本发明公开了一种基于物理整粒的自成形血小板纳米囊泡及其制备方法，属于组织修复生物材料技术领域。本发明公开的一种基于物理整粒的自成形血小板纳米囊泡及其制备方法，通过对血小板进行纳米化处理，使其具有均一的粒径和更强的组织穿透力，并在损伤组织释放生长因子，促进多类型组织细胞的分裂和增殖及细胞外基质的再生，从而达到组织修复的效果，为完全生物来源的材料设计提供新思路。
1.一种基于物理整粒的自成形血小板纳米囊泡的制备方法，其特征在于，具体操作如下：将血小板原料经过温和的物理挤出方式纳米化处理，并制成制剂；所述温和的物理挤出方式为超声整粒后20‑30℃恒温下纳米级别孔径挤出；
所述血小板原料为机采PRP成品、梯度分次离心的浓缩血小板或密度梯度离心的浓缩血小板；
所述挤出方式为人力手工注射器挤出、微量泵定速注射器挤出或微流控芯片挤出；
所述制剂类型为血小板纳米囊泡悬液、复合血小板纳米囊泡凝胶、细胞复合血小板纳米囊泡悬液或生物材料表面包被血小板纳米囊泡；
所述纳米级别孔径为滤过孔径100‑500纳米的MCE膜、PVDF膜、PES膜或输出通道内径
所述梯度分次离心的浓缩血小板进行100纳米孔径的PES膜人力手工挤出NEP悬液，具体步骤如下：（1）将含抗凝剂静脉血混匀后，置于50mL离心管，200g，10min离心；
（2）取上层血小板层，移至新离心管，再次200g，10min离心；
（4）2号变幅杆，开2s，关3s，超声10min，控制温度20℃；
（5）恒温模块加热下在20℃条件下，经100纳米孔径的PES膜进行人力手工恒速挤出，挤出速度为0.1‑1.0mL/s，无菌堵头封闭封口；
（6）将获得的NEP悬液装入双层无菌纸塑袋，并贴信息标签，4℃暂时保存或在悬液中加入冻存液后‑80℃长期保存；所述冻存液为10% DMSO+90% FBS；
所述机采PRP成品进行200纳米孔径的PVDF膜微量泵定速注射器挤出NEP凝胶制剂，具体步骤如下：（1）将机采PRP成品混匀后，置于50mL离心管，200g，10min离心；
（3）2号变幅杆，开2s，关3s，超声10min，控制温度25℃；
（4）恒温模块加热下在25℃条件下，经200纳米孔径的PVDF膜进行微量泵定速注射器挤出，挤出速度为0.1‑1.0mL/s，无菌堵头封闭封口；
（5）将NEP加入1‑10%氯化钙溶液，混匀后静置1‑10min，凝固为凝胶；
（6）将获得的NEP凝胶装入双层无菌纸塑袋，并贴信息标签，4℃保存；
所述密度梯度离心的浓缩血小板进行500纳米孔径的微流控芯片挤出NEP并包被于支架，具体步骤如下：（1）将含抗凝剂静脉血混匀后，10mL置于50mL离心管内的20mL的75% Percoll液上，
（2）取血小板层，移至新离心管，再次200g，10min离心；
（4）2号变幅杆，开2s，关3s，超声10min，控制温度30℃；
（5）恒温模块加热下在30℃条件下，微流控芯片挤出，输出通道内径500nm，流速0.1‑
（6）将NEP与3D打印的ECM/GelMA支架20‑24℃共孵育24h；所述ECM/GelMA支架的制备方法如下：2% ECM、10% GelMA及0.25% LAP，混合后3D光固化打印，光固化参数：405nm，10‑
（7）将被NEP包被的支架装入双层无菌纸塑袋，并贴信息标签，4℃保存；
所述梯度分次离心的浓缩血小板进行100纳米孔径的PES膜人力手工挤出NEP复合中性粒细胞悬液，具体步骤如下：（1）将含抗凝剂静脉血混匀后，置于50mL离心管，200g，10min离心；
（2）取上层血小板层，移至新离心管，再次200g，10min离心；
（4）2号变幅杆，开2s，关3s，超声10min，控制温度20℃；
（5）恒温模块加热下在20℃条件下，经100纳米孔径的PES膜进行人力手工恒速挤出，挤出速度为0.1‑1.0mL/s；
（6）将NEP与中性粒细胞按10：1数量比进行微重力培养2h，离心后调节细胞浓度至10 ‑6
（7）将获得的NEP复合中性粒细胞悬液装入双层无菌纸塑袋，并贴信息标签，4℃暂时保存或在悬液中加入冻存液后‑80℃长期保存；所述冻存液为10% DMSO+90% FBS。
一种基于物理整粒的自成形血小板纳米囊泡及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及组织修复生物材料技术领域，更具体的说是涉及一种基于物理整粒的自成形血小板纳米囊泡及其制备方法。
背景技术
[0002] 炎症、创伤等原因导致的组织损伤可导致组织器官功能障碍甚至功能丧失，是严重危害生命健康和降低生活质量的临床常见病和多发病，也是引起继发性感染和死亡的最重要原因之一。目前，组织损伤修复材料已成为生物材料研发的重要方向之一。
[0003] 从上世纪80年代开始，富血小板血浆开始应用于临床治疗，90年代富血小板血浆的制作工艺得到了极大的改进，能制作出成分较为单一的富血小板血浆。在颌面外科，创伤外科，整形外科等临床治疗中应用广泛，其中在创伤外科主要用于骨折不愈合或延迟愈合、股骨头坏死、软骨损伤或软组织损伤、退行性膝关节病变、脊柱病变、半月板撕裂、韧带损伤及难愈创面等。基于富血小板血浆的组织再生技术安全性高、疗效确切，我国目前已经在上海六院、上海华山医院、上海市中山医院、重庆医科大学附属第一医院、华西医院、湖北同济医院、广东省人民医院等数十家国内知名三甲医院先后开展该方面技术的临床研究与应用。
[0004] 然而，由于血小板直径尚处于细胞级别，其组织穿透性及质量均一性尚不理想；目前血小板来源材料的专利研发仍处于对于血小板组成物质的利用来研发材料，而没有使血小板在组成不变的基础上改变其性质的方法。申请号为CN110267667A的专利公开了一种制备含生长因子的血小板释放物的方法，其活化血小板并提取其释放物用于治疗。申请号为CN202010779249.2的专利公开了一种基于纳米材料的血小板抗体检测方法和血小板保存方法，其将血小板膜包被于PLGA纳米颗粒，用于抗体检测和血小板保存。诸如此类的专利利用了部分血小板成分，但破坏了血小板的天然结构，无法充分发挥血小板的生物功能；基于此，仍需要一种更加温和和可控的方式制备血小板来源的纳米材料。
[0005] 因此，提供一种基于物理整粒的自成形血小板纳米囊泡及其制备方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
[0006] 有鉴于此，本发明提供了一种基于物理整粒的自成形血小板纳米囊泡(Nano‑Enriched Platelets，NEP)及其制备方法，将血小板原料经过温和的物理挤出方式纳米化处理，使其具有均一的粒径和更强的组织穿透力，并保留原有的血小板膜功能和生长因子释放能力。
[0007] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0008] 一种基于物理整粒的自成形血小板纳米囊泡的制备方法，具体操作如下：将血小板原料经过温和的物理挤出方式纳米化处理，并制成制剂；所述温和的物理挤出方式为超声整粒后20‑30℃恒温下纳米级别孔径挤出。
[0009] 进一步，所述超声条件为2号变幅杆，开2s，关3s，超声10min。
[0010] 进一步，所述血小板原料为机采富血小板血浆(Platelet‑Rich Plasma，PRP)成品、梯度分次离心的浓缩血小板或密度梯度离心的浓缩血小板。
[0011] 优选地，采用梯度分次离心的浓缩血小板作为血小板来源。
[0012] 进一步，所述挤出方式为人力手工注射器挤出、微量泵定速注射器挤出或微流控芯片挤出。
[0013] 进一步，所述制剂类型为血小板纳米囊泡悬液、复合血小板纳米囊泡凝胶、细胞复合血小板纳米囊泡悬液或生物材料表面包被血小板纳米囊泡。
[0014] 进一步，所述纳米级别孔径为滤过孔径100‑500纳米的MCE膜、PVDF膜、PES膜或输出通道内径100‑500nm的微流控芯片。
[0015] 优选地，采用100纳米孔径的PES膜作为挤出膜材料。
[0016] 进一步，采用上述方法制备得到的血小板纳米囊泡。
[0017] 进一步，将血小板原料经纳米级别孔径膜进行挤出处理，并制备成特定形态的制剂后施用于受损组织。施用方式包括静脉注射、原位注射或原位种植。
[0018] 进一步，所述的血小板纳米囊泡在制备治疗组织损伤药物中的应用。
[0019] 经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种基于物理整粒的自成形血小板纳米囊泡及其制备方法，通过物理挤出将血小板纳米化，在保留血小板膜功能和生长因子释放能力的基础上提高粒径均一性和组织穿透力。相比现有用于组织修复的血小板来源药物或材料，本发明显著的进步在于：1)将血小板纳米化，提高其组织穿透力和细胞亲和力，易于到达目标组织和细胞；2)采用温和的物理挤出方式，保留血小板膜完整性，从而保证血小板膜功能；3)保留多种高浓度生长因子，含量比例与正常血小板相符，发挥最佳协同作用；4)可制成液态、凝胶等多种制剂形式，有利于保存和按需施用。因此，基于物理整粒的自成形血小板纳米囊泡可在不改变组分条件下将血小板纳米化，应用于组织修复，具有明确的治疗效果。
附图说明
[0020] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
[0021] 图1附图为本发明挤出前及挤出后血小板的冷冻透射电镜图；
[0022] 其中，A为挤出前；B为挤出后；
[0023] 图2附图为本发明挤出后血小板纳米囊泡的粒径分布；
[0024] 图3附图为本发明PRP、PRP+Ca2+、NEP、NEP+Ca2+的EGF释放的ELISA测定；
[0025] 图4附图为本发明PRP、PRP+Ca2+、NEP、NEP+Ca2+的TGF‑β1释放的ELISA测定；
[0026] 图5附图为本发明4℃条件下保存3周内NEP内EGF含量变化的ELISA测定；
[0027] 图6附图为本发明12小时PRP和NEP对MSC细胞活性及增殖影响的CCK‑8测定；
[0028] 图7附图为本发明5天内PRP和NEP对MSC细胞活性及增殖影响的MTT测定；
[0029] 图8附图为本发明不同组别的HUVEC成环试验；
[0030] 图9附图为本发明2周内对照组、PRP施用组、NEP施用组的创伤面积示意图；
[0031] 图10附图为本发明2周内对照组、PRP施用组、NEP施用组的创伤面积变化统计图。
具体实施方式
[0032] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0033] 实施例1梯度分次离心的浓缩血小板进行100纳米孔径的PES膜人力手工挤出NEP悬液
[0034] (1)将含抗凝剂静脉血混匀后，置于50mL离心管，200g，10min离心。
[0035] (2)取上层血小板层，移至新离心管，再次200g，10min离心。
[0036] (3)取下层富集层，置于新离心管。
[0037] (4)2号变幅杆，开2s，关3s，超声10min，控制温度20℃。
[0038] (5)恒温模块加热下在20℃条件下，经100纳米孔径的PES膜进行人力手工恒速挤出，挤出速度为0.1‑1.0mL/s，无菌堵头封闭封口。
[0039] (6)将获得的NEP悬液装入双层无菌纸塑袋，并贴信息标签，4℃暂时保存或在悬液中加入冻存液(10％DMSO+90％FBS)后‑80℃长期保存。
[0040] 实施例2机采PRP成品进行200纳米孔径的PVDF膜微量泵定速注射器挤出NEP凝胶制剂
[0041] (1)将机采PRP成品(Trima血细胞分离机)混匀后，置于50mL离心管，200g，10min离心。
[0042] (2)取下层富集层，置于新离心管。
[0043] (3)2号变幅杆，开2s，关3s，超声10min，控制温度25℃。
[0044] (4)恒温模块加热下在25℃条件下，经200纳米孔径的PVDF膜进行微量泵定速注射器挤出，挤出速度为0.1‑1.0mL/s，无菌堵头封闭封口。
[0045] (5)将NEP加入1‑10％氯化钙溶液，混匀后静置1‑10min，凝固为凝胶。
[0046] (6)将获得的NEP凝胶装入双层无菌纸塑袋，并贴信息标签，4℃保存。
[0047] 实施例3梯度密度离心的浓缩血小板进行500纳米孔径的微流控芯片挤出NEP并包被于支架
[0048] (1)将含抗凝剂静脉血混匀后，10mL置于50mL离心管内的20mL的75％Percoll液上，400g，30min离心。
[0049] (2)取血小板层，移至新离心管，再次200g，10min离心。
[0050] (3)取下层富集层，置于新离心管。
[0051] (4)2号变幅杆，开2s，关3s，超声10min，控制温度30℃。
[0052] (5)恒温模块加热下在30℃条件下，微流控芯片挤出，输出通道内径500nm，流速0.1‑1.0mL/s，无菌堵头封闭封口。
[0053] (6)将NEP与3D打印的ECM/GelMA支架(2％ECM、10％GelMA及0.25％LAP，混合后3D光固化打印，光固化参数：405nm，10‑30W，20‑40s)20‑24℃共孵育24h。
[0054] (7)将被NEP包被的支架装入双层无菌纸塑袋，并贴信息标签，4℃保存。
[0055] 实施例4梯度分次离心的浓缩血小板进行100纳米孔径的PES膜人力手工挤出NEP复合中性粒细胞悬液
[0056] (1)将含抗凝剂静脉血混匀后，置于50mL离心管，200g，10min离心。
[0057] (2)取上层血小板层，移至新离心管，再次200g，10min离心。
[0058] (3)取下层富集层，置于新离心管。
[0059] (4)2号变幅杆，开2s，关3s，超声10min，控制温度20℃。
[0060] (5)恒温模块加热下在20℃条件下，经100纳米孔径的PES膜进行人力手工恒速挤出，挤出速度为0.1‑1.0mL/s。
[0061] (6)将NEP与中性粒细胞按10：1数量比进行微重力培养(Synthecon)2h，离心后调4 6
节细胞浓度至10‑10/mL。
[0062] (7)将获得的NEP复合中性粒细胞悬液装入双层无菌纸塑袋，并贴信息标签，4℃暂时保存或在悬液中加入冻存液(10％DMSO+90％FBS)后‑80℃长期保存。
[0063] 试验例1基于物理整粒的自成形血小板纳米囊泡的物理表征
[0064] (1)将实施例1挤出前的血小板与挤出后的血小板进行冷冻电镜拍摄，结果见图1。图1结果显示挤出前血小板粒径为微米级，挤出后粒径约100纳米，且大小较为均一。
[0065] (2)将实施例1的NEP样品置于马尔文激光粒度仪进行粒径测试，结果见图2。图2结果显示单峰粒径约100纳米，表明NEP样品粒径均一性高。
[0066] 试验例2基于物理整粒的自成形血小板纳米囊泡的活化度及稳定性分析[0067] (1)将PRP和实施例1的NEP加入10％氯化钙溶液，并用ELISA试剂盒(江苏晶美)测定EGF(皮肤生长因子，Epidermal Growth Factor)和TGF‑β1(转化生长因子，Transforming Growth Factor‑β1)的定量数据，结果见图3‑图4。图3‑图4结果显示NEP具有与钙离子活化的PRP相当的EGF和TGF‑β1释放能力，表明NEP具有较高的生长因子释放活性。
[0068] (2)将实施例1的NEP在4℃保存3周，每周用ELISA试剂盒测定EGF的定量数据，结果见图5。图5结果显示2周内EGF释放能力无显著下降，表明NEP具有较高的稳定性。
[0069] 试验例3基于物理整粒的自成形血小板纳米囊泡的细胞毒性及增殖试验[0070] (1)将PRP和实施例1的NEP分别按梯度浓度(0、5、10、25、50、100μg/mL)与MSC共培养12h，并用CCK‑8试剂盒测定细胞活力及增殖数据，结果见图6。图6结果显示实验浓度内PRP与NEP均具有明显的生长促进作用，且无显著毒性，其中NEP优于PRP。
[0071] (2)将PRP和实施例1的NEP按25μg/mL与MSC共培养5天，并用MTT试剂盒测定细胞活力及增殖数据，结果见图7。图7结果显示PRP与NEP均具有明显的生长促进作用，其中NEP优于PRP。
[0072] (3)将对照组(不加PRP或NEP处理)、PRP组和NEP组的HUVEC进行成环试验，并进行镜下摄像，结果见图8。图8结果显示PRP与NEP均具有促成环作用，其中NEP优于PRP。
[0073] 试验例4基于物理整粒的自成形血小板纳米囊泡对皮肤创伤的疗效验证[0074] (1)进行大鼠皮肤创伤造模，同一只大鼠背部进行多处约8cm2创伤造模以施用不同干预。
[0075] (2)Control组施用生理盐水，PRP组施用500μL 1％PRP，NEP组施用500μL 1％实施例1的NEP，PRP组和NEP组分别加入250μL 5％氯化钙注射液促凝胶。
[0076] (3)2周内测量大鼠皮肤创伤面积变化，结果见图9‑图10。图9‑图10结果显示PRP与NEP均具有明显的生长促进作用，其中NEP显著优于PRP。
[0077] 对实施例2‑4所得的基于物理整粒的自成形血小板纳米囊泡分别进行物理表征、活化度及稳定性分析、细胞毒性及增殖试验、皮肤创伤的疗效验证，实施例2、实施例3单峰粒径分别为约200nm和约500nm，其余结果与试验例1‑4中梯度分次离心的浓缩血小板进行100纳米孔径的PES膜人力手工恒速挤出NEP(实施例1)结果相似；表明可通过实施例2‑4的血小板来源和挤出方案，实现效果类似的基于物理整粒的自成形血小板纳米囊泡的制备。
[0078] 由上述实施例可知，本发明提供的基于物理整粒的自成形血小板纳米囊泡将血小板原料经过温和的物理挤出方式纳米化处理，使其具有均一的粒径和更强的组织穿透力，并保留原有的血小板膜功能和生长因子释放能力，促进了损伤组织的细胞生长增殖，从而达到组织修复的作用。
[0079] 对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
