一种光致变色可控渗透小分子交联囊泡及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种光致变色可控渗透小分子交联囊泡CSMVs及其制备方法和应用，属于小分子自组装技术领域。本发明先合成了一种偶氮苯两亲性化合物，然后进一步经交联制得光致变色可控渗透小分子交联囊泡。本发明通过光致变色偶氮苯组成的两亲分子建立基于交联小分子囊泡的控释体系，新的控释系统制备简单，稳定性增强，控制智能，在时间和空间上都显示出实时可控的渗透性，与聚合物囊泡相比，CSMVs在分子水平上由于囊泡壁的分子结构而呈现瞬时控释，在癌症、糖尿病、细菌感染等疾病的精确治疗中具有广阔的应用前景。

权利要求

1.一种偶氮苯两亲性化合物，其特征在于：以季铵盐作为亲水部分，偶氮苯作为疏水部分，结构如下

。

2.根据权利要求1所述的偶氮苯两亲性化合物，其特征在于：所述偶氮苯两亲性化合物的临界囊泡浓度为30‑55µg/mL。

3.权利要求1或2所述偶氮苯两亲性化合物的制备方法，其特征在于合成路线如下：。

4.一种光致变色可控渗透小分子交联囊泡，其特征在于：所述的小分子交联囊泡由权利要求1或2所述的偶氮苯两亲性化合物经交联而得；所述交联采用的交联剂结构如下：。

5.根据权利要求4所述的光致变色可控渗透小分子交联囊泡，其特征在于：所述的小分子交联囊泡的壳层由两个偶氮苯分子交叉排列构成。

6.根据权利要求4所述的光致变色可控渗透小分子交联囊泡，其特征在于：所述小分子交囊泡壳层厚度在2.0‑3.0 nm。

7.根据权利要求4～6任一项所述光致变色可控渗透小分子交联囊泡的制备方法，其特征在于：将交联剂加入到权利要求1或2所述两亲性化合物的水溶液中，得到光学清晰的溶液，将催化剂PPh3AuNTf2溶解于THF中，加入上述溶液中，避光，一定温度下搅拌反应，经透析、纯化制得CSMVs。

说明书

一种光致变色可控渗透小分子交联囊泡及其制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明属于小分子自组装技术领域，具体涉及一种光致变色可控渗透小分子交联囊泡及其制备方法和应用。

背景技术

[0002] 目前，因为精准治疗对疾病能精确有效的进行靶向治疗所以在临床实践中盛行。药物的可控释放对于将药物精准的输送到病变部位是必不可少的，尤其是在肿瘤治疗方
面，精准治疗可以有效地减少对健康组织的损害，并通过控制和快速释放药物来避开机体
所产生的耐药性，从而达到使用最小剂量的药物便可以治愈患者的效果。

[0003] 嵌段共聚物囊泡作为首选的药物传递的载体之一而受到了广泛的关注。囊泡是运输药物的重要载体，广泛应用于各类疾病的治疗。为了促进囊泡渗透性，已经进行了大量的
努力，包括使用刺激响应聚合物。通过外在环境的微小变化，例如pH、CO2、温度、还原电位、
光等都能触发囊泡的可控通透性。在这些刺激中，由于光具有最容易聚焦和及时控制的优
势，因此光可应用于可控释放的触发点。然而，聚合物囊泡中较厚的疏水层也会损害其通透
性，成比例地降低渗透率，渗透率的降低与膜厚度的倒数成正比。此外，较大的疏水(大分
子)链段的存在会减慢响应时间。对于精准的治疗来说，迫切需要囊泡能对外部刺激瞬时反
应，以便在病变部位快速释放药物。

发明内容

[0004] 本发明为解决上述现有技术存在的问题，首先提供了一种偶氮苯两亲性化合物，以季铵盐作为亲水部分，偶氮苯作为疏水部分，结构如下：

[0005]

[0006] 进一步的，上述偶氮苯两亲性化合物的临界囊泡浓度为30‑55μg/mL。

[0007] 本发明进一步提供了上述偶氮苯两亲性化合物的制备方法，合成路线如下：

[0008]

[0009] 本发明进一步提供了一种光致变色可控渗透小分子交联囊泡，该囊泡由上述偶氮苯两亲性化合物经交联而得。

[0010] 其中，本发明小分子交联囊泡的壳层由两个偶氮苯分子交叉排列构成。

[0011] 进一步的，本发明小分子交联囊泡壳层厚度在2.0‑3.0nm。

[0012] 进一步的，本发明小分子交联囊泡内外表面小分子单体的双键被共价键固定

[0013] 其中，交联采用的交联剂结构如下：

[0014]

[0015] 本发明进一步提供了上述光致变色可控渗透小分子交联囊泡的制备方法，将交联剂加入到上述两亲性化合物的水溶液中，得到光学清晰的溶液，将催化剂PPh3AuNTf2溶解于
THF中，加入上述溶液中，避光，一定温度下搅拌反应，经透析、纯化制得CSMVs。

[0016] 本发明的有益效果：

[0017] 本发明提供了一种以光作为触发器来控制渗透性的交联小分子囊泡(CSMVs)，囊泡的主要部分由偶氮苯单元组成，这些单元可以很容易地在反式结构和顺式结构之间转
换，进而通过极性转换使囊泡具有可控渗透性；

[0018] CSMVs的释放能力可以通过紫外光/可见光照射来控制，并且具有比经典的聚合物囊泡更快的响应时间，体外实验表明，CSMVs对通透性具有响应过程，释放携带的半胱胺，在
时间和空间水平上都能降低活性氧(ROS)，因此CSMVs响应光技术在癌症、糖尿病、细菌感染
等疾病的精确治疗中具有广阔的应用前景；

[0019] 本发明可通过光致变色偶氮苯组成的两亲分子建立基于交联小分子囊泡的控释体系，新的控释系统制备简单，稳定性增强，控制智能，在时间和空间上都显示出实时可控
的渗透性，与聚合物囊泡相比，CSMVs在分子水平上由于囊泡壁的分子结构而呈现瞬时控
释，使用CSMVs的策略大大降低了与聚合物囊泡应用相关的困难，即延迟释放、亚稳态和高
昂的制备成本。

附图说明

[0020] 图1为化合物4甲基偶氮苯核磁氢谱；

[0021] 图2为化合物1的核磁氢谱；

[0022] 图3为化合物1的核磁碳谱；

[0023] 图4为化合物1的高分辨质谱；

[0024] 图5为化合物1在水溶液中形成的小分子囊泡的透射电镜图像和粒径分布；

[0025] 图6为化合物1在水溶液中经紫外光(365nm,50mW cm‑2)照射4min后形成的未交联小分子载体的(a)粒径分布和(b)透射电镜图像；

[0026] 图7为化合物1经可见光(530nm,0.5mW cm‑2,3min)照射后在水溶液中形成囊泡的透射电镜图像；

[0027] 图8为小分子交联囊泡CSMV的透射电镜图像和粒径分布；

[0028] 图9为小分子交联囊泡CSMV在水溶液中经紫外光(365nm,50mW cm‑2)照射4min后的透射电镜图像和粒径分布；

[0029] 图10(a)为不同紫外照射时间下的控制释放曲线，(b)为显色凝胶实验，在溴百里酚蓝(0.1mg/mL)和TEA@CSMVs(3mg/mL)存在下制备聚丙烯酰胺凝胶(PAMG)，(c)为PAMG凝胶
1分钟的紫外光照射，记录不同时间点的照片，(d)为将PAMG凝胶置于不同紫外线照射时间
(0.5min、1.5min、2.5min、3.5min和4.5min)，8min后记录照片；

[0030] 图11为囊泡在人脐肠静脉内皮细胞内清除活性氧水平的荧光图像(a)紫外光照射1min后的不同时间点(左)，用流式细胞仪对ROS水平进行相应的定量分析(右)；(b)在不同
紫外线照射时间间隔下静置8min(左)，并用流式细胞仪对相应的ROS水平进行定量分析
(右)，比例尺:20μm.(c)不同紫外光照射时间下，8min内细胞内ROS水平的荧光图像，比例
尺:200μm。

具体实施方式

[0031] 本发明用到的材料和试剂如下：

[0032] 对甲苯胺、氧酮、苯胺、三乙胺(TEA)、半胱胺(Cys)、四溴化碳,N‑溴代丁二酰亚胺,(NBS),偶氮二异丁腈(AIBN),三烯丙基胺、三甘醇,2‘，7’‑二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH‑
DA)细胞计数试剂盒‑8(CCK‑8)购自中国上海坦索乐.三溴化磷和硫脲购自阿拉丁(中国上
海)。[双(三氟甲磺酰亚胺)](三苯基膦)金(PPh3AuNTf2)是从北京强生公司获得的。除非另
有说明，否则所有试剂均未经进一步纯化即可使用。所有溶剂在使用前都是新鲜蒸馏的。所
有的水实验都使用去离子水。

[0033] 实施例1

[0034] 本实施例合成了含有偶氮苯的两亲性小分子，合成路线如下：

[0035]

[0036] 甲基‑4‑亚硝基苯(化合物3)：将氧酮(1.598g,2.6mmol)溶于(40mL)水中，加入到对甲苯胺(0.139g,1.3mmol)的二氯甲烷(10mL)溶液中。将反应混合物大力搅拌1h，直至有
机相变绿。之后用3×40mL二氯甲烷提取3次，再用50mL盐水冲洗。将有机层干燥(Na2SO4)并
浓缩，得到一种绿色固体亚硝基甲苯。

[0037] (E)‑1‑苯基‑2‑(对甲苯)重氮烯(化合物4)：将亚硝基甲苯(0.145g,1.2mmol)加入苯胺(0.112g,1.2mmol)的乙酸溶液(40mL)中，在25℃下搅拌24h。用3×40mL的二氯甲烷提
取3次，然后用2×50mL的水和50mL的NaHCO3饱和水溶液洗涤。有机相在Na2SO4上干燥，过滤
和浓缩得到(E)‑1‑苯基‑2‑(对甲苯)重氮烯为橙色结晶固体(280mg,45％)。该产品未提纯，
1
直接用于下一步。H NMR(400MHz,CDCl3,δ):7.75–7.84(m,J＝5.9Hz,2H),3.91(t,J＝
5.8Hz,2H),3.61(t,J＝6.8Hz,2H),2.88(dd,J＝6.7Hz,4H),2.0(s,1H).

[0038] (E)‑1‑(4‑(溴乙基)苯基)‑2‑苯二氮(化合物5)：将N‑溴代丁二酰亚胺(1.869mg,10.5mmol)加入到化合物4(1.96g,10mmol)的偶氮二异丁腈(AIBN)(189.6mg)、四氯化碳混
合溶液中，回流反应7h，过滤浓缩得到化合物5为淡黄色固体。该产品未提纯，直接用于下一
步。

[0039] (E)‑N,N‑二烯丙基‑N‑(4‑(苯二氮基)苄基)丙烯‑2‑烯‑1‑溴化铵(化合物1)：将三烯丙胺(2.055g,15mmol)加入到化合物5(1.375g,5mmol)的丙酮(10mL)的溶液中。室温下3d
后，用旋转蒸发除去丙酮，用硅胶柱层析纯化残渣，以CH2Cl2/MeOH＝20/1～10/1为洗脱剂，
1
得到黄色粉末。H NMR(400MHz,CDCl3,δ):7.90(t,6H),7.49–7.52(q,3H),6.07–6.15(m,
3H),5.68–5.79(m,6H),5.20(s,2H),4.23(d,J＝8.0Hz,6H)。

[0040] 本实施例高产率地合成了含有偶氮苯的两亲性小分子，1H NMR、13C NMR和MS谱表征证实了两亲性小分子的化学结构，如图1‑图4所示。

[0041] 实施例2

[0042] 未交联小分子囊泡的典型制备：将实施例1得到的两亲性小分化合物1(10mg，0.02mmol)加入2.0mL去离子水中，室温旋流，然后将生成的溶液静置，观察到丁达尔效应，
这表明形成了以小分子为基础的聚集体，通过荧光释放实验研究了聚集体的内部结构，证
实该聚集体为囊泡结构，可在几分钟内自发形成未交联的小分子囊泡。

[0043] 用动态光散射(DLS)和透射电子显微镜(TEM)对这些小分子囊泡(SMV)的大小和形貌进行了表征，如图5所示，球形SMVs的直径约为100nm。紫外光照射4.5min后基本检测不到
颗粒，透射电镜图进一步证实了非交联小泡的解离，如图6所示。分离的囊泡在可见光照射
3min后可以重新组装，如图7所示，偶氮苯单元转化回反式。

[0044] 化合物1临界囊泡浓度(CVC)的测定，在一系列小瓶中加入已知数量的CH2Cl2中的‑6
尼罗红，然后蒸发CH2Cl2。选定的量使最终溶液中的尼罗河红浓度为1×10 M。在每个小瓶
‑4
中加入测定量的1溶液，并在小瓶中加入去离子水，使化合物1的浓度在2.4×10 ～1.28mM
之间。在室温下振荡过夜，测量575nm(485nm激发)的荧光发射强度。临界聚集浓度是由荧光
强度图的两个线性部分的切线的交点得到。

[0045] 实施例3

[0046] 本实施例合成了用于上述偶氮苯两亲性化合物制备囊泡的交联剂，合成路线如下：

[0047] 1，2‑双(2‑溴乙氧基)乙烷：将三甘醇(1.5g，10mmol)加入20mL无水二氯甲烷中，滴加三溴化磷(8.1g，30mmol)，回流搅拌24h，然后用40mL二氯甲烷稀释，用饱和NaHCO3水溶液
中和。将有机相，用盐水洗涤，在无水MgSO4上干燥。真空下除去溶剂，用柱层析(石油醚:乙
1
酸乙酯＝10:1)纯化得到1，2‑双(2‑溴乙氧基)乙烷黄油(1.9g，69％)。H NMR(CDCl3,
400MHz):δ3.44(t,J＝1.2Hz,4H),3.65(s,4H),3.79(t,J＝1.2Hz,4H).

[0048] 交联剂(上述合成路线中的化合物2)：将1,2‑双(2‑溴乙氧基)乙烷(304mg,1.0mmol)和硫脲(365.8mg,4.8mmol)溶于95％乙醇(30mL)中。反应混合物回流搅拌3h，然后
1M氢氧化钠溶液(20 20mL)添加并继续回流2h。用2.0M稀盐酸分离并酸化水层(pH＝1),酸
性溶液然后用石油醚提取(3×30毫升)。有机相混合，用盐水洗涤，在无水MgSO4上干燥。在
真空下除去溶剂，用柱层析(石油醚:乙酸乙酯＝3:1)纯化得到化合物2为无色油(156mg,
1
85.7％)。H NMR(CDCl3,400MHz):δ1.56(t,J＝1.6Hz,2H),2.66‑2.72(m,4H),3.60‑3.63(m,
8H).

[0049] 实施例4

[0050] 本实施例合成了光致变色可控渗透小分子交联囊泡，将交联剂(5.4mg,0.03mmol)加入到化合物1(10.0mg,0.02mmol)的H2O(2.5mL)溶液中。将混合物在室温下用手摇晃并超
声2分钟，得到光学清晰的溶液。将0.08当量的催化剂PPh3AuNTf2溶解于THF中，加入溶液中，
THF的体积小于溶液体积的2.5％。避光，100rpm,40℃搅拌20h。透析48h后，纯化纳米颗粒得
到SCMVs，然后冻干。

[0051] 用动态光散射(DLS)和透射电子显微镜(TEM)对这些小分子交联囊泡(CSMVs)的大小和形貌进行了表征，如图8所示，与未交联的小分子囊泡(SMVs)相比，交联后囊泡的球形
形态没有发生变化，而囊泡的尺寸仅略有减小。进一步分析表明，壳层厚度在2.0‑3.0nm量
级，这与两个分子交叉排列的理论长度一致。紫外光照射4min后，由于共价交联固定了结
构，CSMVs的大小和形态几乎没有变化，如图9所示，而基本上所有的反式偶氮苯物种都转化
为顺式状态。

[0052] 实施例5

[0053] 本发明CSMVs的控释性测试：以亲水性三乙胺(TEA)为模型药物，预包封于囊泡得到TEA@CSMVs，在外界紫外或可见光刺激下，测定其累积释放量，如图10a所示，在160min内，
在没有紫外线照射的情况下，CSMVs中模型药物渗透量不到2％，表明其渗透性差，紫外光照
射刺激1min后，在黑暗中放置160min时，约有40％的TEA从囊泡中释放出来，紫外光照射
4min后，在黑暗中放置160min即可达到近100％的释放率，与聚合物囊泡相比，由于CSMVs具
有特殊结构，紫外照射后释放的TEA量快速且高。

[0054] 为了分析CSMVs的时空控释，进行了染色凝胶实验，如图10b所示，制备了含有溴麝香草酚蓝(BB)和TEA@CSMVs的聚丙烯酰胺凝胶(PAMG)。在紫外线照射之前，凝胶呈现均匀的
黄色(图10c)。在紫外光照射1min后，样品在黑暗中放置16min时，在覆盖区域外观察到轻微
的蓝色。随着暗处理时间的延长，蓝色逐渐加深，128min后出现深蓝色，说明光刺激下TEA的
释放是可控的、连续的。BB是众所周知的pH指示剂，它能在碱性环境作出反应,呈现蓝色。在
紫外光照射前，TEA在CSMVs中被密封在囊泡空腔，PAMG凝胶显示出原来的黄色。在紫外光
下，由于偶氮苯的反式‑顺式转变，TEA@CSMVs的“门”打开了。TEA的释放提供了一个碱性环
境，从而触发BB的颜色变化，在辐照空间内呈现蓝色。随着黑暗中处理的时间的增加，“门”
保持打开状态，不断放出TEA。这些观察结果证实了图10a所示的累积释放结果。

[0055] 实施例6

[0056] 本发明CSMVs清除活性氧的体外通透性评价：在生物体中，低浓度的活性氧(ROS)在调节生理功能中起着至关重要的作用。然而，一旦ROS的产生超过临界水平，就可能对细
胞内的生物分子造成氧化损伤。这种损伤可能导致癌症、动脉异样硬化、糖尿病和关节炎等
疾病在时间和空间上有效地抑制过量产生的ROS有助于维持正常的生理代谢。众所周知，半
胱胺(CS)广泛存在于体内，具有很强的抗氧化能力，可以抑制过量ROS的产生。因此，将CS封
装在CSMVs(CS@CSMVs)中，基于我们提出的囊泡系统在时间和空间上的控释性，根据ROS的
衰减来评估其性能，具体通过囊泡在人脐肠静脉内皮细胞可控释放CS实验证明，测试结果
如图11所示，证明CSMVs可以应用于体外快速清除ROS。

[0057] 当加入CS@CSMVs并用紫外光照射1.0min后，细胞荧光强度随着暗处理时间的增加而逐渐降低(图11a和b)。在128min内释放一段时间后，荧光强度与正常细胞观察到的值一
样低。这种正常ROS浓度的恢复归因于紫外线照射后CS逐渐释放以减少ROS。

[0058] 将CS@CSMVs紫外照射0.5min,8min后，可见光照射关闭“门”，荧光强度较初始状态下降20％(图11c)。当紫外线触发“门”打开释放CS时，过量的ROS可能会被氧化还原反应部
分抵消。随着紫外光照射时间的进一步延长，可观察到荧光变弱。紫外光照射3.5min后，荧
光信号基本消失。定量结果显示，在这种情况下，荧光强度(ROS)下降了95％以上，使ROS浓
度降低到正常细胞的水平。这表明我们的系统能够高效地清除细胞内ROS。以上结果表明，
CS@CSMVs在体外能及时控制CS的瞬时释放，以对抗ROS。

[0059] 以上内容是结合具体/优选的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。在不脱离本发明构思的前提下，其还可以对这些
已描述的实施方式做出若干替代或变型，而这些替代或变型方式都应当视为属于本发明的
保护范围。