3％的玉米淀粉吸附处理发酵液后，对发酵液进行离心、分离得到固体菌体，进行干化处理后获得菌粉，菌粉的含水率控制在10％以下，经检测10
有效活菌数为7*10 cfu/g。

[0059] 实施例3：反硝化作用的研究

[0060] 1、不同碳源对反硝化卓贝尔氏菌剂的反硝化影响

[0061] 验证用培养基为KNO3 3.16g(NO3‑‑N约为300mg/L)，KH2PO4 1g，碳源(设置碳氮比为8:1)，微量元素2ml，蒸馏水1000ml，pH7.0，0.1％溴百里酚蓝指示剂1ml，121℃灭菌20nin为基础，其中分别以甘油、丁二酸钠、超级碳、酒精、葡萄糖、柠檬酸钠作为唯一碳源，进行反硝化效果验证，30℃静置培养24h，结果表明使用反硝化液体培养基培养的卓贝尔氏菌以酒精和葡萄糖为唯一碳源时，处理效果不好，总氮去除率为0，以甘油和超级碳为唯一碳源时处理效果一般，总氮去除率仅为50％左右，且出现亚硝态氮积累，以柠檬酸钠和丁二酸钠为碳源时，总氮去除率可达到100％，且无亚硝态氮生成，具体可参考附图2；上述结果表明，在水体脱氮过程中，能够在24h实现高效脱氮的碳源为柠檬酸钠和丁二酸钠。

[0062] 2、不同碳氮比对卓贝尔氏菌的反硝化影响

[0063] 以验证培养基KNO3 2.16g(NO3‑‑N约为300mg/L)，KH2PO4 1g，柠檬酸钠(碳源)，微量元素2ml，蒸馏水1000ml，pH7.0，0.1％溴百里酚蓝指示剂1ml，121℃灭菌20nin为基础，其中以调节柠檬酸钠的含量，使C/N比为2、4、6、8、10、12、14，将反硝化液体培养基培养好的卓贝尔氏菌按照1％的接种量接种于上述培养基中，30℃静置培养24h，取样，8000rpm离心5min，取上清测定培养前后培养液中总氮的含量，结果表明，随着C/N的提高，反硝化细菌的反硝化作用逐渐增强，当C/N大于6时，总氮的去除率基本可到达100％，具体可参考附图3[0064] 3、不同浓度亚硝态氮对卓贝尔氏菌的反硝化影响

[0065] 以验证培养基NaNO2 0.99g(NO2‑‑N 200mg/L)，柠檬酸钠1.62g，KH2PO4 1g，微量元素2ml，蒸馏水1000ml，pH 7.0，121℃灭菌20nin为基础，其中以调节NaNO2和柠檬酸钠的含‑量使NO2 ‑N分别为200、400、600mg/L，C/N为6，将反硝化液体培养基培养好的卓贝尔氏菌按照1％的接种量接种于上述培养基中，30℃静置培养48h，取样，8000rpm离心5min，取上清测定培养前后培养液中总氮的含量，结果表明，随着亚硝态氮的浓度提高，总氮脱除率达到‑ ‑
100％时所需降解时间增加，NO2‑N 200mg/L时24h总氮脱除率可达100％，NO2‑N 400mg/L时48h总氮脱除率可达100％，且其可耐受600mg/L的浓度，但其降解速率受到影响(见图4)，超过600mg/L的浓度则会受到亚硝态氮的毒性影响，降解总氮速率明显降低。

[0066] 4、不同浓度硝态氮对卓贝尔氏菌的反硝化影响

[0067] 不同浓度硝态氮对卓贝尔氏菌的反硝化影响：以验证培养基KNO3 1.443g(NO3‑‑N 200mg/L)，柠檬酸钠1.62g，KH2PO41g，微量元素2ml，蒸馏水1000ml，pH 7.0，121℃灭菌20nin‑
为基础，其中以调节KNO3和柠檬酸钠的含量使NO3‑N分别为200、400、600、800、1200、1500、
1800mg/L，C/N为6，将反硝化液体培养基培养好的卓贝尔氏菌按照1％的接种量接种于上述培养基中，30℃静置培养，每个24h取样，8000rpm离心5min，取上清测定培养前后培养液中总氮的含量，结果表明，随着硝态氮的浓度提高，总氮脱除率达到100％时所需降解时间增‑ ‑
加，NO3‑N 800mg/L时24h总氮脱除率可达100％，NO3‑N 1200mg/L时48h总氮脱除率可达‑
100％，NO3‑N 1500mg/L时总氮降解速率明显降低，但仍有继续下降的趋势，说明其可耐受
1500mg/L的硝态氮浓度，但其降解速率受到影响，具体可参考附图5。

[0068] 5、低温对反硝化菌的反硝化影响

[0069] 培养基KNO3 4.32g(NO3‑‑N约为600mg/L)，KH2PO4 1g，柠檬酸钠6.55g，微量元素2ml，蒸馏水1000ml，pH7.0，121℃灭菌20nin。将反硝化液体培养基培养好的卓贝尔氏菌按照1％的接种量接种于上述培养基中，15℃静置培养48h，取样，8000rpm离心5min，取上清测定培养前后培养液中总氮的含量，结果表明，低温15℃卓贝尔氏菌仍然可进行反硝化作用，反硝化速率受到一定限制(图6)。

[0070] 6、好氧/缺氧条件下反硝化细节菌的反硝化效果研究

[0071] 培养基KNO3 4.32g(NO3‑‑N约为600mg/L)，KH2PO4 1g，柠檬酸钠6.55g，微量元素2ml，蒸馏水1000ml，pH7.0，121℃灭菌20nin。将反硝化液体培养基培养好的卓贝尔氏菌按照1％的接种量接种于上述培养基中，分别置于30℃170r/min培养24h(好氧)和30℃静置培养24h(缺氧)，取样，8000rpm离心5min，取上清测定培养前后培养液中总氮的含量，结果表明，好氧条件下反硝化细菌脱氮效率略低于缺氧条件时，16h脱除率86.88％，主要是好氧条件下有少量亚硝态氮积累，而缺氧条件下无亚硝态氮积累，16h脱除率100％(图7和图8)。

[0072] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。