一种单个核-卫星组装体表面增强拉曼分子尺及其应用转让专利
申请号 : CN202110630094.0
文献号 : CN113310966B
文献日 : 2022-11-04
发明人 : 张磊 , 汪联辉 , 冯宁 , 沈晶晶 , 范曲立
申请人 : 南京邮电大学
摘要 :
本发明公开了一种单个核‑卫星组装体表面增强拉曼(SERS)分子尺及其在检测单个四面体DNA构型变化中的应用。所述分子尺包括核金纳米颗粒、四面体DNA和卫星金纳米颗粒，所述卫星金纳米颗粒通过一个四面体DNA与核金纳米颗粒连接。在Hg2+驱动下，四面体DNA构型发生变化，核纳米金与卫星纳米金之间的间距减小，等离子体激元耦合作用增强，使得核‑卫星纳米组装体的SERS强度大大增加；这一过程可以通过DFM与拉曼光谱联用装置实时观测，单个核‑卫星组装体的SERS光谱的强度上表现出阶梯状的升高，实现在单分子水平对四面体DNA构型变化的实时监测。
权利要求 :
1.一种单个核‑卫星组装体表面增强拉曼分子尺，其特征在于：包括核金纳米颗粒、四面体DNA和卫星金纳米颗粒，所述卫星金纳米颗粒通过一个四面体DNA与核金纳米颗粒连接；
所述四面体DNA底面的三个顶点与核金纳米颗粒连接，四面体DNA的第四个顶点与卫星金纳米颗粒连接，第四个顶点与底面三个顶点之间的三条棱中任意一条为单链，四面体DNA的其余五条棱为双链；
2+
所述四面体DNA的单链为含有Hg 适配体的单链DNA；
其制备方法如下：
（1）先将ITO玻璃片浸泡在浓度为10：2 v/v 3‑巯基丙基三乙氧基硅烷MPTES的乙醇溶液中3小时，取出ITO玻璃片，使用乙醇反复冲洗，用氮气吹干ITO玻璃片，然后，将ITO玻璃片浸泡在5毫升0.02 nM 100 nm AuNPs的乙醇溶液中3小时，取出ITO玻璃片，使用超纯水反复冲洗，用氮气吹干ITO玻璃片，得到固定有100 nm AuNPs的ITO玻璃片；
（2）4条单链DNA Tetra 1、Tetra 2、Tetra 3和Tetra 4在TM缓冲溶液中以等比例混合，把所得到的混合溶液加热至95°C，并在95°C中保存5分钟，然后在5分钟内冷却至4°C，并在
4°C中持续5分钟，得到四面体结构DNA；
所述TM缓冲溶液中20 mM Tris、50 mM MgCl2、pH 8.0；
（3）先将200μL 1μM四面体DNA溶液滴加在100 nm AuNPs修饰的ITO玻璃片表面上，室温下在振荡器中以30 rpm/min孵育3小时，然后，用超纯水冲洗ITO玻璃片，并在微弱的氮气流中干燥；
（4）将10 μL 1 mM 4‑巯基苯甲酸加入到0.02 nM 20 nm AuNPs水溶液中，共孵育30 min，得到4‑巯基苯甲酸功能化修饰的20 nm AuNPs；
（5）将100μL 20 nm AuNPs滴加在步骤（3）得到的AuNPs@四面体DNA修饰的ITO玻璃载玻片上，室温下在振荡器中以30 rpm/min孵育3小时，然后用超纯水冲洗ITO玻璃片的表面，并在氮气干燥，得到核‑卫星组装体SERS分子尺。
2.权利要求1所述的单个核‑卫星组装体表面增强拉曼分子尺在检测单个四面体DNA构型变化中的应用。
2+
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述应用是将Hg 溶液滴加在吸附有核‑卫星结构组装体的ITO玻璃片表面上，利用暗场显微镜与拉曼光谱联用装置，连续实时地观测单个核‑卫星纳米组装体的SERS光谱的变化。
2+
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述Hg 溶液的浓度为10‑100 nM。
2+
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述Hg 溶液的浓度为50 nM。
说明书 :
一种单个核‑卫星组装体表面增强拉曼分子尺及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于单分子检测技术领域，具体涉及一种单个核‑卫星组装体表面增强拉曼(SERS)分子尺及其在检测单个四面体DNA构型变化中的应用。
背景技术
[0002] DNA适配体是一种基于特定目标分子驱动结构变化的DNA，具有强大的生物学应用功能。在单分子水平实时追踪单个DNA适配体构型变化，有助于更好地理解DNA适配体反应机制和动力学机制，对研究分子生物学、生物化学及医学都有很大的帮助。单分子技术目前常用的方法包括表面增强拉曼（SERS）光谱和荧光光谱。特别是SERS光谱由于具有灵敏度高和“指纹”信息丰富等优点，在单分子检测中得到了广泛应用。但SERS光谱技术很少能实时监测单分子构象的变化，它的随机时间波动和热点区域拉曼探针分子的布朗动力学导致了SERS强度的波动，使得检测更加复杂。虽然使用针尖增强拉曼光谱（TERS）方法可避免这些缺陷，但TERS技术也有其缺点，例如，TERS金属针尖在扫描测试过程中很容易断裂。另外，TERS设备价格也十分昂贵。为了解决这些问题，急需设计一种低成本、可靠的方法。
[0003] 利用暗场显微镜（DFM）与拉曼光谱技术相结合可实时跟踪单个等离子体纳米颗粒的SERS光谱信息。利用随时间变化的SERS光谱，可将DFM和拉曼光谱结合起来，实时对相邻两个等离体之间距离变化的实时监测，从而使连续变化得等离子体之间的距离转化成为一系列SERS信号的响应，从而为设计出色的SERS分子尺提供了新的可能性。在一定间距离范围内，电磁耦合作用与距离符合简单的指数关系，利用这一关系能够构建分子尺探针，为单分子水平研究生物分子的构象变化提供了一种有效手段。
发明内容
[0004] 针对现有SERS单分子技术的缺陷，本发明提供了一种单个核‑卫星组装体表面增强拉曼(SERS)分子尺及其在检测单个四面体DNA构型变化中的应用。
[0005] 为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
[0006] 一种单个核‑卫星组装体表面增强拉曼分子尺，包括核金纳米颗粒、四面体DNA和卫星金纳米颗粒，所述卫星金纳米颗粒通过一个四面体DNA与核金纳米颗粒相连接；
[0007] 所述四面体DNA底面的三个顶点与核金纳米颗粒连接，四面体DNA的第四个顶点与卫星金纳米颗粒连接，第四个顶点与底面三个顶点之间的三条棱中任意一条为单链，四面体DNA的其余五条棱为双链；
[0008] 所述四面体DNA的单链为含有Hg2+适配体的单链DNA。
[0009] 进一步地，所述分子尺包括至少8个四面体DNA和至少8个卫星金纳米颗粒。
[0010] 进一步地，所述核金纳米颗粒的粒径为80‑150 nm，所述卫星金纳米颗粒的粒径为20‑30 nm。
[0011] 更进一步地，所述核金纳米颗粒的粒径为100nm，所述卫星金纳米颗粒的粒径为20nm。
[0012] 进一步地，所述四面体DNA底面的三个顶点通过共价键与核金纳米颗粒连接，四面体DNA的第四个顶点通过共价键与卫星金纳米颗粒连接。
[0013] 上述单个核‑卫星组装体表面增强拉曼分子尺的制备方法，包括以下步骤：
[0014] 步骤1，分别制备核金纳米颗粒、四面体DNA和卫星金纳米颗粒；
[0015] 步骤2，在核金纳米颗粒表面修饰四面体DNA；
[0016] 步骤3，在卫星金纳米颗粒表面修饰4‑巯基苯甲酸；
[0017] 步骤4，将步骤3得到的卫星金纳米颗粒修饰在步骤2得到的核金纳米颗粒表面，得到核‑卫星组装体SERS分子尺。
[0018] 上述单个核‑卫星组装体表面增强拉曼分子尺在检测单个四面体DNA构型变化中的应用。
[0019] 进一步地，所述应用是将Hg2+溶液滴加在吸附有核‑卫星结构组装体的ITO玻璃片表面上，利用暗场显微镜与拉曼光谱联用装置，连续实时地观测单个核‑卫星纳米组装体的SERS光谱的变化。
[0020] 进一步地，所述Hg2+溶液的浓度为10‑100 nM。优选地，Hg2+溶液的浓度为50 nM。
[0021] 如图1所示，本发明的单个核‑卫星组装体表面增强拉曼分子尺是由四面体DNA作为连接分子将核金纳米颗粒和卫星金纳米颗粒组装成的核‑卫星组装体，其中四面体DNA的2+ 2+ 2+ 2+
一个边由含有Hg 适配体的单链DNA组成。在Hg 存在的情况下，由于Hg 和Hg 适配体之间
2+
很强的亲和力，Hg 适配体变成了发夹结构，从而导致四面体DNA由松弛状态转变为拉紧状态。结果，核金纳米颗粒与卫星金纳米颗粒之间的间距减小。由于表面等离子体激元耦合效应，使得核‑卫星纳米组装体的SERS强度大大增加，使其成为监测单个四面体DNA构型变化的理想光学分子尺。利用暗场光学显微镜（DFM）与拉曼光谱联用仪器，连续观测SERS强度的变化，实时监测单个四面体DNA构型变化的过程。
一个边由含有Hg 适配体的单链DNA组成。在Hg 存在的情况下，由于Hg 和Hg 适配体之间
2+
很强的亲和力，Hg 适配体变成了发夹结构，从而导致四面体DNA由松弛状态转变为拉紧状态。结果，核金纳米颗粒与卫星金纳米颗粒之间的间距减小。由于表面等离子体激元耦合效应，使得核‑卫星纳米组装体的SERS强度大大增加，使其成为监测单个四面体DNA构型变化的理想光学分子尺。利用暗场光学显微镜（DFM）与拉曼光谱联用仪器，连续观测SERS强度的变化，实时监测单个四面体DNA构型变化的过程。
[0022] 有益效果：
[0023] 1、本发明的单个核‑卫星组装体SERS分子尺具有在单水平实时检测四面体DNA检测构型变化的能力，并且具有结构简单、制作方便等优点。在本发明的一个实施例中，加入2+ ‑1
50 nM Hg 后，1073 cm 处的SERS强度呈阶梯状升高，SERS强度的阶梯高度约为2.16‑2.7 a.u，每一个SERS强度的阶梯对应单个四面体DNA结构改变事件。
50 nM Hg 后，1073 cm 处的SERS强度呈阶梯状升高，SERS强度的阶梯高度约为2.16‑2.7 a.u，每一个SERS强度的阶梯对应单个四面体DNA结构改变事件。
[0024] 2、与传统的等离子分子尺相比，所述SERS分子尺对颗粒间距离的变化更加敏感。
[0025] 3、克服了传统SERS单分子技术很少能实时监测单分子构象的变化的缺陷。
附图说明
[0026] 图1为本发明单个核‑卫星组装体SERS分子尺的结构示意图及检测原理。
[0027] 图2为实施例1中加入50 nM Hg2+后，核‑卫星纳米组装体的SERS光谱随时间变化的瀑布图。
[0028] 图3为实施例1中加入50 nM Hg2+后，1073 cm‑1处的SERS强度随时间的变化（黑点‑1的数据点），1073 cm 处的SERS强度随时间变化的拟合（水平直线），垂直直线表示SERS强度的阶梯高度。
[0029] 图4为实施例1中分别加入10 nM（a）和100 nM (c) Hg2+后，核‑卫星纳米组装体的2+ ‑1
SERS光谱随时间变化的瀑布图；b为加入10 nM Hg 后，1073 cm 处的SERS强度随时间的变
2+ ‑1 ‑1
化；d为加入100 nM Hg 后，1073 cm 处的SERS强度随时间的变化。其中：1073 cm 处的SERS强度随时间变化的拟合（水平直线），垂直直线表示SERS强度阶梯高度。
SERS光谱随时间变化的瀑布图；b为加入10 nM Hg 后，1073 cm 处的SERS强度随时间的变
2+ ‑1 ‑1
化；d为加入100 nM Hg 后，1073 cm 处的SERS强度随时间的变化。其中：1073 cm 处的SERS强度随时间变化的拟合（水平直线），垂直直线表示SERS强度阶梯高度。
具体实施方式
[0030] 下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照本领域常规条件。
[0031] 实施例1
[0032] 本实施例所用的DNA序列如下所示：
[0033] Tetra1，5’‑SH‑AGCATTACAGCTTGCTACACGATTCAGA CTTAGGAATGTTCGACATGCGAGGGTCCAATACCG‑3’（SEQ ID NO.1）
[0034] Tetra2, 5’‑SH‑ACGAACATTCCTAAGTCTGAAATTTATC ACCCGCCATAGTAGACGTATCACCAGGCAGTTGAG‑3’ （SEQ ID NO.2）
[0035] Tetra 3, 5’‑SH‑ACGTGTAGCAAGCTGTAATCGACGTTCTTTC TTCCCCTTGTTTGTTGTACTATGGCGGGTGATAAA‑3’ （SEQ ID NO.3）
[0036] Tetra 4, 5’‑ACGGTATTGGACCCTCGCATGACTCAACTGCCTGGTGATACGA(A)15‑3’ （SEQ ID NO.4）
[0037] 以上DNA序列从Takara Biotechnology Co.Ltd（中国大连）购买。
[0038] 四面体DNA由四条DNA单链（Tetra 1，Tetra 2，Tetra 3和Tetra 4）等比例混合、退火，形成。
[0039] Tetra 3序列中下划部分可与对应的Hg2+结合形成发夹结构，使四面体DNA由松弛状态转变为拉紧状态。
[0040] 本实施例中采用100 nm AuNPs作为核金纳米颗粒，20nm AuNPs作为卫星金纳米颗粒。
[0041] 实验中所使用的20 nm AuNPs和100 nm AuNPs采用种子生长法合成制备。
[0042] 核‑卫星组装体SERS分子尺是由四面体DNA作为连接分子将20 nm AuNP连接在100 nm AuNP表面上构建的。具体方法如下：
[0043] （1）先将ITO玻璃片浸泡在3‑巯基丙基三乙氧基硅烷MPTES的乙醇溶液（10：2 v / v）中3小时，取出ITO玻璃片，使用乙醇反复冲洗，用氮气吹干ITO玻璃片。然后，将ITO玻璃片浸泡在5毫升100 nm AuNPs的乙醇溶液（0.02 nM）中3小时，取出ITO玻璃片，使用超纯水反复冲洗，用氮气吹干ITO玻璃片，得到固定有100 nm AuNPs的ITO玻璃片。
[0044] （2）4条单链DNA（Tetra 1，Tetra 2，Tetra 3和Tetra 4）在TM缓冲溶液（20 mM Tris，50 mM MgCl2，pH 8.0）中以等比例混合。把所得到的混合溶液加热至95°C，并在95°C中保存5分钟，然后在5分钟内冷却至4°C，并在4°C中持续5分钟，得到四面体结构DNA。
[0045] （3）先将200μL四面体DNA溶液（1μM）滴加在100 nm AuNPs修饰的ITO玻璃片表面上，室温下在振荡器中以30 rpm/min孵育3小时。然后，用超纯水冲洗ITO玻璃片，并在微弱的氮气流中干燥。
[0046] （4）将10 μL 4‑巯基苯甲酸（1 mM）加入到20 nm AuNPs水溶液（0.02 nM）中，共孵育30 min，得到4‑巯基苯甲酸功能化修饰的20 nm AuNPs。
[0047] （5）将100μL 20 nm AuNPs滴加在AuNPs@四面体DNA修饰的ITO玻璃载玻片上，室温下在振荡器中以30 rpm/min孵育3小时，然后用超纯水冲洗ITO玻璃片的表面，并在氮气干燥，得到核‑卫星组装体SERS分子尺。
[0048] 单个核‑卫星组装体SERS分子尺在单分子水平检测四面体DNA构型变化，具体步骤如下：将吸附有核‑卫星结构组装体的ITO玻璃片放在电动平移台上，然后把200μL 50 nM 2+
Hg 溶液滴加在ITO玻璃片表面上，连续实时地观测单个核‑卫星纳米组装体的SERS光谱的变化。拉曼光谱测量时使用的激发光波长为633 nm，激光功率为29.2 μW，曝光时间为5秒，
2+
观察汞离子加入后，四面体DNA的构型发生变化。加入50 nM Hg 后，单核‑卫星纳米组装体‑1
随时间变化的SERS光谱如图2所示，其中1075 cm 处的SERS强度呈阶梯状升高（如图3所示）。SERS强度的阶梯高度约为2.16‑2.7 a.u。每一个SERS强度的阶梯对应单个四面体DNA结构改变事件。
Hg 溶液滴加在ITO玻璃片表面上，连续实时地观测单个核‑卫星纳米组装体的SERS光谱的变化。拉曼光谱测量时使用的激发光波长为633 nm，激光功率为29.2 μW，曝光时间为5秒，
2+
观察汞离子加入后，四面体DNA的构型发生变化。加入50 nM Hg 后，单核‑卫星纳米组装体‑1
随时间变化的SERS光谱如图2所示，其中1075 cm 处的SERS强度呈阶梯状升高（如图3所示）。SERS强度的阶梯高度约为2.16‑2.7 a.u。每一个SERS强度的阶梯对应单个四面体DNA结构改变事件。
[0049] 为全面了解SERS分子尺的潜在应用前景，分别在低浓度（10 nM）和高浓度（100 2+
nM）下进行SERS分子尺实验。当Hg 浓度较低时，仅观察到一次SERS强度阶梯信号（图4a和
2+ 2+ 2+
b）。其原因在于Hg 的数量较少，只能与少数未折叠的Hg 适配体结合群体，Hg 适配体结合
2+ 2+
Hg 的概率较低。与此相反，高浓度Hg 的加入，在特定时间内，会同时出现多个独立的四面体DNA结构变化事件（图4c和d），因为它所产生的SERS强度阶梯高度是单个四面体DNA结构变化事件所产生的SERS强度阶梯高度的2‑4倍。为了更好地记录单个四面体DNA结构变化事
2+
件，选择最佳Hg 浓度非常重要，因为需要在发生单个四面体DNA结构变化事件的概率和特
2+
定时间发生四面体DNA结构变化事件的个数之间进行权衡。因此，选择50 nM Hg 作为最佳浓度来驱动单个四面体DNA结构改变事件。
nM）下进行SERS分子尺实验。当Hg 浓度较低时，仅观察到一次SERS强度阶梯信号（图4a和
2+ 2+ 2+
b）。其原因在于Hg 的数量较少，只能与少数未折叠的Hg 适配体结合群体，Hg 适配体结合
2+ 2+
Hg 的概率较低。与此相反，高浓度Hg 的加入，在特定时间内，会同时出现多个独立的四面体DNA结构变化事件（图4c和d），因为它所产生的SERS强度阶梯高度是单个四面体DNA结构变化事件所产生的SERS强度阶梯高度的2‑4倍。为了更好地记录单个四面体DNA结构变化事
2+
件，选择最佳Hg 浓度非常重要，因为需要在发生单个四面体DNA结构变化事件的概率和特
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定时间发生四面体DNA结构变化事件的个数之间进行权衡。因此，选择50 nM Hg 作为最佳浓度来驱动单个四面体DNA结构改变事件。