用于检测猪肺炎支原体的引物组及其应用、实时荧光定量PCR检测方法

摘要

本发明提供了一种用于检测猪肺炎支原体的引物组及其应用、实时荧光定量PCR检测方法，涉及生物技术领域。本发明提供的用于检测猪肺炎支原体的引物组，包括第一引物对和探针，具有特异性强、灵敏度高的特点，能够用于猪肺炎支原体的检测。本发明提供的猪肺炎支原体的实时荧光定量PCR检测方法，采用以上引物组，首先对已知起始拷贝数的猪肺炎支原体标准品进行实时荧光定量PCR，获得拷贝数与Ct值的关系；然后提取待测样品的DNA进行实时荧光定量PCR，计算得到待测样品中目的基因拷贝数，本发明的检测方法特异性高、重复性好、灵敏度高、检测快速、定量准确，对于猪肺炎支原体培养物和疫苗半成品等的快速定量检测具有重大的意义。

权利要求

1.一种用于检测猪肺炎支原体的引物组，其特征在于，所述引物组包括第一引物对和探针；

所述第一引物对具有如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；

所述探针包括如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的用于检测猪肺炎支原体的引物组，其特征在于，所述探针的5’端和3’端分别含有荧光报告基团和荧光淬灭基团。

3.根据权利要求2所述的用于检测猪肺炎支原体的引物组，其特征在于，所述荧光报告基团包括FAM、CY5或HEX。

4.根据权利要求3所述的用于检测猪肺炎支原体的引物组，其特征在于，所述荧光报告基团为FAM。

5.根据权利要求2所述的用于检测猪肺炎支原体的引物组，其特征在于，所述荧光淬灭基团包括TAMRA、BHQ1或BHQ2。

6.根据权利要求5所述的用于检测猪肺炎支原体的引物组，其特征在于，所述荧光淬灭基团为TAMRA。

7.权利要求1‑6任一项所述的引物组在制备猪肺炎支原体检测产品中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述产品的检测方法包括以下步骤：对已知起始拷贝数的猪肺炎支原体标准品进行实时荧光定量PCR，获得拷贝数与Ct值的关系；提取待测样品的DNA进行实时荧光定量PCR，计算待测样品中目的基因拷贝数；

所述实时荧光定量PCR采用权利要求1‑6任一项所述的引物组。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述猪肺炎支原体标准品包括质粒。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述质粒包括猪肺炎支原体被第一引物对所扩增的序列。

11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述质粒包括猪肺炎支原体被第二引物对所扩增的序列；

所述第二引物对具有如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列。

12.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述实时荧光定量PCR的反应体系中第一引物对浓度为0.1 1.0μmol/L，探针浓度为0.1 1.0μmol/L。

~ ~

13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述实时荧光定量PCR的反应体系中第一引物对浓度为0.4μmol/L、探针浓度为0.3μmol/L。

14.根据权利要求8‑13任一项所述的应用，其特征在于，所述实时荧光定量PCR的反应条件为：预变性：93‑95℃，1‑3min，1个循环；变性：93‑95℃，8‑15s，退火：55‑65℃，25‑35s，

40个循环。

15.根据权利要求14所述的应用，其特征在于，所述实时荧光定量PCR的反应条件为：预变性：94℃，2min，1个循环；变性：94℃，10s，退火：60℃，30s，40个循环。

说明书

用于检测猪肺炎支原体的引物组及其应用、实时荧光定量PCR

检测方法

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种用于检测猪肺炎支原体的引物组及其应用、实时荧光定量PCR检测方法。

背景技术

[0002] 猪支原体肺炎又称猪地方性流行肺炎(Swine enzootic hyopneumoniae)，俗称猪喘气病，是由猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)引起的一种慢性、接触性、呼吸道传染病。主要临诊症状是咳嗽和气喘，常有其他病菌(如多杀性巴氏杆菌、副猪嗜血杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌等)继发感染。此病广泛分布于世界各地，在我国许多地区的猪场都有发生。由于带菌病猪的存在，通常会引起猪群生产性能显著下降，受感染猪群日增重下降，饲料报酬降低，上市时间延迟，猪群生长均匀度较差，药物治疗成本增加，因而给猪场造成较为严重的经济损失。

[0003] 由于猪肺炎支原体很小而产量又少，所以常用的定量估计菌体的方法(如浊度、细胞容积和干重)不适用于猪肺炎支原体的定量检测。现有的猪肺炎支原体定量方法主要是CCU检测法，该方法费时费力，常引起鉴定、计数失误，实验过程中容易污染，而且结果具有波动性。

[0004] 有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

[0005] 本发明的第一目的在于提供一种用于检测猪肺炎支原体的引物组，该引物组特异性强，能够实现对猪肺炎支原体的检测。

[0006] 本发明的第二目的在于提供一种引物组在猪肺炎支原体检测中的应用。

[0007] 本发明的第三目的在于提供一种猪肺炎支原体的实时荧光定量PCR检测方法，已解决上述问题中的至少一种。

[0008] 第一方面，本发明提供了一种用于检测猪肺炎支原体的引物组，所述引物组包括第一引物对和探针；

[0009] 所述第一引物对具有如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；

[0010] 所述探针包括如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

[0011] 作为进一步技术方案，所述探针的5’端和3’端分别含有荧光报告基团和荧光淬灭基团。

[0012] 作为进一步技术方案，所述荧光报告基团包括FAM、CY5或HEX，优选为FAM。

[0013] 作为进一步技术方案，所述荧光淬灭基团包括TAMRA、BHQ1或BHQ2，优选为TAMRA。

[0014] 第二方面，本发明提供了一种引物组在猪肺炎支原体检测中的应用。

[0015] 第三方面，本发明提供了一种猪肺炎支原体的实时荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤：对已知起始拷贝数的猪肺炎支原体标准品进行实时荧光定量PCR，获得拷贝数与Ct值的关系；提取待测样品的DNA进行实时荧光定量PCR，计算待测样品中目的基因拷贝数；

[0016] 所述实时荧光定量PCR采用上述引物组。

[0017] 作为进一步技术方案，所述猪肺炎支原体标准品包括质粒。

[0018] 作为进一步技术方案，所述质粒包括猪肺炎支原体被第一引物对所扩增的序列；

[0019] 优选地，所述质粒包括猪肺炎支原体被第二引物对所扩增的序列；

[0020] 所述第二引物对具有如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列。

[0021] 作为进一步技术方案，所述实时荧光定量PCR的反应体系中第一引物对浓度为0.1～1.0μmol/L，探针浓度为0.1～1.0μmol/L；

[0022] 优选地，所述实时荧光定量PCR的反应体系中第一引物对浓度为0.4μmol/L、探针浓度为0.3μmol/L。

[0023] 作为进一步技术方案，所述实时荧光定量PCR的反应条件为：预变性：93‑95℃，1‑3min，1个循环；变性：93‑95℃，8‑15s，退火：55‑65℃，25‑35s，40个循环；

[0024] 优选地，所述实时荧光定量PCR的反应条件为：预变性：94℃，2min，1个循环；变性：94℃，10s，退火：60℃，30s，40个循环。

[0025] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

[0026] 本发明提供的用于检测猪肺炎支原体的引物组，包括第一引物对和探针，具有特异性强、灵敏度高的特点，能够用于猪肺炎支原体的检测。

[0027] 本发明提供的猪肺炎支原体的实时荧光定量PCR检测方法，采用以上引物组，首先对已知起始拷贝数的猪肺炎支原体标准品进行实时荧光定量PCR，获得拷贝数与Ct值的关系；然后提取待测样品的DNA进行实时荧光定量PCR，计算得到待测样品中目的基因拷贝数，本发明的检测方法特异性高、重复性好、灵敏度高、检测快速、定量准确，对于猪肺炎支原体培养物和疫苗半成品等的快速定量检测具有重大的意义。

附图说明

[0028] 为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

[0029] 图1为本发明提供的猪肺炎支原体基因组PCR扩增结果示意图；M：Marker；‑：阴性对照；Mhp：猪肺炎支原体菌液；

[0030] 图2为本发明提供的猪肺炎支原体重组质粒酶切鉴定结果示意图；M：Marker；‑：阴性对照；Mhp：猪肺炎支原体重组质粒；

[0031] 图3为本发明提供的猪肺炎支原体重组质粒PCR鉴定结果示意图；M：Marker；‑：阴性对照；Mhp：猪肺炎支原体重组质粒；

[0032] 图4为本发明提供的猪肺炎支原体荧光定量PCR标准质粒的扩增曲线示意图；

[0033] 图5为本发明提供的猪肺炎支原体荧光定量PCR标准质粒的标准曲线示意图。

具体实施方式

[0034] 下面将结合实施方式和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施方式和实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

[0035] 第一方面，本发明提供了一种用于检测猪肺炎支原体的引物组，所述引物组包括第一引物对和探针；

[0036] 所述第一引物对具有如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；

[0037] 所述探针包括如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

[0038] 本发明提供的用于检测猪肺炎支原体的第一引物对和探针，是针对具有特异性且是细菌分类鉴定主要靶基因的16S rRNA基因属内高度保守区域作为扩增区域设计的，具有特异性强、灵敏度高的特点，能够用于猪肺炎支原体的检测。

[0039] 在一些优选的实施方式中，所述探针的5’端和3’端分别含有荧光报告基团和荧光淬灭基团。本实施方式不限定具体的探针含有的荧光报告基团及荧光淬灭基团的种类，能够与探针连接并起到相应表征作用的基团均可。

[0040] 在一些优选的实施方式中，所述荧光报告基团包括FAM、CY5或HEX，优选为FAM。

[0041] 在一些优选的实施方式中，所述荧光淬灭基团包括TAMRA、BHQ1或BHQ2，优选为TAMRA。

[0042] 第二方面，本发明提供了一种引物组在猪肺炎支原体检测中的应用。

[0043] 本发明提供的用于检测猪肺炎支原体的引物组，具有特异性强、灵敏度高的特点，能够用于猪肺炎支原体的检测。

[0044] 第三方面，本发明提供了一种猪肺炎支原体的实时荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤：对已知起始拷贝数的猪肺炎支原体标准品进行实时荧光定量PCR，获得拷贝数与Ct值的关系；提取待测样品的DNA进行实时荧光定量PCR，计算待测样品中目的基因拷贝数；

[0045] 所述实时荧光定量PCR采用上述引物组。

[0046] 本发明提供的猪肺炎支原体的实时荧光定量PCR检测方法，特异性高、重复性好、灵敏度高、检测快速、定量准确，对于猪肺炎支原体培养物和疫苗半成品等的快速定量检测具有重大的意义。

[0047] 在一些优选的实施方式中，所述猪肺炎支原体标准品包括但不限于质粒。

[0048] 在一些优选的实施方式中，所述质粒包括猪肺炎支原体被第一引物对所扩增的序列，能够被第一引物组所扩增。

[0049] 优选地，所述质粒包括猪肺炎支原体被第二引物对所扩增的序列。在猪肺炎支原体基因组中，第一引物对的扩增产物位于第二引物对扩增的序列内，同样能够被第一引物组所扩增。

[0050] 所述第二引物对具有如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列。

[0051] 在一些优选的实施方式中，所述实时荧光定量PCR的反应体系中第一引物对浓度为0.1～1.0μmol/L，探针浓度为0.1～1.0μmol/L；

[0052] 优选地，所述实时荧光定量PCR的反应体系中第一引物对浓度为0.4μmol/L、探针浓度为0.3μmol/L。

[0053] 在本发明中，通过对实时荧光定量PCR的反应体系中第一引物对和探针浓度进行进一步优化和调整，更有利于PCR反应的进行。

[0054] 在一些优选的实施方式中，所述实时荧光定量PCR的反应条件为：预变性：93‑95℃，1‑3min，1个循环；变性：93‑95℃，8‑15s，退火：55‑65℃，25‑35s，40个循环；

[0055] 优选地，所述实时荧光定量PCR的反应条件为：预变性：94℃，2min，1个循环；变性：94℃，10s，退火：60℃，30s，40个循环。

[0056] 通过对实时荧光定量PCR的反应条件的进一步优化和调整，有利于PCR反应的进行，缩短检测周期。

[0057] 下面通过具体的实施例和对比例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

[0058] 实施例1

[0059] 1引物和探针设计与合成

[0060] 针对具有特异性且是细菌分类鉴定主要靶基因的16S rRNA基因属内高度保守区域作为扩增区域，设计了Real Time PCR第一引物对realtime F/R，以及构建标准质粒的第二引物对clone F/R，所述引物和探针的序列为：

[0061] realtime F：5’‑AACTGGTCATATATTGACACTAAGGG‑3’(SEQ ID NO.1)；

[0062] realtime R：5’‑TGTGTTAGTGACTTTTGCCACCAACT‑3’(SEQ ID NO.2)。

[0063] 探针：5’‑CAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCAC‑3’(SEQ ID NO.3)；

[0064] clone F：5’‑GAGCCTTCAAGCTTCACCAAGA‑3’(SEQ ID NO.4)；

[0065] clone R：5’‑GCGGATCATTTAACGCGTTAGC‑3’(SEQ ID NO.5)。

[0066] 引物对realtime F/R的产物位于引物对clone F/R扩增的序列内。Real Time PCR探针的5’端结合有荧光报告基团(FAM)，3’端结合有荧光淬灭基团(TAMRA)。

[0067] 以上引物和探针均由上海生物工程公司合成。

[0068] 2猪肺炎支原体的培养

[0069] 将1.5mL猪肺炎支原体CJ株菌种接种至10mL改良Friis培养基，置于温度36～38℃恒温培养箱中培养48h，再按1∶10(V/V)的比例继代，置于温度36～38℃恒温培养箱中培养，当培养基的颜色变黄、pH值由7.6降低至6.7～6.8时，收获菌液，‑20℃保存。

[0070] 3DNA提取

[0071] 收获的菌液按照Takara细菌基因组DNA抽提试剂盒说明书进行核酸提取。

[0072] 4DNA标准品制备

[0073] 收获的猪肺炎支原体菌液提取的基因组，以clone F和clone R为引物，扩增猪肺炎支原体16S rRNA基因，PCR产物经电泳分离可以看出扩增出了约670bp的特异性条带，与预计的目的片段大小一致(如图1)。再经凝胶切割纯化、定量、确定目的基因浓度后，克隆至pMD19‑T载体中，转化DH5α感受态细胞，酶切鉴定(如图2)和PCR鉴定(如图3)均为阳性的菌落，经增殖培养后，提取质粒送上海生物工程技术服务有限公司进行定量及测序。正确序列的阳性质粒用超微量核酸、蛋白分析仪测定质粒浓度与纯度，根据重组质粒的分子质量与1 9
质量浓度，计算单位体积质粒拷贝数，通过系列稀释，将重组质粒稀释为10～10copies/μL作为标准品待用。

[0074] 5反应体系的优化

[0075] 在相同浓度模板的反应体系中，以realtime F和realtime R为引物，采用矩阵法优化引物浓度(0.1～1.0μmol/L)和探针浓度(0.1～1.0μmol/L)。同时在TaqMan荧光定量PCR反应条件中，通过对相同浓度的阳性核酸模板进行检测优化最佳退火温度(50～68℃)。通过比较Ct值判定优化结果，确定引物浓度为0.4μmol/L，探针浓度为0.3μmol/L，循环参数为94℃2分钟预变性，94℃10秒变性，60℃30秒退火/延伸，退火/延伸过程重复共40个循环。
结果见表1。

[0076] 表1正交实验结果及级差分析

[0077]

[0078] 6标准曲线的绘制

[0079] 以10倍系列稀释的阳性质粒作为标准品(103～109copies/μL)为模板，经Bio‑Rad IQ5实时荧光定量PCR仪扩增，每个稀释度重复2次，并用Bio‑Rad IQ5实时荧光定量PCR分析软件进行分析，绘制标准曲线，结果如图4和图5所示。

[0080] 7实时荧光定量PCR的特异性试验

[0081] 以猪肺炎支原体、猪鼻支原体、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪多杀性巴氏杆菌、猪细小病毒、猪圆环病毒2型病毒、大肠杆菌DH5α和BL21株核酸为模板，使用优化的实时荧光定量PCR条件进行特异性试验。结果显示，本方法具有良好的特异性。结果见表2。

[0082] 表2特异性试验结果

[0083]

[0084] 8实时荧光定量PCR的敏感性试验

[0085] 以10倍系列稀释的猪肺炎支原体阳性质粒(100～1010copies/μL)为模板，经Bio‑Rad IQ5实时荧光定量PCR分析软件进行敏感性试验。结果显示，本方法具有良好的敏感性。结果见表3。

[0086] 表3敏感性试验结果

[0087]

[0088] 9实时荧光定量PCR的重复性试验

[0089] 以核酸样品8份为模板进行检测，每份样品重复检测5次，统计其Ct15值并计算其变异系数。结果显示，本方法具有良好的重复性。结果见表4。

[0090] 表4重复性试验结果

[0091]

[0092] 实施例2

[0093] 使用CCU法和荧光定量PCR法检测猪肺炎支原体结果的比较

[0094] 1猪肺炎支原体的培养

[0095] 从菌种库中取出生产种子，用改良Friis液体培养基溶解，并按1∶10继代于改良Friis液体培养基中，放入温度36～38℃恒温培养箱中培养48～72小时，待菌液颜色发生改变，pH值降低至6.70～6.80时收取菌液，作为一级种子液，进行纯粹检验，应纯粹。按以上方法进行二级种子和三级种子繁殖及鉴定；将三级种子液按1∶10加入改良Friis液体培养基中，密闭发酵罐罐口，通入无菌空气，罐内压力达到0.08MPa时，关闭发酵罐上所有进出口，保压，温度36～38℃培养，分别于培养12、18、24、30、36、42、48、54、60、66、72、78、84、90、96小时无菌取出培养物，进行纯粹检验和含菌量的测定，并于‑20℃以下保存。

[0096] 2使用CCU法对猪肺炎支原体进行含菌量测定

[0097] 取不同时间收获的猪肺炎支原体菌液依次10倍系列稀释，稀释度达到10‑1、10‑2、‑3 ‑1210 ……10 ，再设培养基作对照，置温度36～38℃恒温培养箱内培养14日，每日观察记录培养基颜色变化和混浊度的变化，直至培养物pH值不发生变化，最后发生颜色变化的稀释度即为该培养物的CCU滴度，并测定3次。不同时间收获的猪肺炎支原体培养物的CCU法检测结果见表5。

[0098] 3使用荧光定量PCR法对猪肺炎支原体进行含菌量测定

[0099] 取不同时间收获的猪肺炎支原体菌液，每个待检样品设有3个平行样，按照实施例1中所述的提取基因组的方法，提取基因组。并以标准质粒的10倍梯度稀释物为模板，进行荧光定量PCR，根据建立的标准曲线，计算待检样品的拷贝数。不同时间收获的猪肺炎支原体培养物的荧光定量PCR法检测结果见表5。

[0100] 表5 CCU和荧光定量PCR检测猪肺炎支原体结果

[0101]

[0102]

[0103] 4 2种定量检测猪肺炎支原体结果的比较

[0104] 猪肺炎支原体培养物的2种定量检测结果显示，CCU法检测结果与荧光定量PCR法2
检测结果相关性极显著(R ＝0.95)，并建立二者的回归方程为lgCCU＝1.6778×lgcopy‑
6.7697。

[0105] 5实时荧光定量PCR检测方法的应用

[0106] 按本实施例项目1获得6批不同时间(36、42、48小时)收获的18份猪肺炎支原体培养物，按本实施例项目2、3定量检测含菌量，并分析结果(见表6)。结果显示，lgCCU/mL的理论值与实际值差异不显著(P>0.05)。由此说明，建立的荧光定量PCR法可用于猪肺炎支原体培养物和疫苗半成品的快速定量检测。

[0107] 表6实时荧光定量PCR检测猪肺炎支原体方法的应用

[0108]

[0109]

[0110] 6 2种检测方法对比

[0111] 用本研究方法和商品试剂盒(上海沪震猪肺炎支原体核酸检测试剂盒(PCR‑荧光探针法))对8份样品进行检测，结果显示，本方法具有更低的Ct值和更高的检出率。结果见表7。

[0112] 表7 2种检测方法对比

[0113]样品编号 本研究方法 商品试剂盒
样品1 19.10 19.37
样品2 17.20 19.41
样品3 28.65 32.81
样品4 33.34 37.43
样品5 17.95 19.10
样品6 24.14 28.40
样品7 32.07 35.22
样品8 34.55 37.67

[0114] 最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。