一种牛结节性皮肤病病毒可视化快速核酸检测方法

摘要

本发明公开了一种牛结节性皮肤病病毒(LSDV)的可视化快速核酸检测方法，该方法针对牛结节性皮肤病病毒的orf068基因设计RPA引物并进行扩增，然后向扩增产物中加入Cas12a蛋白并进行酶切反应，反应体系包括Cas12a蛋白、sgRNA和核酸探针，即可对核酸探针发出的信号进行检测。本发明检测orf068质粒的灵敏度是5copies/μL,检测LSDV和山羊痘病毒(GTPV)的灵敏度均为0.1TCID50/μL，检测临床样本的诊断敏感性为96.3％(95％CI：81.0％，99.9％)，且特异性高，眼观颜色变化判断结果，具有简便、快速和适合现场检测等优点。

权利要求

1.一种牛结节性皮肤病病毒可视化快速核酸非诊断目的检测方法，其特征在于包括以下步骤：(1)针对牛结节性皮肤病病毒的LSDV orf068基因设计重组酶聚合酶扩增引物；

(2)提取样品总DNA，利用步骤(1)中的引物进行重组酶聚合酶扩增；

(3)向步骤(2)的扩增产物中加入Cas12a蛋白并进行酶切反应，所述酶切反应体系包括：用于切割单链DNA的Cas12a蛋白；

引导Cas12a蛋白特异性结合于靶标核酸分子的sgRNA；

含有可检测的标记物和淬灭剂的核酸探针；

(4)对核酸探针发出的信号进行检测，

所述LSDV orf068基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:28所示；

所述重组酶聚合酶扩增引物的序列如下：

orf068‑RPA‑F：5’‑ATGGGTAAAAGATTTCTATATTCCTCACGGAAA‑3’orf068‑RPA‑R：5’‑CTTTGTGATGCATCTAAGCTTTATAGGATT‑3’；

所述sgRNA的核苷酸序列为：

5’‑TCATTTCTGCAGAATATTTAGGCGATCTACAACAGTAGAAAT‑3’。

2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述重组酶聚合酶扩增的反应体系为：

3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述Cas12a蛋白酶切体系为：

4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述信号检测方法为：利用手机对反应后的体系在紫外或蓝光下拍照，或利用凝胶成像系统拍照，或

利用多功能酶标仪测量荧光值。

5.一种牛结节性皮肤病病毒的可视化快速核酸检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：(1)用于对牛结节性皮肤病病毒的LSDV orf068基因进行重组酶聚合酶扩增的引物，所述LSDV orf068基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:28所示；所述重组酶聚合酶扩增引物的序列如下：orf068‑RPA‑F：5’‑ATGGGTAAAAGATTTCTATATTCCTCACGGAAA‑3’orf068‑RPA‑R：5’‑CTTTGTGATGCATCTAAGCTTTATAGGATT‑3’；

(2)用于对扩增产物进行可视化快速核酸检测的反应体系，该体系包括，用于切割单链DNA的Cas12a蛋白；

引导Cas12a蛋白特异性结合于靶标核酸分子的sgRNA；所述sgRNA的核苷酸序列为：5’‑TCATTTCTGCAGAATATTTAGGCGATCTACAACAGTAGAAAT‑3’；

含有可检测的标记物和淬灭剂的核酸探针。

6.权利要求5所述的试剂盒在牛结节性皮肤病病毒可视化快速核酸非诊断目的检测中的应用。

说明书

一种牛结节性皮肤病病毒可视化快速核酸检测方法

技术领域

[0001] 本发明属于病毒检测领域，具体涉及一种基于CRISPR‑Cas12a系统介导的核酸可视化检测技术，用于快速检测牛结节皮肤病(LSD)的方法及试剂盒。

背景技术

[0002] 牛结节皮肤病(Lumpy skin disease，LSD)是由牛结节性皮肤病病毒(Lumpy skin disease virus，LSDV)引起的一种皮肤病，以发热、皮肤水肿及局部坚硬的结节为主要特征，会严重妨碍养牛业的发展。LSD可以导致巨大的经济损失。如乳牛产奶量减少、肉牛生长性能下降、公牛暂时或永久不育、破坏皮张利用价值等。该病发病率在2％～45％之间，致死率高达20％，奶牛更为易感，已被世界动物卫生组织(OIE)列为必须通报的疫病之一。

[0003] 2019年8月，在中国新疆发现了第一起牛结节性皮肤病疫情，之后哈兽研首次分离病毒，命名为：LSDV/China/Xinjiang/2019(Xinjiang/2019)。测序全基因组分析显示与LSDV/Russia/Saratov/2017(Genbank：MH646674.1)同源性最高(99.42％)。2020年在全国多个省份流行，且有全国蔓延趋势。我国相继定为外来动物疫病和二类动物疫病。我国之前没有LSDV病的流行，缺乏有效的疫苗。绵羊痘病毒、山羊痘病毒和牛结节皮肤病病毒均属于羊痘病毒属，基因组相似度达到96％以上，我国使用山羊痘病毒弱毒疫苗对牛进行免疫，对LSDV起到了很好的预防效果。

[0004] 由于此前中国没有牛结节皮肤病，因此大多数的检测方法都是国外创建的。常规核酸检测方法主要是有PCR，qPCR，但是都存在需要昂贵的设备、专业的操作人员、反应时间长等缺点，很难做到在农场中普及使用。近年来，等温扩增技术如环介导等温扩增技术(loop‑mediated isothermal amplification，LAMP)，重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)等因其不需要昂贵的设备、反应快速，灵敏度高等优点发展迅速，逐渐在临床上应用起来。LAMP方法扩增能力强，但是不能对结果进行定量判定，只能简单的进行有无判定，并且容易在实验室形成气溶胶，造成假阳性。而RPA技术在扩增过程中容易引起非特异性扩增，结果检测需要凝胶电泳或者对产物进行纯化，很不方便。为防止LSD的传播，因此建立快速、灵敏、特异的检测方法对于病毒的防控至关重要。快速检测要求检测过程能在样品采集地完成(point‑of‑care testing,POCT)，而不依赖于实验室大型仪器设备。这是检测方法学发展的必然。

[0005] CRISPR‑Cas是一种存在于细菌和古生菌的防御及适应性免疫系统，其能够切割和消除病毒入侵和其他外源核酸的威胁。CRISPR‑Cas系统利用自身的RNA来和目标DNA进行序列配对，从而识别特异性序列。Cas12a便是其中一类，它不仅特异性的精准切割和其crRNA匹配的并含有PAM(TTTN)序列的双链DNA。它在特异性切割目标双链DNA之后，附带效应被激活，将非特异性无差别切割它附近的任何单链DNA。它对单链DNA切割速度极快，达到大于1000个分子每秒。利用此特性，可将荧光基团通过单链DNA与一种淬灭剂连接在一起(简称为报告序列)。当Cas12a被序列特异性的双链DNA激活后，它会切割报告序列，让荧光基团摆脱淬灭剂的限制而发光，从而检测到光信号，进而判断是否存在靶基因。该方法结合LAMP和RPA技术已经成功应用到了非洲猪瘟、新冠肺炎病毒、结核分枝杆菌、金黄色葡萄球菌、人乳头瘤病毒、寨卡和登革热病毒和支原体的检测上。

[0006] 然而，目前为止，该技术在牛病的检测中极少应用，在LSD的诊断中还没有见到相应的报道。针对中国LSDV流行的现状，急需一种可以做到快速、灵敏、高特异、适合现场快速检测的方法，严格控制该病的流行。

发明内容

[0007] 本发明的目的是建立一种牛结节性皮肤病病毒可视化快速核酸检测方法，该方法通过设计RPA特异性引物，利用RPA扩增技术对核酸进行放大，将产物利用Cas12a酶切，通过荧光信号进行病毒检测，不仅能快速检测得到结果，并且解决了现在检测方法不敏感，时间长，成本高等缺点。

[0008] 为实现本目的，本发明的具体技术方案如下：

[0009] 有文献报道，中国目前的LSDV毒株和LSDV/Russia/Saratov/2017(Genbank：MH646674.1)同源性最高，但是没有公布的最完整的序列。因此以该毒株为标准，全基因组比对找到在羊痘病毒属中保守的LSDV orf068序列(其在基因组中的位置是58160bp‑
59161bp)作为靶序列。在该序列中找到六个相邻最近的sgRNA，进而验证sgRNA活性，最后挑选特异性好，活性高的sgRNA作为目标sgRNA。

[0010] 由于羊痘病毒属的三种病毒基因组相似度在96％以上，我们建立了方法可以除检测LSDV外，还可以对绵羊痘病毒(sheep pox virus，SPPV)和山羊痘病毒(Goatpox virus，GTPV)进行检测。但是绵羊痘病毒和山羊痘病毒不能感染牛，具有宿主特异性，因此该方法可对牛LSDV进行特异性检测。

[0011] 接着，申请人将部分orf068序列连接到pUC57质粒作为标准品，以sgRNA1序列为中心，设计了4对RPA引物，按照RPA试剂盒推荐的体系进行反应，结合起敏感性等表现最终选择了第二对引物，命名为orf068‑RPA‑F/R。

[0012] 对RPA反应和Cas12a反应的进程进行了摸索，发现该检测方法快速，最快只需要15分钟就可以显示检测结果。针对中国目前通过注射山羊痘病毒疫苗预防牛结节皮肤病的现状，我们还针对GTPV进行了敏感度检测，发现与LSDV具有一样的敏感性。最后选择了已知背景的40份临床样本(27份阳性样本，13份阴性样本)，与文献报道的qPCR检测方法进行比较，发现阳性符合率高达96.3％。

[0013] 一种牛结节性皮肤病病毒可视化快速核酸非诊断目的检测方法，包括以下步骤：

[0014] (1)针对牛结节性皮肤病病毒的orf068基因(Genbank：MH646674.1)设计重组酶聚合酶扩增引物；

[0015] (2)提取样品总DNA，利用步骤(1)中的引物进行重组酶聚合酶扩增；

[0016] (3)向步骤(2)的扩增产物中加入Cas12a蛋白并进行酶切反应，所述酶切反应体系包括：

[0017] 用于切割单链DNA的Cas12a蛋白；

[0018] 引导Cas12a蛋白特异性结合于靶标核酸分子的sgRNA；

[0019] 含有可检测的标记物和淬灭剂的核酸探针；

[0020] (4)对核酸探针发出的信号进行检测。

[0021] 优选地，所述重组酶聚合酶扩增引物的序列如下：

[0022] orf068‑RPA‑F：5’‑ATGGGTAAAAGATTTCTATATTCCTCACGGAAA‑3’

[0023] orf068‑RPA‑R：5’‑CTTTGTGATGCATCTAAGCTTTATAGGATT‑3’。

[0024] 优选地，所述sgRNA的核苷酸序列为以下序列的任选之一：

[0025] 5’‑TCATTTCTGCAGAATATTTAGGCGATCTACAACAGTAGAAAT‑3’；

[0026] 5’‑TTTTTAACATATTATACATGTGATATCTACAACAGTAGAAAT‑3’；

[0027] 5’‑TGAAATGCTTCAACCATTTGCGCCATCTACAACAGTAGAAAT‑3’；

[0028] 5’‑TGAAAAAAAGATGTTTTATTTTAAATCTACAACAGTAGAAAT‑3’。

[0029] 优选地，所述重组酶聚合酶扩增的反应体系为：

[0030]

[0031] 优选地，所述Cas12a蛋白酶切体系为：

[0032]

[0033] 优选地，所述信号检测方法为：

[0034] 利用手机对反应后的体系在紫外或蓝光下拍照，或

[0035] 利用凝胶成像系统拍照，或

[0036] 利用多功能酶标仪测量荧光值。

[0037] 一种牛结节性皮肤病病毒的可视化快速核酸检测试剂盒，该试剂盒包括：

[0038] (1)用于对牛结节性皮肤病病毒的LSDV orf068基因进行重组酶聚合酶扩增的引物；

[0039] (2)用于对扩增产物进行可视化快速核酸检测的反应体系，该体系包括，[0040] 用于切割单链DNA的Cas12a蛋白；

[0041] 引导Cas12a蛋白特异性结合于靶标核酸分子的sgRNA；

[0042] 含有可检测的标记物和淬灭剂的核酸探针。

[0043] 本发明具有以下优点：

[0044] (1)本发明可用于绵羊痘病毒(SPPV)、山羊痘病毒(GTPV)、牛结节性皮肤病病毒(LSDV)三种病毒的检测，对LSDV和GTPV的检测敏感度为0.1TCID50/μL，具有高灵敏度。

[0045] (2)本发明可以可以快速得到检测结果，不需要昂贵的设备，检测成本低，通过荧光的强弱，可以初步判定感染病毒粒子的数量多少，得到半定量的检测结果，因此该方法既能应用于牛结节皮肤病的现场诊断，又能应用于牛结节性皮肤病病毒的实验室快速筛查。

[0046] (3)该方法特异性高，检测结果准确可靠。

附图说明

[0047] 图1：选定靶基因在LSDV基因组中的位置以及设计的6个sgRNA在LSDV orf068中的位置示意图。

[0048] 图2：LSDV orf068部分基因片段的扩增结果。

[0049] 图3：6个sgRNA的活性比较。DNA template：LSDV orf068基因的PCR扩增产物；ssDNA activator：sgRNA互补的单链DNA；Under blue/UV light：通过智能手机摄像头在蓝色和紫外线下捕获照片；gel imaging system：凝胶成像系统在紫外线下捕获照片。

[0050] 图4：第一对RPA引物配合Cas12a检测标准质粒的灵敏度。

[0051] 图5：第二对RPA引物配合Cas12a检测标准质粒的灵敏度。

[0052] 图6：第三对RPA引物配合Cas12a检测标准质粒的灵敏度。

[0053] 图7：第四对RPA引物配合Cas12a检测标准质粒的灵敏度。

[0054] 图8：利用多功能酶标仪检测RPA反应配合Cas12a检测标准质粒的灵敏度。

[0055] 图9：RPA配合Cas12a检测LSDV的检出限。A通过眼睛观察荧光分析RPA反应配合Cas12a检测LSDV的灵敏度；B多功能酶标仪检测RPA反应配合Cas12a检测LSDV的灵敏度。

[0056] 图10：RPA配合Cas12a检测方法的特异性。PUC57‑orf068：标准质粒；BPIV‑3：牛副流感病毒3型a型；BRSV：牛呼吸道合胞体病毒；IBRV：牛传染性鼻气管炎病毒；BVDV：牛病毒性腹泻病毒1型；BCoV：牛冠状病毒；BRV：牛轮状病毒；GTPV‑vaccine：山羊痘病毒弱毒疫苗；Salmonella：都柏林沙门氏菌；M.b：牛支原体；Mh：A6型牛溶血曼氏杆菌；E.coli：产肠毒素性大肠杆菌。NC；Negative control。

具体实施方式

[0057] 下面通过具体实施例对本发明进行详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

[0058] 本发明中所涉及的实验材料如无特殊说明均可从市售渠道获得。

[0059] 术语说明：

[0060] 除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

[0061] 牛结节皮肤病：牛结节皮肤病(lumpy skin disease,LSD)，简称“牛疙瘩病”，牛结节性皮肤病于1929年首次在赞比亚报道，之后在博茨瓦纳和南非地区出现，随后蔓延全球。该病主要存在于中东地区。但在2019年8月首次在我国新疆省伊犁地区被发现。此后传播到福建省、江西省、广东省、安徽省、浙江省等多个省份，对畜牧业造成了极大的损失。

[0062] 在本文中，术语“报告分子”：是指一定长度的单链DNA(ssDNA)，对其5'和3'端的碱基添加荧光基团(ROX,VIC,JOE,HEX,FAM等)和淬灭基团(BHQ1,BHQ2等)，即ssDNA‑reporter。其在CRISPR检测系统中的作用在于，当探针完整时，荧光基团受到淬灭接团制约，不能发出荧光。当ssDNA被Cas12a非特异性切割后，荧光基团和淬灭基团分离，淬灭基团解除对荧光基团的封闭作用，在特定波长光线照射条件下，借助荧光信号检测设备即可检测到荧光强度变化。

[0063] CRISPR/Cas系统：CRISPR/Cas系统(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR‑associated protein)是细菌和古生菌中一种抵抗外源基因侵入的获得性免疫防御机制。由原核动物在抵御外来病毒和噬菌体入侵的过程中不断进化而来。该系统能够整合外援侵入宿主的DNA片段到CRISPR位点，然后通过转录出外源DNA片段(crRNA)引导Cas核酸内切酶对外源DNA序列进行切割，从而抵抗病毒或者噬菌体的入侵。Cas12a便是其中一类，它不仅特异性的精准的切割和其crRNA匹配的并含有PAM(TTTN)序列的双链DNA。它在切割序列特异性的目标双链DNA之后，Collateral effect被激活，将非特异性无差别切割它附近的任何单链DNA。

[0064] CRISPR/Cas12a核酸快速检测通常分为2部分。第一步是目标序列的扩增，具体做法是利用PCR、RT‑PCR、RPA、LAMP等技术扩增目的核酸；第二步是Cas12a蛋白的反式切割反应：在体系中添加非特异的单链DNA报告分子(ssDNA‑reporter)，在Cas12、结合靶标DNA后，即激发单链DNA荧光报告分子的切割活性，从而产生游离的荧光发光基团并发出可检测的荧光。

[0065] 重组酶聚合酶扩增技术：重组酶聚合酶扩增技术，英文名称为RPA(Recombinase Polymerase Amplification)，能在常温(35‑40℃)条件下，短时间(通常是一小时内)内进行核酸扩增，是一种“简便、快速、精确、低价”的基因扩增方法。

[0066] 在本文中，术语“CRISPR‑Cas12a核酸检测”，是指利用CRISPR‑Cas12a特异识别切割目标基因后，且能非特异切割ssDNA荧光报告分子，借助荧光信号检测系统检测目标核酸分子的技术。

[0067] 在本文中，术语“sgRNA”：指能引导靶向特异核酸分子并激活Cas12a切割活性的小向导分子。

[0068] 在本文中，术语“可视化”：是指观察荧光信号，需借助荧光检测设备进行检测。

[0069] “质粒”也可以被称为表达载体，是一种环形双链DNA。由于其分子特征稳定的特点，在本实验中被作为标准DNA。

[0070] Vero细胞是非洲绿猴肾细胞系的简称，于1962年被日本科学家Yasumura和Kawakita扩增出来。

[0071] 实施例1：牛结节性皮肤病基因可视化检测sgRNA的筛选

[0072] 1.1靶基因的确定

[0073] 以LSDV/Russia/Saratov/2017(GenBank：MH646674.1)为标准，在NCBI中比对所有的羊痘病毒属中的病毒，找到了最保守的基因序列，在LSDV中的基因名称为LSDV orf068，在该基因范围内，寻找PAM序列，发现在401bp范围内存在6个sgRNA，序列如SEQ ID NO:1‑6所示，其在基因组中的位置如图1所示。

[0074] 用PCR‑F/R(SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:8)所示序列将该片段扩增下来，扩增程序为：98℃，5min；35循环(98℃，10s；58℃，15s；72℃，30s)72℃，5min。扩增体系为：Premix STAR Max Premix(TAKARA货号：R045A)：25μL；PCR‑F/R：各2.5μL；DNA模板：1μL；双蒸水补齐50μL。结果如图2，扩增条带大小正确，为401bp。经测序，该片段的DNA序列如SEQ ID NO:28所示。

[0075] 表1 LSDV orf068基因的PCR扩增引物及其6个sgRNA序列

[0076]

[0077]

[0078] 1.2 sgRNA的筛选

[0079] 为转录crRNA，利用T7‑crRNA‑F(SEQ ID NO：15)分别和ssDNA activator(SEQ ID NO.9‑SEQ ID NO.14)作为引物，分别进行PCR扩增。

[0080] 程序为：98℃，5min；35循环(98℃，10s；52℃，15s；72℃，30s)；72℃，5min。体系为：Premix STAR Max Premix(TAKARA货号：R045A)：25μL；引物1：2.5μL；引物2：2.5μL；C12质粒(SEQ ID NO:16)：10ng；双蒸水补齐50μL。

[0081] 然后对PCR产物切胶回收，按照体外转录试剂盒(NEB E2040s)说明书的要求进行体外转录，最后对得到的RNA进行纯化，得到6种crRNA分别命名为crRNA1‑6.

[0082] 为验证sgRNA的活性，将实施例1.1中的3μL PCR产物作为模板(DNA template)，将序列(SEQ ID NO.9‑14)作为相应sgRNA的阳性对照模板(ssDNA activator)，加入到Cas12a的反应体系中，当DNA template和ssDNA activator都不参与反应时，用无菌水作为阴性对照。此体系中包括Cas12a蛋白：250nM；crRNA：500nM；ssDNA‑FQ reporter(SEQ ID NO:17)：300nM；Buffer 2.1：2μL，之后加DEPC水补齐20μL。37℃反应15min。分别利用智能手机和凝胶成像系统拍照，其中手机在蓝光和紫外下拍照。得到图3结果。发现sgRNA3，4无法引导Cas12a切割PCR产物产生荧光，故没有活性。sgRNA1，2，5，6具有活性，并且活性相似。我们随机选用sgRNA1。

[0083] 表2转录crRNA的引物及相关质粒序列

[0084]

[0085]

[0086] 实施例2：RPA引物的筛选

[0087] 将实施例1.1中的401bp的片段构建到pUC57质粒中，命名为pUC57‑orf068。按照公23 9
式：拷贝数＝(浓度×6.022×10 )/(质粒全长×1×10 ×650)计算拷贝数，将pUC57‑orf068倍比稀释到不同拷贝数作为RPA反应的模板。按照RPA引物设计原则，针对orf068基因的设计了4对引物(SEQ ID NO.18‑25)，扩增产物包含sgRNA1。使用不同的引物对分别对各拷贝数的质粒进行RPA扩增。RPA反应配置如下：Primer free Buffer：29.5μL；DEPC water：12.2μL；RPA‑F/R。混匀后加入到一个TwistAmp Basic reaction中充分溶解，再向每个体系中加入2.5μL的280mM醋酸镁。最后加入1μL各拷贝数的质粒DNA，37℃反应40min。分别取3μL RPA产物，作为模板进行Cas12a反应，37℃反应15min。分别利用智能手机和凝胶成像系统拍照，其中手机在蓝光和紫外下拍照，结果如图4‑7。图4显前五个反应管发出荧光，第一对引物(SEQ ID NO:18‑19)的检测敏感度为50copies/μL。图5显示前6个反应管都有荧光发出，但是从50copies/μL到5copies/μL的荧光逐渐明显减弱，第二对引物(SEQ ID NO:
20‑21)的检测敏感度为5copies/μL。图6显示前五个反应管发出荧光，第三对引物(SEQ ID NO:22‑23)的检测敏感度为50copies/μL。图7显示前五个反应管发出荧光，第四对引物(SEQ ID NO:24‑25)的检测敏感度为50copies/μL。对比发现第二对RPA引物表现最好，作为之后实验的最佳引物。命名为orf068‑RPA‑F/R，引物序列如SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21所示。

[0088] 最终确定了基于CRISPR/Cas12a的RPA检测方法的步骤如下：

[0089] 1、样品DNA的提取：将采集的新鲜的样品利用DNA提取试剂盒提取总DNA。

[0090] 2、RPA反应：Primer free Buffer：29.5μL；DEPC water：12.2μL；orf068‑RPA‑F：2.4μL；orf068‑RPA‑R：2.4μL，混匀后加入到一个TwistAmp Basic reaction中充分溶解。
(按需求可以等比例放大)，再向每个反应中加入2.5μL的280mM醋酸镁，最后加入1μL DNA模板。37℃反应40min。阳性对照和阴性对照则分别以标准质粒pUC57‑orf068和无菌水做为DNA模板。

[0091] 3、Cas12a酶切体系如下。Cas12a蛋白：250nM；crRNA：500nM；DNA reporter：300nM；Buffer 2.1：2μL；RPA产物：3μL；DEPC water补足至20μL。37℃反应15min。

[0092] 4、结果检测：(1)利用手机在UV和blue light下拍照；(2)利用凝胶成像系统拍照；(3)将3中反应完的体系，转移到黑色的96孔酶标板，再加入80μL DEPC水，混匀之后，利用多功能酶标仪测量荧光值。即可对结果进行判定。

[0093] 表3扩增LSDV orf068基因的4对RPA引物及其序列

[0094]引物名称 序列表 引物序列(5’‑3’)
orf068‑RPA‑1F SEQ ID NO:18 GGGTAAAAGATTTCTATATTCCTCACGGAAATG
orf068‑RPA‑1R SEQ ID NO:19 ATCCTTTGTGATGCATCTAAGCTTTATAGGATT
orf068‑RPA‑2F SEQ ID NO:20 ATGGGTAAAAGATTTCTATATTCCTCACGGAAA
orf068‑RPA‑2R SEQ ID NO:21 CTTTGTGATGCATCTAAGCTTTATAGGATT
orf068‑RPA‑3F SEQ ID NO:22 GGTAAAAGATTTCTATATTCCTCACGGAAA
orf068‑RPA‑3R SEQ ID NO:23 TATAGAATCATCCTTTGTGATGCATCTAAGC
orf068‑RPA‑4F SEQ ID NO:24 AATGGGTAAAAGATTTCTATATTCCTCACG
orf068‑RPA‑4R SEQ ID NO:25 TCCTTTGTGATGCATCTAAGCTTTATAGGATT

[0095] 实施例3：该检测方法与qPCR检测灵敏性比较

[0096] 1.对质粒的检测灵敏度

[0097] 将实施例2中第二对引物的各个Cas12a酶切反应体系，转移到黑色的96孔酶标板，再加入80μL DEPC水，混匀之后，利用多功能酶标仪测量荧光值。每个反应三个重复。结果如图8。显示检测敏感度也可以达到5copies/μL，与实施例2中肉眼观察的结果一致。利用实施例2中倍比稀释的质粒作为模板，验证qPCR的灵敏度，该qPCR方法的检测靶点同样也是LSDV orf068基因，并且RPA扩增区域完全包含了qPCR的扩增区域。qPCR引物(SEQ ID NO:26‑27)的检测结果表1，发现qPCR的灵敏度也是5copies/μL，与我们的检测方法一致，但是基于Cas12a的RPA检测方法更加的简便快速，不需要昂贵的设备和专业的技术人员，与文献报导的qPCR方法相比具有更大的优势。

[0098] 表4 qPCR方法对质粒的检测灵敏度

[0099] Copies/μL Ct(Means±SEM) C.V(％)5
5×10 18.41±0.056 0.52
4
5×10 22.52±0.046 0.35
3
5×10 26.21±0.043 0.29
2
5×10 29.22±0.038 0.22
1
5×10 32.72±0.202 1.07
0
5×10 36.08±0.954 4.58
‑1
5×10 0 0
0 0 0

[0100] qPCR反应程序如下：95℃，5min；45循环(95℃，10s；60℃，30s)。体系为：MIX：10μL；qPCR‑F/R：0.4μL；补充DEPC水至20μL。

[0101] 表5扩增LSDV orf068基因的qPCR引物及其序列

[0102]引物名称 序列表 引物序列(5’‑3’)
qPCR‑F SEQ ID NO:26 GGGTAAAAGATTTCTATATTCCTCACGGAAATG
qPCR‑R SEQ ID NO:27 ATCCTTTGTGATGCATCTAAGCTTTATAGGATT

[0103] 2.对LSDV和GTPV的检测灵敏度

[0104] 将LSDV利用vero细胞扩增后，确定TCID50进行倍比稀释，利用商业试剂盒提取基因组，利用实施例2中的步骤进行检测，分别利用智能手机和凝胶成像系统拍照，其中手机在蓝光和紫外下拍照，结果如图9A。发现前5个反应管都有荧光发出，但是从1TCID50/μL到0.1TCID50/μL的荧光逐渐明显减弱，判定该方法对LSDV的最低检出量为0.1TCID50/μL。之后利用多功能酶标仪进行检测荧光值(图9B)，结果与肉眼观察的结果一致。因此证明该方法的结果通过肉眼观察是可信的。

[0105] 利用该方法对GTPV的最低检出限也是0.1TCID50/μL。该方法简便快捷，不需要专业技术人员，只需要一个简单的水浴锅就可以完成检测，能够更好的在基层普及使用。

[0106] 实施例4：方法的特异性

[0107] 将实验室保存的牛副流感病毒3型a型，牛呼吸道合胞体病毒，牛流行性腹泻病毒1型，牛冠状病毒，牛轮状病毒提取RNA，然后反转录成cDNA，将实验室保存的牛传染性鼻气管炎病毒，都柏林沙门氏菌，支原体，A6型牛溶血曼氏杆菌，产肠毒素性大肠杆菌提取DNA，将购买的某品牌的山羊痘病毒弱毒疫苗用DMEM溶解，提取DNA。利用orf068‑RPA‑F/R对上述DNA进行RPA扩增，分别取3μL RPA产物，作为模板进行Cas12a反应，37℃反应40min。分别利用智能手机和凝胶成像系统拍照，其中手机在蓝光和紫外下拍照，结果如图10，结果显示只有质粒和羊痘病毒的反应管发出荧光，证明该检测方法不会和其他病原发生交叉反应，特异性很好。

[0108] 实施例5：在临床样本检测中的应用

[0109] 针对40份已知背景样本，包括已知阳性样品27份，为发病牛场送检的12份鼻拭子，15份皮肤样本，发病牛具有典型的临床症状；来自于无发病史的健康牛场的阴性样本13份，其中鼻拭子10份，口腔拭子3份。利用qPCR方法进行检测，之后又利用自己建立的方法进行检测，其中pUC57‑orf068作为阳性对照，无菌水作为阴性对照。

[0110] 阴阳对照均成立的情况下，qPCR检测为阳性的样本27份。本发明方法检出阳性样本26份，qPCR检测阴性样本13份，本发明检出阴性样本13份。本发明的诊断敏感性为96.3％(95％CI：81.0％‑99.9％)；诊断特异性为92.31％(95％CI：62.1％‑99.6％)；结果见表6。

[0111] 表6临床样本检测与qPCR方法比较结果

[0112]