一种分级多孔金属有机骨架手性传感探针的制备方法和由此得到的探针及其应用

摘要

本发明涉及一种分级多孔金属有机骨架手性传感探针的制备方法，其包括提供分级多孔金属有机骨架微球，其具有规整的孔道结构；将氨基酸氧化酶固定到分级多孔金属有机骨架微球上，得到固定有酶的分级多孔金属有机骨架微球，氨基酸氧化酶通过吸附装载在分级多孔金属有机骨架微球的孔道中；将荧光分子固定到固定有酶的分级多孔金属有机骨架微球上，得到分级多孔金属有机骨架手性传感探针，荧光分子通过吸附装载在分级多孔金属有机骨架微球的孔道中。本发明还提供一种由上述制备方法得到的分级多孔金属有机骨架手性传感探针及其应用。本发明通过固定不同的氨基酸氧化酶作为手性识别中心，可以高灵敏性、高特异性对氨基酸进行识别与含量分析。

权利要求

1.一种分级多孔金属有机骨架手性传感探针的制备方法，其特征在于，该制备方法包括如下步骤：S1，提供分级多孔金属有机骨架微球，其具有规整的孔道结构；

S2，将氨基酸氧化酶固定到分级多孔金属有机骨架微球上，得到固定有酶的分级多孔金属有机骨架微球，其中，氨基酸氧化酶选自由L‑氨基酸氧化酶、L‑谷氨酸氧化酶和L‑色氨酸氧化酶组成的组中的至少一种，氨基酸氧化酶通过吸附装载在分级多孔金属有机骨架微球的孔道中；

S3，将荧光分子固定到固定有酶的分级多孔金属有机骨架微球上，得到分级多孔金属有机骨架手性传感探针，其中，荧光分子为3‑Oxo‑3', 6'‑双(4, 4, 5, 5‑四甲基‑1, 3, 

2‑二氧杂硼烷‑2‑基)‑3H‑螺[异苯并呋喃‑1,9'‑吨]‑6‑羧酸，荧光分子通过吸附装载在分级多孔金属有机骨架微球的孔道中。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1包括：S11，利用嵌段共聚物PEO106PPO70PEO106为模板剂提供金属有机骨架前驱体溶液；

S12，通过溶剂热生成分级多孔金属有机骨架前驱体；

S13，通过活化和去模板得到大孔径的分级多孔金属有机骨架微球。

3.一种根据权利要求1或2所述的制备方法得到的分级多孔金属有机骨架手性传感探针，其特征在于，氨基酸氧化酶和荧光分子偶联在分级多孔金属有机骨架微球的载体上。

4.根据权利要求3所述的分级多孔金属有机骨架手性传感探针的应用，其特征在于，该分级多孔金属有机骨架手性传感探针对氨基酸具有手性传感响应。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，该氨基酸为苯丙氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、色氨酸、组氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、和/或半胱氨酸。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，分级多孔金属有机骨架手性传感探针对氨基酸的L‑对映体显示荧光增强，而对氨基酸的D‑对映体无响应。

7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，分级多孔金属有机骨架手性传感探针分散在HEPES缓冲液中形成探针溶液，将氨基酸溶液加入探针溶液中孵育，利用荧光光谱仪测其荧光强度。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，在氨基酸溶液为0 100 μM的浓度范围内，~利用分级多孔金属有机骨架手性传感探针对氨基酸进行线性分析。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，氨基酸溶液的检测下限为0.38 μM 0.44 μ~M。

说明书

一种分级多孔金属有机骨架手性传感探针的制备方法和由此

得到的探针及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及酶固定化和分析化学，更具体地涉及一种分级多孔金属有机骨架手性传感探针的制备方法和由此得到的探针及其应用。

背景技术

[0002] 氨 基 酸 是 自 然 界 中 最 主 要 和 最 重 要 的 手 性 化 合 物 之 一(Angew.Chem.Int.Ed.2017,56,7276‑7281)。L‑氨基酸和D‑氨基酸并不是互相排斥的，并且通常以非外消旋混合物的形式共存。在哺乳动物和人体中，氨基酸通常以游离形式或者以蛋白质的形式存在。在一般情况下，有机体和自然界中的氨基酸多数以L形式存在，而D形式的大量存在通常表示阴性症状、衰老或疾病(ACS Appl.Mater.Interfaces 2017,9,20991‑20999)。氨基酸的产生、消旋在生命科学中具有重要价值(Amino Acids 2012,42,1553‑
1582)。氨基酸对映异构体也被广泛用作不对称性的手性来源。中枢神经系统中氨基酸的总量，以及对映体的比率通常表现出不同的生物学功能，与人类生理和病理中起着至关重要的作用，特定手性氨基酸在生物系统中的表达水平通常与许多疾病的早期阶段有关，例如，慢性肾脏病，阿尔茨海默氏病和癌症(J.Am.Chem.Soc.2016,138,12099‑12111)。因此，快速、准确对氨基酸进行手性分析具有重要的意义。迄今为止，氨基酸对映体的选择性识别和检测有多种方法，包括色谱法、毛细管电泳、荧光法，圆二色性等
(Biosens.Bioelectron.2020,151,111971)。然而，用于对映体识别和分离的常规色谱法、毛细管电泳方法等，虽然对氨基酸手性检测是有效的，但是测试费用高、测试所需的程序和步骤较为繁琐，检测时间长。而荧光传感器可以规避这些缺点，可以快速、有效、简单、方便地对手性氨基酸进行检测。该方法适用于生物样品中氨基酸对映体的高通量筛选和实时成像。然而，手性结合/反应位点的设计是荧光探针对映选择性识别的关键和巨大挑战。

[0003] 要实现底物与探针分子之间的立体化学相互作用，需要一个复杂而精确的化学合成过程。同时，荧光探针很少能同时对特定氨基酸进行对映选择性和化学选择性识别，并且可能受到其他类似生物化学分子的干扰。因此，开发一种适用于手性氨基酸广谱检测的通用荧光传感策略，无论是对映选择性还是化学选择性，都具有重要意义。

发明内容

[0004] 为了实现荧光探针对氨基酸进行对映选择性和化学选择性识别，本发明提供一种分级多孔金属有机骨架手性传感探针的制备方法和由此得到的探针及其应用。

[0005] 根据本发明的分级多孔金属有机骨架手性传感探针的制备方法，其包括步骤：S1，提供分级多孔金属有机骨架微球(HPUiO‑66)，其具有规整的孔道结构；S2，将氨基酸氧化酶(AAO)固定到分级多孔金属有机骨架微球(HPUiO‑66)上，得到固定有酶的分级多孔金属有机骨架微球(AAO@HPUiO‑66)，其中，氨基酸氧化酶(AAO)通过吸附装载在分级多孔金属有机骨架微球(HPUiO‑66)的孔道中；S3，将荧光分子(PF)固定到固定有酶的分级多孔金属有机骨架微球(AAO@HPUiO‑66)上，得到分级多孔金属有机骨架手性传感探针(AAO&PF@HPUiO‑66)，其中，荧光分子(PF)通过吸附装载在分级多孔金属有机骨架微球(HPUiO‑66)的孔道中。

[0006] 优选地，氨基酸氧化酶(AAO)为具有手性识别功能的氨基酸氧化酶。更优选地，氨基酸氧化酶(AAO)选自由L‑氨基酸氧化酶、L‑谷氨酸氧化酶和L‑色氨酸氧化酶组成的组中的至少一种。

[0007] 优选地，荧光分子(PF)为具有H2O2响应的荧光分子。更优选地，荧光分子(PF)为3‑Oxo‑3',6'‑双(4,4,5,5‑四甲基‑1,3,2‑二氧杂硼烷‑2‑基)‑3H‑螺[异苯并呋喃‑1,9'‑吨]‑6‑羧酸。

[0008] 优选地，所述步骤S1包括：S11，利用嵌段共聚物PEO106PPO70PEO106(F127)为模板剂提供金属有机骨架(Metal organic Framework，MOFs)前驱体溶液；S12，通过溶剂热生成分级多孔金属有机骨架前驱体(HPUiO‑66‑as)；S13，通过活化和去模板得到大孔径的分级多孔金属有机骨架微球(HPUiO‑66)。更优选地，分级多孔金属有机骨架微球(HPUiO‑66)的孔径为8‑10nm。在优选的实施例中，分级多孔金属有机骨架微球(HPUiO‑66)的孔径为9.2nm。更优选地，将嵌段共聚物F127搅拌溶解于去离子水中，添加高氯酸钠和乙酸，超声溶解；然后添加硝酸铈铵和对苯二甲酸，搅拌分散；在60℃下搅拌反应20min；经过离心分离、洗涤、活化、干燥后得到分级多孔金属有机骨架微球(HPUiO‑66)。具体地，将150mg的F127溶解于
9mL去离子水中，然后将750mg的NaClO4·H2O和450μL的乙酸超声分散于上述F127溶液中；随后，将249mg的对苯二甲酸和274mg的硝酸铈铵搅拌分散于上述溶液中；然后，将混合液体在
60℃下搅拌反应20分钟；离心分离混合物得到固体产物；接着用去离子水、N,N‑二甲基甲酰胺、无水乙醇洗涤材料，并将材料在60℃下浸泡于无水乙醇中48h，期间不断更换乙醇，将材料孔道中的F127全部去除，经洗涤干燥后，最后得到尺寸为600nm～1000nm的分级多孔金属有机骨架微球(HPUiO‑66)。本发明利用嵌段共聚物F127为模板，利用 的Hofmeister盐溶介导作用，合成出具有9nm左右大孔径的分级多孔金属有机骨架微球(HPUiO‑66)，合成步骤简单、制备周期短。

[0009] 优选地，所述步骤S2包括：将具有手性催化功能的氨基酸氧化酶(AAO)溶解于去离子水中，添加分级多孔金属有机骨架微球(HPUiO‑66)，在25℃下搅拌4h，并通过离心收集固定有酶的分级多孔金属有机骨架微球(AAO@HPUiO‑66)。

[0010] 优选地，所述步骤S3包括：将荧光分子(PF)溶解于去离子水中，添加固定有酶的分级多孔金属有机骨架微球(AAO@HPUiO‑66)，在25℃下避光搅拌30min，并通过离心收集分级多孔金属有机骨架手性传感探针(AAO&PF@HPUiO‑66)。

[0011] 在本发明中，氨基酸氧化酶(AAO)为天然酶，荧光分子(PF)为荧光小分子，两者通过温和的后负载方法依次固定到分级多孔金属有机骨架微球(HPUiO‑66)的介孔孔道中，制备一系列具有高特异性传感性能的荧光探针。具体地，在室温下，将氨基酸氧化酶(AAO)和荧光分子(PF)通过后吸附的方式依次固定在分级多孔金属有机骨架微球(HPUiO‑66)的分级介孔中，合成出分级多孔金属有机骨架手性传感探针(AAO&PF@HPUiO‑66)，氨基酸氧化酶‑1 ‑1(AAO)的装载量为151mg g ，荧光分子(PF)的固定量为374mg g ，制备过程条件温和、操作简便。

[0012] 本发明还提供一种由上述制备方法得到的分级多孔金属有机骨架手性传感探针(AAO&PF@HPUiO‑66)，其中，氨基酸氧化酶(AAO)和荧光分子(PF)偶联在分级多孔金属有机骨架微球(HPUiO‑66)的载体上。

[0013] 本发明又提供一种上述的分级多孔金属有机骨架手性传感探针(AAO&PF@HPUiO‑66)的应用，其对氨基酸具有手性传感响应。据此，分级多孔金属有机骨架手性传感探针(AAO&PF@HPUiO‑66)通过氨基酸氧化酶(AAO)和荧光分子(PF)构建的联级响应体系用于手性氨基酸的识别。

[0014] 优选地，该氨基酸为苯丙氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、色氨酸、组氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、和/或半胱氨酸。

[0015] 优选地，分级多孔金属有机骨架手性传感探针(AAO&PF@HPUiO‑66)对氨基酸的L‑对映体显示荧光增强，而对氨基酸的D‑对映体无响应。

[0016] 优选地，分级多孔金属有机骨架手性传感探针(AAO&PF@HPUiO‑66)分散在HEPES缓冲液中形成探针溶液，将氨基酸溶液加入探针溶液中孵育，利用荧光光谱仪测其荧光强度。

[0017] 优选地，在氨基酸溶液为0～100μM的浓度范围内，利用分级多孔金属有机骨架手性传感探针(AAO&PF@HPUiO‑66)对氨基酸进行线性分析。据此，分级多孔金属有机骨架手性传感探针(AAO&PF@HPUiO‑66)可用于手性氨基酸的定量分析。

[0018] 优选地，氨基酸溶液的检测下限为0.38μM～0.44μM。

[0019] 本发明将酶和荧光分子通过后固定的方式，依次装载进入分级多孔金属有机骨架中，金属有机骨架材料坚固的外骨骼保护了酶的蛋白结构，改善酶的稳定性，其分级多孔结构也将荧光分子分隔固定在金属节点上，避免了荧光分子的聚集淬灭；其较大的孔径以及高的孔隙率有利于物质的快速扩散和反应，检测过程中利用联级反应，即L‑氨基酸氧化酶与L‑氨基酸之间的氧化脱氨反应生成H2O2，接着H2O2与荧光分子PF发生开环反应生成强烈荧光，并使用荧光分光光度计进行检测，达到氨基酸手性检测的目的。根据本发明的制备方法具有高度的延展性，通过负载不同的天然氨基酸氧化酶，实现对不同氨基酸的手性识别和定量分析，为设计对映选择性和化学选择性荧光传感器提供了一条简单而有效的途径，对于实现快速、准确的氨基酸手性识别和定量分析具有重要的意义。本发明通过固定不同的氨基酸氧化酶作为手性识别中心，可以高灵敏性、高特异性对手性氨基酸进行识别与含量分析。该方法合成方法便捷，制备条件温和，仪器操作方便，技术要求低，分析灵敏度高、特异性强、抗干扰能力优异。本发明的分级多孔金属有机骨架手性传感探针在HEPES缓冲溶液中可以对8种氨基酸，即苯丙氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、色氨酸、组氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、半胱氨酸的L‑对映体进行特异选择性识别，可以在100μM以下的低浓度范围内对L‑氨基酸进行线性测定，且具有低检测限(0.38μM‑0.44μM)、高灵敏性、强特异性、抗干扰能力优异；且检测仪器简单，操作方便，技术要求低。本发明提供的策略具有普遍适用性，简单地将L‑氨基酸氧化酶替换为L‑谷氨酸氧化酶，可以实现水相中游离L‑谷氨酸的选择性识别和含量分析。且同样具备高特异性、低检测限、强抗干扰能力。

附图说明

[0020] 图1是根据本发明的分级多孔金属有机骨架手性传感探针的制备方法的工艺流程图；

[0021] 图2是根据本发明的分级多孔金属有机骨架手性传感探针的荧光分子(PF)的核磁共振氢谱图；

[0022] 图3是根据本发明的分级多孔金属有机骨架手性传感探针在负载L‑氨基酸氧化酶L‑AAO和荧光分子PF时的吸附动力学曲线；

[0023] 图4是根据本发明的分级多孔金属有机骨架手性传感探针的XRD图谱；

[0024] 图5是根据本发明的分级多孔金属有机骨架手性传感探针的扫描电镜图像；

[0025] 图6是根据本发明的分级多孔金属有机骨架手性传感探针的氮气吸附图及其孔径分布图；

[0026] 图7是根据本发明的分级多孔金属有机骨架手性传感探针对苯丙氨酸的两种对映体动力学响应图谱；

[0027] 图8是根据本发明的分级多孔金属有机骨架手性传感探针对亮氨酸的两种对映体动力学响应图谱；

[0028] 图9是根据本发明的分级多孔金属有机骨架手性传感探针对蛋氨酸的两种对映体动力学响应图谱；

[0029] 图10是根据本发明的分级多孔金属有机骨架手性传感探针对色氨酸的两种对映体动力学响应图谱；

[0030] 图11是根据本发明的分级多孔金属有机骨架手性传感探针对组氨酸的两种对映体动力学响应图谱；

[0031] 图12是根据本发明的分级多孔金属有机骨架手性传感探针对异亮氨酸的两种对映体动力学响应图谱；

[0032] 图13是根据本发明的分级多孔金属有机骨架手性传感探针对酪氨酸的两种对映体动力学响应图谱；

[0033] 图14是根据本发明的分级多孔金属有机骨架手性传感探针对半胱氨酸的两种对映体动力学响应图谱；

[0034] 图15是根据本发明的分级多孔金属有机骨架手性传感探针对苯丙氨酸的L‑对映体的荧光滴定图谱；

[0035] 图16是根据本发明的分级多孔金属有机骨架手性传感探针对亮氨酸的L‑对映体的荧光滴定图谱；

[0036] 图17是根据本发明的分级多孔金属有机骨架手性传感探针对蛋氨酸的L‑对映体的荧光滴定图谱；

[0037] 图18是根据本发明的分级多孔金属有机骨架手性传感探针对色氨酸的L‑对映体的荧光滴定图谱；

[0038] 图19是根据本发明的分级多孔金属有机骨架手性传感探针对组氨酸的L‑对映体的荧光滴定图谱；

[0039] 图20是根据本发明的分级多孔金属有机骨架手性传感探针对异亮氨酸的L‑对映体的荧光滴定图谱；

[0040] 图21是根据本发明的分级多孔金属有机骨架手性传感探针对酪氨酸的L‑对映体的荧光滴定图谱；

[0041] 图22是根据本发明的分级多孔金属有机骨架手性传感探针对半胱氨酸的L‑对映体的荧光滴定图谱；

[0042] 图23是根据本发明的分级多孔金属有机骨架手性传感探针抗干扰、选择性检测结果图像；

[0043] 图24是根据本发明的分级多孔金属有机骨架手性传感探针对谷氨酸的两种对映体响应的荧光动力学曲线，对L‑谷氨酸的荧光滴定图谱，以及对L‑谷氨酸的选择性检测结果图像。

具体实施方式

[0044] 下面结合附图，给出本发明的较佳实施例，并予以详细描述。

[0045] 如图1所示，根据本发明的分级多孔金属有机骨架手性传感探针的制备方法包括步骤：提供MOFs前驱体溶液；通过溶剂热生成分级多孔UiO‑66前驱体(HPUiO‑66‑as)；通过活化和去模板得到分级多孔UiO‑66纳米颗粒(HPUiO‑66)；将L氨基酸氧化酶(L‑AAO)固定到分级多孔UiO‑66纳米颗粒(HPUiO‑66)上，得到固定有酶的分级多孔金属有机骨架(L‑AAO@HPUiO‑66)，其中，L氨基酸氧化酶(L‑AAO)通过吸附装载在分级多孔UiO‑66纳米颗粒(HPUiO‑66)的孔道中；将荧光分子(PF)固定到固定有酶的分级多孔金属有机骨架(L‑AAO@HPUiO‑66)上，得到分级多孔金属有机骨架手性传感探针(L‑AAO&PF@HPUiO‑66)，其中，荧光分子(PF)通过吸附装载在分级多孔UiO‑66纳米颗粒(HPUiO‑66)的孔道中。

[0046] 实施例1

[0047] 1.1荧光分子(PF)的合成

[0048] 将质量为3.15g的1,2,4‑苯三甲酸和质量为5.19g的3‑溴苯酚以及体积量为15mL的甲磺酸添加到三颈烧瓶中。并在135℃下回流加热72小时，自然冷却后将混合物加入到120mL冰去离子水中，搅拌得到绿色固体，随后通过真空过滤收集所得固体。并用吡啶和乙酸酐的混合试剂(v/v＝1:3)洗涤数次，并在100℃用乙酸酐和吡啶的混合试剂(v/v＝2:1)‑1
重结晶3次，然后用浓度为1mol L 的盐酸洗涤数次，最后，在85℃通过真空干燥12h得到白色固体粉末。

[0049] 将质量为400mg的双(频哪醇)二硼，质量为200mg的上述固体粉末，质量为98.9mg的Pd(dppf)Cl2，以及质量为510mg的无水乙酸钾装入到干燥的三颈烧瓶，并将系统抽真空后再回充氮气。此过程至少重复三遍。然后加入体积量为5mL的无水、脱气的N,N‑二甲基甲酰胺。随后将混合溶液在室温下搅拌5分钟后于85℃回流加热3h。反应结束自然冷却后，通过旋蒸除去溶剂，并通过二氯甲烷平衡的硅胶色谱柱，用二氯甲烷和甲醇的混合溶剂进行梯度洗涤以纯化粗产物，然后滴加最少量的无水乙醚以沉淀出浅棕色固体，并用无水乙醚洗涤数次，最后在40℃真空干燥12h得到骨白色粉末(PF)。

[0050] 图2的核磁共振氢谱图证明了PF成功合成。

[0051] 1.2分级多孔UiO‑66纳米颗粒的合成

[0052] 在室温条件下，将质量为150mg的F127溶解于9mL去离子水中，然后将质量为750mg的NaClO4·H2O和体积量为450μL的乙酸超声分散于上述F127溶液中。随后，将质量为249mg的对苯二甲酸和质量为274mg的硝酸铈铵搅拌分散于上述溶液中。然后，将混合液体在60℃下搅拌反应20分钟。离心分离混合物得到固体产物。接着用去离子水、N,N‑二甲基甲酰胺、无水乙醇洗涤材料，并将材料在60℃下浸泡于无水乙醇中48h，期间不断更换乙醇，将材料孔道中的F127全部去除，经洗涤干燥后，最后得到尺寸为700nm～800nm的分级多孔金属有机骨架材料(HPUiO‑66)。

[0053] 1.3固定L氨基酸氧化酶(L‑AAO)得到固定有酶的分级多孔金属有机骨架(L‑AAO@HPUiO‑66)

[0054] 将质量为2.5mg的L‑氨基酸氧化酶溶解于2.5mL去离子水中，然后将质量为2.5mg的HPUiO‑66纳米颗粒分散于上述酶溶液中。并在25℃下搅拌4小时。通过离心收集固定有酶的HPUiO‑66材料(L‑AAO@HPUiO‑66)，并用去离子水洗涤数次，达到除去吸附在HPUiO‑66表面的酶的目的。

[0055] 1.4固定荧光分子(PF)得到分级多孔金属有机骨架手性传感探针(L‑AAO&PF@HPUiO‑66)

[0056] 将质量为5mg的荧光分子PF溶解于5mL去离子水中，然后将质量为2.5mg的L‑AAO@HPUiO‑66纳米颗粒分散于上述溶液中。并在25℃下避光搅拌30min。通过离心收集固定有酶和荧光分子的HPUiO‑66材料(L‑AAO&PF@HPUiO‑66)，并用去离子水洗涤数次，达到除去吸附在表面的PF的目的。

[0057] 图3是L‑氨基酸氧化酶L‑AAO和荧光分子PF的吸附动力学图谱。图4是HPUiO‑66和L‑AAO&PF@HPUiO‑66的XRD图谱，可以看出无论是分级多孔金属有机骨架材料HPUiO‑66，还是分级多孔金属有机骨架手性探针材料L‑AAO&PF@HPUiO‑66，都保持着UiO‑66晶体的特征峰以及高结晶度；图5为HPUiO‑66(A)和L‑AAO&PF@HPUiO‑66(B)的扫描电镜图像，表明HPUiO‑66和L‑AAO&PF@HPUiO‑66都具有规整的孔道结构，粒径在700nm～800nm。图6是HPUiO‑66和L‑AAO&PF@HPUiO‑66的氮吸附‑脱附曲线以及孔径分布。可以看出L‑AAO&PF@HPUiO‑66与HPUiO‑66相比比表面积、孔隙率、孔径都大幅度下降。证明L‑AAO和PF装载到HPUiO‑66的孔道中，而不是吸附在表面。下表1中给出了HPUiO‑66和L‑AAO&PF@HPUiO‑66的孔结构参数。

[0058] 表1

[0059] 3 2样品 孔径(nm) 孔容(cm/g) 比表面积(m/g)
HPUiO‑66 9.2 0.626 1217.3
L‑AAO&PF@HPUiO‑66 6.7 0.142 262.0

[0060] 1.5分级多孔金属有机骨架手性传感探针(L‑AAO&PF@HPUiO‑66)对氨基酸的手性识别

[0061] 将质量为5mg L‑AAO&PF@HPUiO‑66探针材料分散在50mL HEPES缓冲液(20mM，pH ‑1 ‑17.4)中形成100mg L 的探针溶液，将100μL的L/D‑氨基酸溶液(2mM L )加入到1.9mL上述探针溶液中，在避光条件下于37℃孵育反应。然后，在固定的时间间隔下检测混合物在λ＝
520nm处的荧光强度。图7‑图14的图像可以看出L‑AAO&PF@HPUiO‑66探针对8种氨基酸(苯丙氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、色氨酸、组氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)具有手性传感响应。对L‑对映体显示荧光增强，而对相应的D‑对映体无响应。

[0062] 1.6分级多孔金属有机骨架手性传感探针(L‑AAO&PF@HPUiO‑66)对氨基酸的含量分析

[0063] 将质量为5mg L‑AAO&PF@HPUiO‑66探针材料分散在50mL HEPES缓冲液(20mM，pH ‑17.4)中形成100mg L 的探针溶液，将100μL不同浓度的L‑氨基酸溶液加入到1.9mL上述探针溶液中，将反应在37℃下避光孵育至平衡，利用荧光光谱仪测得上述反应混合物在λ＝
520nm处的荧光强度。图15‑图22的图像可以看出，当上述8种氨基酸的L‑对映体加入后，探针溶液的荧光强度随着L‑氨基酸浓度的增加而有规律地增强，在0～100μM的浓度范围内，探针可以对L‑氨基酸进行线性分析，相关系数高达0.99，且具有较低的检测限LOD(0.38μM～0.44μM)。下表2给出了探针对以上8种L‑氨基酸的荧光检测特性的总结。

[0064] 表2

[0065]

[0066] 1.7分级多孔金属有机骨架手性传感探针(L‑AAO&PF@HPUiO‑66)在干扰离子和化合物共存的情况下对氨基酸的荧光传感检测

[0067] 将干扰物质(Na+，K+，Mg2+，Al3+，Br‑，Cl‑，HCO3‑，NO2‑，葡萄糖(GLU)，谷胱甘肽(GSH)，胆固醇(CHOL))溶解于探针溶液中，浓度为100μM，并在加入100μL L‑苯丙氨酸(100μM)前后对探针溶液进行荧光测定。得到λ＝520nm处的荧光强度。图23中的A显示上述干扰物质对探针本身荧光特性的影响可以忽略不计，B显示干扰物质存在于待检测混合溶液中时，对L‑氨基酸的检测结果没有影响。

[0068] 1.8分级多孔金属有机骨架手性传感探针(L‑AAO&PF@HPUiO‑66)在模拟的生理环境中对氨基酸的荧光传感检测

[0069] 在模拟的生理条件下，即将L‑苯丙氨酸和D‑苯丙氨酸以及L‑AAO&PF@HPUiO‑66探针材料溶解于模拟体液(SBF)，其中，SBF溶液配置方法为：将NaCl，NaHCO3，KCl，K2HPO4，+ + 2+ 2+MgCl2，CaCl2，Na2SO4溶解于去离子水中，无机离子浓度(mM：Na 142，K 5，Mg  1.5，Ca  ‑
2.5，Cl 149， 18， )与人体血浆浓度相一致，在37℃下用三‑
(羟甲基)氨基甲烷[(CH2OH)3CNH2]和盐酸(HCl)将液体的缓冲pH值调节为7.4。并按照1.6分级多孔金属有机骨架手性传感探针(L‑AAO&PF@HPUiO‑66)对氨基酸的含量分析的测试过程，在不同浓度的L‑苯丙氨酸和D‑苯丙氨酸混合溶液中进行L‑苯丙氨酸的选择性传感，并同时进行四组平行实验，得到检测平均浓度。下表3的结果验证了L‑AAO&PF@HPUiO‑66探针在模拟生理条件下对L‑苯丙氨酸的传感能力。

[0070] 表3

[0071] 样品 添加浓度(μM) 测定浓度(μM)±σ 回收率(％)L‑Phe/D‑Phe 5/100 5.2±0.3 104±5
L‑Phe/D‑Phe 20/100 19.6±0.6 98±3
L‑Phe/D‑Phe 40/100 41.6±0.5 104±1
L‑Phe/D‑Phe 60/100 60.4±1.0 101±2

[0072] 实施例2

[0073] 参照实施例1的1.2‑1.4，改变固定的氨基酸氧化酶，将L‑谷氨酸氧化酶(L‑GOX)固定到分级介孔金属有机骨架微球中，得到L‑GOX&PF@HPUiO‑66探针材料。

[0074] 参见实施例1的1.5，改变L/D‑氨基酸为L/D‑谷氨酸。图24A可以看出L‑GOX&PF@HPUiO‑66探针对L‑谷氨酸具有手性传感能力。

[0075] 参见实施例1的1.6，改变L‑AAO&PF@HPUiO‑66探针材料为L‑GOX&PF@HPUiO‑66探针材料；改变L‑氨基酸为L‑谷氨酸。图24B和图24C可以看出L‑GOX&PF@HPUiO‑66探针可以在0～100μM内对L‑谷氨酸进行线性分析。

[0076] 将19种具有手性对映体的氨基酸溶液(100μM)100μL加入到1.9mL的L‑GOX&PF@‑1HPUiO‑66探针溶液(100mg L )中。在37℃下避光孵育至反应平衡，利用荧光光谱仪测得上述反应混合物在λ＝520nm处的荧光强度。图24D可以得出探针对L‑谷氨酸具高选择性，对其他L‑氨基酸和D‑氨基酸没有响应。

[0077] 见实施例1的1.8，改变L‑苯丙氨酸和D‑苯丙氨酸为L‑苯丙氨酸、L‑亮氨酸、L‑蛋氨酸、L‑色氨酸、L‑组氨酸、L‑异亮氨酸、L‑酪氨酸、L‑半胱氨酸和D‑谷氨酸。下表4结果证明了L‑GOX&PF@HPUiO‑66探针在模拟生理条件下对L‑谷氨酸的传感能力。

[0078] 表4

[0079]

[0080] 本发明通过嵌段共聚物F127模板和 的Hofmeister盐化阴离子作用，合成出分级多孔金属有机骨架材料。并通过后吸附的方式，将不同类型的氨基酸氧化酶以及荧光分子装载进入分级多孔金属有机骨架材料的孔道中，从而实现氨基酸的手性识别和含量分析。此方法具有普遍适用性，为生物分子荧光传感提供了新的方法和思路。

[0081] 以上所述的，仅为本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的范围，本发明的上述实施例还可以做出各种变化。即凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰，皆落入本发明专利的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的均为常规技术内容。