蛋白质UGT236及其编码基因与应用

摘要

本发明公开了蛋白质UGT236及其编码基因与应用。蛋白质UGT236为氨基酸序列是SEQ ID NO:2所示的蛋白质。实验证明，蛋白质UGT236具有糖基转移酶的活性，可高效的将根皮素催化生成根皮苷，即蛋白质UGT236可用于以根皮素为底物制备根皮苷。本发明具有重要的应用价值。

权利要求

1.蛋白质UGT236的应用，为如下c1）或c2）：c1）作为糖基转移酶的应用；

c2）在制备具有糖基转移酶功能的产品中的应用；

所述糖基转移酶具有将根皮素催化生成根皮苷的活性且不易生成副产物；

所述蛋白质UGT236的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.编码权利要求1中所述蛋白质UGT236的核酸分子的应用，为如下c1）或c2）：c1）作为糖基转移酶的应用；

c2）在制备具有糖基转移酶功能的产品中的应用；

所述糖基转移酶具有将根皮素催化生成根皮苷的活性且不易生成副产物。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述核酸分子为SEQ ID NO:1所示的DNA分子。

4.权利要求1中所述蛋白质UGT236的应用，为如下c3）或c4）：c3）在生产根皮苷中的应用；

c4）在制备用于生产根皮苷的产品中的应用；

所述生产根皮苷是以根皮素作为底物；

所述生产根皮苷时不易生成副产物。

5.编码权利要求1中所述蛋白质UGT236的核酸分子的应用，为如下c3）或c4）：c3）在生产根皮苷中的应用；

c4）在制备用于生产根皮苷的产品中的应用；

所述生产根皮苷是以根皮素作为底物；

所述生产根皮苷时不易生成副产物。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述核酸分子为SEQ ID NO:1所示的DNA分子。

7.权利要求1中所述蛋白质UGT236的应用，为如下c5）或c6）：c5）在催化根皮素中的应用；

c6）在制备用于催化根皮素的产品中的应用。

8.编码权利要求1中所述蛋白质UGT236的核酸分子的应用，为如下c5）或c6）：c5）在催化根皮素中的应用；

c6）在制备用于催化根皮素的产品中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于：所述核酸分子为SEQ ID NO:1所示的DNA分子。

说明书

蛋白质UGT236及其编码基因与应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及蛋白质UGT236及其编码基因与应用。

背景技术

[0002] 根皮苷是一种二氢查耳酮的2’‑葡萄糖苷，广泛存在于苹果根、茎、叶和果实等组织中。最近发现壳斗科石柯属常绿植物多穗石柯也含有丰富的根皮苷，幼叶中含量高达3.1％。近年来研究发现，根皮苷具有多种药理活性，如抗氧化、抗高血糖和并发症、降脂、抗炎、抗肿瘤、保护视网膜、保护肝脏、美白、杀菌等多种活性，这预示着根皮苷在医药、美容、农业等多个领域都具有潜在的开发价值。

[0003] 根皮苷目前主要从苹果树枝或多穗石柯等植物中提取，容易受到资源等方面的限制，且植物中存在类似的化合物，分离纯化流程冗长，同时还容易造成环境污染。随着合成生物学技术的发展，从植物中挖掘根皮苷生物合成途径的关键酶基因，在异源微生物中重构其生物合成途径来直接生产根皮苷成为一种最具前景的方式。根皮苷生物合成的最后关键步骤是根皮素在特定糖基转移酶的催化下，在2’‑OH上加上葡萄糖，最后生成根皮苷。目前已从苹果和其它物种中鉴定了多个糖基转移酶能催化根皮素生成根皮苷，但多存在活性偏低且容易生成副产物的缺点，这也限制了其在根皮苷生物合成中的应用。从植物中鉴定或通过酶工程改造获得活性更高且更专一的糖基转移酶，是目前根皮苷生物合成研究中热点。

[0004] 菘蓝(Isatis indigotica Fort.)为十字花科菘蓝属两年生草本植物。菘蓝根为板蓝根、叶为大青叶来源之一，均为常用中药，具有清热解毒、凉血利咽之功效，临床上常用于流行性感冒、流行性腮炎、流行性乙型脑炎、急慢性肝炎、带状疱疹等疾病的治疗。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供一种可以将根皮素催化生成根皮苷的糖基转移酶。

[0006] 本发明提供的糖基转移酶，名称为蛋白质UGT236，来源于菘蓝。所述蛋白质UGT236可为如下a1)或a2)或a3)：

[0007] a1)氨基酸序列是SEQ ID NO:2所示的蛋白质；

[0008] a2)在SEQ ID NO:2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

[0009] a3)将a1)或a2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有将根皮素催化生成根皮苷的糖基转移酶活性的蛋白质。

[0010] 其中，SEQ ID NO:2由482个氨基酸残基组成。

[0011] 为了使a1)中的蛋白质便于纯化，可在SEQ ID NO:2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

[0012] 表1.标签的序列

[0013]标签 残基 序列
Poly‑Arg 5‑6(通常为5个) RRRRR
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep‑tag II 8 WSHPQFEK
c‑myc 10 EQKLISEEDL

[0014] 上述a3)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

[0015] 上述a3)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

[0016] 上述a3)中的蛋白质的编码基因可通过将SEQ ID NO:1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

[0017] 编码所述蛋白质UGT236的核酸分子也属于本发明的保护范围。

[0018] 所述编码所述蛋白质UGT236的核酸分子具体可为如下b1)或b2)或b3)或b4)所示的DNA分子：

[0019] b1)编码区是SEQ ID NO:1所示的DNA分子；

[0020] b2)核苷酸序列是SEQ ID NO:1所示的DNA分子；

[0021] b3)与b1)或b2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，来源于菘蓝且编码所述蛋白质UGT236的DNA分子；

[0022] b4)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，来源于菘蓝且编码所述蛋白质UGT236的DNA分子。

[0023] 其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

[0024] 其中，SEQ ID NO:1由1449个核苷酸组成，SEQ ID NO:1的核苷酸编码SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

[0025] 本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码所述蛋白质UGT236的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的所述蛋白质UGT236的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码所述蛋白质UGT236，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

[0026] 这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质UGT236的核苷酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

[0027] 含有上述任一所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物也属于本发明的保护范围。

[0028] 所述含有上述任一所述核酸分子的重组载体可为在表达载体的多克隆位点插入SEQ ID NO:1所示的DNA分子得到的重组质粒。

[0029] 所述含有上述任一所述核酸分子的重组载体具体可为实施例提及的重组质粒pET28a‑HIS‑MBP‑UGT236。所述重组质粒pET28a‑HIS‑MBP‑UGT236为将pET28a‑HIS‑MBP原核表达载体的限制性内切酶BamHI识别序列和限制性内切酶NotI识别序列间的DNA小片段替换为核苷酸序列是SEQ ID NO:1所示的DNA分子，得到的重组质粒。所述pET28a‑HIS‑MBP原核表达载体(环形)的核苷酸序列可如SEQ ID NO:3所示。

[0030] 所述含有上述任一所述核酸分子的重组微生物可为将含有上述任一所述核酸分子的重组载体导入出发微生物得到的重组菌。

[0031] 所述出发微生物可为大肠杆菌。所述大肠杆菌具体可为E.coli Rossetta(DE3)。

[0032] 所述含有上述任一所述核酸分子的重组微生物具体可为实施例提及的重组菌甲。

[0033] 本发明还保护上述任一所述蛋白质UGT236，或，上述任一所述核酸分子，或，含有上述任一所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物，的应用，可为如下c1)或c2)：

[0034] c1)作为糖基转移酶的应用；

[0035] c2)在制备具有糖基转移酶功能的产品中的应用；

[0036] 所述糖基转移酶具有将根皮素催化生成根皮苷的活性。

[0037] 本发明还保护上述任一所述蛋白质UGT236，或，上述任一所述核酸分子，或，含有上述任一所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物，的应用，可为如下c3)或c4)：

[0038] c3)在生产根皮苷中的应用；

[0039] c4)在制备用于生产根皮苷的产品中的应用。

[0040] 上述应用中，所述生产根皮苷是以根皮素作为底物。

[0041] 本发明还保护上述任一所述蛋白质UGT236，或，上述任一所述核酸分子，或，含有上述任一所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物，的应用，可为如下c5)或c6)：

[0042] c5)在催化根皮素中的应用；

[0043] c6)在制备用于催化根皮素的产品中的应用。

[0044] 实验证明，蛋白质UGT236具有糖基转移酶的活性，可高效的将根皮素催化生成根皮苷，即蛋白质UGT236可用于以根皮素为底物制备根皮苷。本发明具有重要的应用价值。

附图说明

[0045] 图1为UGT236结构功能域预测分析。

[0046] 图2为UGT系统进化树(邻接法)分析。

[0047] 图3为重组质粒pET28a‑HIS‑MBP‑UGT236的构建示意图和表达产物的SDS‑PAGE。

[0048] 图4为实施例2中的UPLC检测结果。

[0049] 图5为实施例2中的Q‑TOF‑MS检测结果。

具体实施方式

[0050] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

[0051] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

[0052] 下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

[0053] 以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

[0054] E.coli Rossetta(DE3)感受态、pEASY‑Uni Seamless Cloning and Assembly Kit、DNA凝胶回收试剂盒均为北京全式金生物技术有限公司的产品。PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit为宝生物(大连)工程有限公司(TaKaRa)公司的产品。限制性内切酶和Prestained Protein Ladder为纽英伦(NEB)生物技术北京有限公司的产品。KOD‑Plus‑Neo高保真PCR酶为东洋纺(上海)生物科技有限公司的产品。IPTG(Isopropyl‑β‑D‑thiogalactoside)和PMSF(Phenylmethanesulfonyl fluoride)为美国Sigma公司的产品。

[0055] 引物由上海生工生物工程有限公司合成。测序由北京睿博生物技术有限公司完成。

[0056] 下述实施例中的引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

[0057] 下述实施例中的测序均由北京擎科生物技术有限公司完成。

[0058] pET28a‑HIS‑MBP原核表达载体(环形)的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

[0059] 实施例1、重组糖基转移酶的制备

[0060] 一、来源于菘蓝的糖基转移酶的编码基因(UGT236基因)的获得

[0061] 本发明的发明人经过大量实验发现了菘蓝中糖基转移酶的编码基因(UGT236基因)。UGT236基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。UGT236基因编码蛋白质UGT236，蛋白质UGT236的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

[0062] 将UGT236基因和蛋白质UGT236序列用NCBI数据库中的BLAST程序在Non‑redundant GenBank CDS translation+PDB+Swissprot数据库中进行核苷酸同源性检索。

[0063] UGT236的结构功能域预测分析见图1，其中A为保守结构域预测，B为PSPG位置，C为PSPGbox序列。

[0064] UGT系统进化树分析(邻接法)见图2，其中C2为phloretin  2‑O glycosyltransferase，UGT236与已鉴定的C2 UGT聚为一类。

[0065] 结果表明，在氨基酸水平上蛋白质UGT236与其它物种中的UGT有较高的同源性，同时具有典型的活性位点结构域。

[0066] 二、重组质粒pET28a‑HIS‑MBP‑UGT236的构建

[0067] 重组质粒pET28a‑HIS‑MBP‑UGT236的结构示意图见图3中A。

[0068] 1、提取菘蓝毛状根的总RNA，然后采用PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit进行反转录，得到菘蓝毛状根的cDNA。

[0069] 2、以菘蓝毛状根的cDNA为模板，采用引物F：5’‑AGGGGCCCGAATTCGGATCCATGAAGATCGAGCTCGTG‑3’(下划线为限制性内切酶BamHI的酶切位点)和引物R：5’‑GTGGTGCTCGAGTGCGGCCGCCTAGACCACAACATTCTCGATC‑3’(下划线为限制性内切酶NotI的酶切位点)组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

[0070] 反应体系为20μL，由5μL KOD Buffer(10×)(KOD‑Plus‑Neo高保真PCR酶自带的组件)、5μL dNTP(浓度为2.0mmol/L)、2μL引物F水溶液(浓度为10μmol/L)、2μL引物R水溶液(浓度为10μmol/L)、1μL KOD‑Plus‑Neo高保真PCR酶、2μL菘蓝毛状根的cDNA水溶液(含20ng菘蓝毛状根的cDNA)和3μL无菌双蒸水组成。

[0071] 反应程序为：94℃预变性2min；98℃变性10s，55℃退火30s，68℃延伸1min，34个循环；68℃延伸7min。

[0072] 3、取步骤2得到的PCR扩增产物，进行琼脂糖凝胶电泳，然后利用DNA凝胶回收试剂盒回收约1500bp的DNA片段。

[0073] 4、取pET28a‑HIS‑MBP原核表达载体，用限制性内切酶BamHI和NotI酶切，利用DNA凝胶回收试剂盒回收约6.5kb的载体骨架。

[0074] 5、将步骤3得到的DNA片段和步骤4得到的载体骨架采用pEASY‑Uni Seamless Cloning and Assembly kit进行连接，得到重组质粒pET28a‑HIS‑MBP‑UGT236。

[0075] 将重组质粒pET28a‑HIS‑MBP‑UGT236进行测序。根据测序结果，对重组质粒pET28a‑HIS‑MBP‑UGT236进行结构描述如下：将pET28a‑HIS‑MBP原核表达载体的限制性内切酶BamHI识别序列和限制性内切酶NotI识别序列间的DNA小片段替换为核苷酸序列是SEQ ID NO:1所示的DNA分子。

[0076] 三、重组糖基转移酶的表达

[0077] 1、将重组质粒pET28a‑HIS‑MBP‑UGT236转化E.coli Rossetta(DE3)感受态细胞，得到重组菌甲。

[0078] 2、将重组菌甲的单克隆接种于5mL LB液体培养基(含50μg/mL卡那霉素)，37℃、250rpm振荡培养过夜，得到培养菌液。

[0079] 3、完成步骤2后，将培养菌液接种(接种比为1:100)于500mL LB液体培养基(含50μg/mL卡那霉素)，37℃、250rpm振荡培养至OD600nm值为0.6左右，加入IPTG并使其在体系中的浓度为1mM，然后16℃、250rpm振荡培养16h，4℃、3000g离心10min，收集菌体。

[0080] 4、取步骤3得到的菌体，用预冷纯水洗涤2次，然后每50mL菌液离心得到的菌体加入3mL PB Buffer重悬，得到重悬液。

[0081] PB Buffer：含1mMEDTA、1mMPMSF、10％(v/v)甘油的pH7.4、50mM Tris‑Cl缓冲液。

[0082] 5、完成步骤4后，取所述重悬液，采用细胞破碎仪超声破碎(10KG频率下间歇5s，破碎5s，共破碎5min)，然后4℃、13000rpm离心15min，收集上清液，上清液即为即重组菌甲的粗酶液(经IPTG诱导)。

[0083] 按照上述方法，将重组质粒pET28a‑HIS‑MBP‑UGT236替换为pET28a‑HIS‑MBP原核表达载体，得到重组菌乙(作为对照菌)，然后进一步得到重组菌乙的粗酶液。

[0084] 按照上述方法，将步骤3替换为步骤3X，其它步骤均不变，得到重组菌甲的粗酶液(未经IPTG诱导)。步骤3X为：将培养菌液接种(接种比为1:100)于500mL LB液体培养基(含50μg/mL卡那霉素)，37℃、250rpm振荡培养至OD600nm值为0.6左右，然后16℃、250rpm振荡培养16h，4℃、5000g离心10min，收集菌体。

[0085] 将重组菌甲的粗酶液(经IPTG诱导)、重组菌乙的粗酶液和重组菌甲的粗酶液(未经IPTG诱导)进行SDS‑PAGE。

[0086] 结果见图3中B(M为Prestained Protein Ladder，V+为重组菌乙的粗酶液，236‑为重组菌甲的粗酶液(未经IPTG诱导)，236+为重组菌甲的粗酶液(经IPTG诱导))。结果表明，重组菌甲的粗酶液(经IPTG诱导)出现一条明显的特异蛋白质表达条带，对应分子量为100kD，与预期大小一致；重组菌甲的粗酶液(未经IPTG诱导)和重组菌乙的粗酶液中则没有分子量为100kDa的条带。

[0087] 重组菌甲的粗酶液(经IPTG诱导)即含有重组糖基转移酶。

[0088] 实施例2、重组糖基转移酶催化根皮素生成根皮苷

[0089] 待测溶液为实施例1制备的重组菌甲的粗酶液(经IPTG诱导)或重组菌乙的粗酶液。

[0090] 1、配制反应体系。反应体系由300μL待测溶液、1.5μL根皮素溶液(溶剂为DMSO，浓度为40mM)和3μL尿苷二磷酸‑β‑O‑D‑葡萄糖溶液(溶剂为超纯水，浓度为40mM)组成。

[0091] 2、取步骤1配制的反应体系，30℃、400rpm反应8h。

[0092] 3、取完成步骤2的体系，加入2倍体积纯甲醇(目的为终止反应)，振荡提取。

[0093] 4、完成步骤3后，13000rpm离心15min，收集上清。

[0094] 5、完成步骤4后，取所述上清，用孔径为0.22μM的PTFE滤膜过滤，收集滤液。

[0095] 6、将滤液和对照品进行UPLC分析。

[0096] 对照品为根皮素、三叶苷和根皮苷的混合物。

[0097] UPLC条件为：色谱柱：ACQUITY UPLC HSST3(2.1mm×100mm，1.7μm)；流动相：含0.1％甲酸的乙腈(A)：含0.1％甲酸的水(B)＝12：88；流速：0.5mL/min；检测波长为285nm，柱温为40℃，进样量为2μL。

[0098] 实验结果见图4(空载体为重组菌乙的粗酶液，UGT236为重组菌甲的粗酶液(经IPTG诱导)，底物为根皮素，P1为根皮素，P2为三叶苷，P3为根皮苷)。结果表明，对照品中根皮苷在UPLC中的保留时间为3.41min，根皮素在UPLC中的保留时间为6.53min；重组菌甲的粗酶液(经IPTG诱导)反应后收集的滤液在保留时间为3.41min处存在特征峰；重组菌乙的粗酶液反应后收集的滤液则没有检测到特征峰。

[0099] 7、利用Q‑TOF‑MS对重组菌甲的粗酶液(经IPTG诱导)反应后收集的滤液和对照品进行定性分析。

[0100] 质谱条件为：Waters Xevo G2‑S QTOF‑MS质谱采用电喷雾离子化源(ESI)，采用负离子检测模式；扫描范围m/z 50～1500，扫描时间0.2s，毛细管电压2000V，锥孔电压40V，除溶剂气体氮气900L/h，除溶剂温度450℃，离子源温度100℃。

[0101] 重组菌甲的粗酶液(经IPTG诱导)反应后收集的滤液的分析结果见图5中A。

[0102] 对照品中的分析结果见图5中B。

[0103] 结果表明，重组菌甲的粗酶液(经IPTG诱导)反应后收集的滤液中，产物分子离子‑ ‑峰为m/z435.1382[M‑H] ，与底物根皮素m/z 273.0810[M‑H]分子量相差162，说明产物为在根皮素的基础上加了一分子葡萄糖；同时和对照品根皮苷出峰时间、分子量和碎片离子均‑
一致，说明产物m/z435.1382[M‑H]是根皮苷。

[0104] 上述结果表明，实施例1制备的重组菌甲的粗酶液(经IPTG诱导)具有糖基转移酶的活性，其可将根皮素催化生成根皮苷。