拟杆菌在制备预防和治疗阿尔兹海默病的产品中的应用

摘要

本发明涉及拟杆菌应用技术领域，公开了一种拟杆菌在制备预防和治疗阿尔兹海默病的产品中的应用。本发明拟杆菌在制备预防和治疗阿尔兹海默病的产品中的应用，拟杆菌包括卵形拟杆菌，多氏拟杆菌，和/或普通拟杆菌；可有效抑制阿尔茨海默病模型动物大脑中的β‑淀粉样蛋白沉积。

权利要求

1.拟杆菌在制备预防和治疗阿尔兹海默病的药品中的应用，所述拟杆菌包括卵形拟杆菌，多氏拟杆菌，和/或普通拟杆菌。

2.根据权利要求1所述应用，其特征在于：用于抑制阿尔茨海默病模型动物大脑中的β‑淀粉样蛋白沉积。

3.一种组合物在制备预防和治疗阿尔兹海默病的制剂中的应用，其特征在于：所述组合物中含有拟杆菌和/或其代谢产物，所述拟杆菌包括卵形拟杆菌，多氏拟杆菌，和/或普通拟杆菌。

4.根据权利要求3所述应用，其特征在于：所述组合物剂型为颗粒剂、胶囊、片剂、粉末剂、口服液、混悬液或乳剂。

5.一种益生菌组合物在制备预防和治疗阿尔兹海默病的产品中的应用其特征在于：所述益生菌组合物中含有有效量的拟杆菌和/或其代谢产物，所述拟杆菌包括卵形拟杆菌，多氏拟杆菌，和/或普通拟杆菌。

6.根据权利要求5所述应用，其特征在于：所述益生菌组合物中还包括加氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、丁酸梭菌和双歧杆菌中的一种或多种。

说明书

拟杆菌在制备预防和治疗阿尔兹海默病的产品中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及拟杆菌应用技术领域，特别是涉及一种拟杆菌在制备预防和治疗阿尔兹海默病的产品中的应用。

背景技术

[0002] 阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种常见于中老年人群的中枢神经系统退行性疾病，也是老年痴呆最常见的类型。AD的主要病理特点为细胞外β‑淀粉样蛋白
(Amyloidβ,Aβ)沉积，细胞内磷酸化tau蛋白聚集形成神经纤维缠结和全脑萎缩。主要临床
表现为认知、记忆、思维、语言能力的进行性丧失和行为改变。目前全球AD患者超5200万，我
国有1000万AD患者，预计到2050年全球AD患者数将超过1亿，我国的AD患者数将达到2800
万。疾病造成的全球经济负担超万亿美元。而AD的治疗尚不能有效的控制病情发展，随着患
者年龄增长，伴发复杂的年龄相关性并发症，增加了疾病的治疗难度。

[0003] 淀粉样沉积假说将Aβ视为AD发病机理的核心，认为是Aβ错误折叠和自组装形成的聚集体导致了AD患者脑组织中的一系列病变，并最终导致神经退行性疾病的发生。因此研
究者们将抑制Aβ沉积作为治疗AD的可行方法，并设计了小分子、纳米粒子、多肽等不同种类
的抑制剂，但是目前还少见对Aβ沉积有良好效果的临床药物。从Aβ级联假说、tau蛋白假说
和胆碱能假说到神经血管假说和炎症假说，关于AD的病理机制的研究不断深入。随着肠脑
轴概念的提出，肠道在中枢神经系统疾病中的作用被重视。测序技术的发展加速了对肠道
菌群作用的认识，衍生出肠道菌群‑肠‑脑轴的概念，肠道微生物组在AD和帕金森病
(Parkinson’s disease，PD)等神经退行性疾病中的作用机制研究不断深入。在诊断和治疗
方面，科学家尝试把肠道菌群改变作为AD早期诊断的生物标志物，也尝试探究菌群移植在
AD治疗中的可能性，但目前尚没有报道有效的可以作为诊断或者治疗的细菌。

[0004] 拟杆菌属在健康人体的胃肠道中含量丰富，是肠道内第二大优势类群，一方面通过在肠粘膜定殖而抵御病原菌粘附，另一方面能够代谢食物中的营养成分产生次级代谢产
物，发挥特定的生物学效应。在AD模型小鼠和AD患者中，都已经发现拟杆菌属的丰度降低，
但与疾病密切相关，增加丰度可缓解病情的具体菌株目前仍未见报道。因此迫切需要开发
一种新型的、毒副作用低、用于治疗和预防阿尔茨海默病的药物。

发明内容

[0005] 本发明提供一种拟杆菌在制备预防和治疗阿尔兹海默病的产品中的应用。

[0006] 为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

[0007] 本发明拟杆菌在制备预防和治疗阿尔兹海默病的产品中的应用。

[0008] 本发明的应用，进一步的，所述产品包括食品、饮品、药品或保健品。

[0009] 本发明的应用，进一步的，所述拟杆菌包括卵形拟杆菌(Bacteroides ovatus，ATCC BAA‑1304)，多氏拟杆菌(Bacteroides dorei，DSM 17855)，普通拟杆菌(Bacteroides 
vulgatus，ATCC 8482)或其组合。

[0010] 本发明的应用，进一步的，用于抑制阿尔茨海默病模型动物大脑中的β‑淀粉样蛋白沉积。

[0011] 本发明一种组合物，组合物中含有拟杆菌和/或其代谢产物，以及食品上或药学上可接受的载体；所述拟杆菌包括卵形拟杆菌(Bacteroides ovatus，ATCC BAA‑1304)，多氏
拟杆菌(Bacteroides dorei，DSM 17855)，普通拟杆菌(Bacteroides vulgatus，ATCC 
8482)或其组合。

[0012] 卵形拟杆菌、多氏拟杆菌和普通拟杆菌混合使用时，三者的混合比例根据治疗的需求，Aβ沉积的部位，有针对性的调整配比，其中优选的卵形拟杆菌、多氏拟杆菌和普通拟
杆菌的组合比例为(0.2‑2)：1：(0.2‑2)。

[0013] 本发明的组合物，进一步的，所述组合物剂型为颗粒剂、胶囊、片剂、粉末剂、口服液、混悬液或乳剂。

[0014] 本发明的组合物在制备预防和治疗阿尔兹海默病的制剂中的应用。

[0015] 本发明一种益生菌组合物，所述益生菌组合物中含有有效量的拟杆菌和/或其代谢产物，以及食品上或药学上可接受的载体；所述拟杆菌包括卵形拟杆菌，多氏拟杆菌，和/
或普通拟杆菌。

[0016] 益生菌组合物中含有5×107cfu/ml至1.5×108cfu/ml的拟杆菌和/或其代谢产物，8
优选1×10cfu/ml左右的拟杆菌和/或其代谢产物。其中载体包括益生菌和/或益生元；所
述的益生菌包括氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌GM‑020、、嗜酸乳杆菌、丁酸梭菌、双歧杆菌中任何
一种或多种组合；所述的益生元包括低聚果糖(FOS)、低聚半乳糖(GOS)、低聚木糖(XOS)、低
聚乳果糖(LACT)、大豆低聚糖(SOS)、菊粉(Inulin)中任何一种或多种组合。

[0017] 本发明一种益生菌组合物，进一步的，还包括加氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、丁酸梭菌和双歧杆菌中的一种或多种。

[0018] 本发明一种益生菌组合物在制备预防和治疗阿尔兹海默病的产品中的应用。

[0019] 本发明拟杆菌在制备预防和治疗阿尔兹海默病的产品中的应用与现有技术相比，具有如下有益效果：

[0020] 本发明提供的拟杆菌及其菌剂可以显著抑制AD模型小鼠的大脑皮层和海马区Aβ淀粉样蛋白沉积。可以用于治疗阿尔茨海默病的药品、保健品、饮料或食品中。

[0021] 本发明在众多的拟杆菌属中明确指出了卵形拟杆菌、多氏拟杆菌和普通拟杆菌三种菌种，对阿尔兹海默病具有较好的治疗和预防效果。卵形拟杆菌对小鼠海马下托区的Aβ
沉积有明显抑制效果；多氏拟杆菌对小鼠海马下托区和大脑白质区域的Aβ沉积有明显抑制
效果，并且可有效抑制Aβ向皮层扩散；普通拟杆菌可有效减少小鼠海马下托区和CA1区的Aβ
沉积。三者的作用区域和范围各有不同，可单独使用，也可组合使用。

[0022] 本发明提出的三者混合的活性菌剂，毒副作用小，可长期服用。长期服用，小鼠脑内大脑皮层几乎无Aβ沉积，海马区的Aβ沉积密度显著降低，沉积范围显著缩小，且无明显其
他不适症状。证明从病程早期开始长期服用，可有效抑制阿尔兹海默病的发展，并在一定程
度上减轻已患病症的程度，具有可逆的趋势。

[0023] 下面结合附图对本发明的拟杆菌在制备预防和治疗阿尔兹海默病的产品中的应用作进一步说明。

附图说明

[0024] 图1为灌胃卵形拟杆菌的实验组2‑1的小鼠大脑皮层和海马区Aβ淀粉样蛋白沉积变化情况；

[0025] 图2为灌胃多氏拟杆菌的实验组2‑2的小鼠大脑皮层和海马区Aβ淀粉样蛋白沉积变化情况；

[0026] 图3为灌胃普通拟杆菌的实验组2‑3的小鼠大脑皮层和海马区Aβ淀粉样蛋白沉积变化情况；

[0027] 图4为灌胃卵形拟杆菌、多氏拟杆菌和普通拟杆菌三者组合的实验组2‑4的小鼠大脑皮层和海马区Aβ淀粉样蛋白沉积变化情况；

[0028] 图5为灌胃卵形拟杆菌的实验组3‑1的幼年小鼠大脑皮层和海马区Aβ淀粉样蛋白沉积变化情况；

[0029] 图6为灌胃多氏拟杆菌的实验组3‑2的幼年小鼠大脑皮层和海马区Aβ淀粉样蛋白沉积变化情况；

[0030] 图7为灌胃普通拟杆菌的实验组3‑3的幼年小鼠大脑皮层和海马区Aβ淀粉样蛋白沉积变化情况；

[0031] 图8为灌胃卵形拟杆菌、多氏拟杆菌和普通拟杆菌三者组合的实验组3‑4的幼年小鼠大脑皮层和海马区Aβ淀粉样蛋白沉积变化情况；

[0032] 图9为灌胃卵形拟杆菌、多氏拟杆菌和普通拟杆菌三者组合的实验组4的老年小鼠大脑皮层和海马区Aβ淀粉样蛋白沉积变化情况；

[0033] 图10为从二月龄持续灌胃卵形拟杆菌、多氏拟杆菌和普通拟杆菌三者组合菌剂至六月龄的实验组5的中老年期小鼠大脑皮层和海马区Aβ淀粉样蛋白沉积变化情况。

[0034] 图11为从四个半月龄持续灌胃卵形拟杆菌、多氏拟杆菌和普通拟杆菌三者组合菌剂至六月龄的实验组6的中老年期小鼠大脑皮层和海马区Aβ淀粉样蛋白沉积变化情况。

[0035] 图12为灌胃卵形拟杆菌、多氏拟杆菌和普通拟杆菌三者组合的实验组7的成年雌性小鼠大脑皮层和海马区Aβ淀粉样蛋白沉积变化情况。

具体实施方式

[0036] 本发明拟杆菌在制备预防和治疗阿尔兹海默病的产品中的应用。其中产品包括食品、饮品、药品或保健品，用于抑制阿尔茨海默病模型动物大脑中的β‑淀粉样蛋白沉积。

[0037] 随着测序技术的发展，宏基因组物种鉴定的结果更精准细致。本申请采用三代宏基因组学测序法检测了5×FAD野生型和转基因小鼠肠道菌群的组成差异，发现转基因小鼠
较野生型小鼠肠道菌群中拟杆菌属的含量降低，在菌种水平发现卵形拟杆菌(Bacteroides 
ovatus)，多氏拟杆菌(Bacteroides dorei)和普通拟杆菌(Bacteroides vulgatus)的差异
较大。为了研究这些差异表达的拟杆菌在阿尔茨海默病不同阶段中的作用，我们把幼年、成
年和老年5×FAD转基因小鼠抗生素处理后，分别灌胃回补上述三个拟杆菌及混合物，通过
免疫荧光染色分析拟杆菌对小鼠脑内Aβ沉积的影响。

[0038] 实施例1、拟杆菌的培养

[0039] 卵形拟杆菌(Bacteroides ovatus，ATCC BAA‑1304)，普通拟杆菌(Bacteroides vulgatus，ATCC 8482)购于美国模式培养物集存库(American type culture collection,
ATCC)，多氏拟杆菌(Bacteroides dorei，DSM 17855)购于德国微生物菌种保藏中心
(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen，DSMZ)。

[0040] 将购得的这些菌株无菌操作接种到液体培养基中，然后在含5％二氧化碳，10％氢气和85％氮气的厌氧工作站中培养。

[0041] 其中，培养基配方如表1所示。

[0042] 表1拟杆菌的培养基组成

[0043]

[0044]

[0045] 实施例2、拟杆菌对成年雄性小鼠脑内Aβ沉积的影响

[0046] 本实验采用一种阿尔茨海默病模型小鼠—5×FAD小鼠，5×FAD小鼠购自Jackson转基因小鼠保藏中心；饲养温度20‑24℃，环境湿度50‑60％，光照12小时(8:00‑20:00)，隔
音，自由摄食和饮水。

[0047] 采用6周龄雄性5×FAD转基因小鼠，每3只为一组，随机分组，分为实验组和对照组。先对实验组和对照组的小鼠分别进行为期两周的抗生素处理，具体的抗生素组成如表2
所示，来破坏实验小鼠体内的肠道微生物。

[0048] 表2抗生素处理中使用的抗生素组成

[0049]组分 配比重量
硫酸新霉素 0.5mg/ml
甲硝唑 0.5mg/ml
氨苄青霉素钠 0.5mg/ml
万古霉素 0.25mg/ml

[0050] 然后使用实施例1中培养的活性菌剂对实验组的小鼠进行灌胃，菌液需提前培养，每周活化保证新鲜，并在使用前分别测定浓度。灌胃菌控制OD600值在0.7左右，确保上述拟
杆菌处于旺盛生长的对数生长期，灌胃量定为0.2ml/只，单独菌剂菌液中的活菌浓度约为1
8
×10cfu/ml，复合菌剂采用等体积或表3所示的比例混合，其中最终整体菌量不少于1×
8
10cfu/ml。频率为每周三次，持续四周。对照组使用表1中记载的培养基给与对照组小鼠灌
胃处理，每周灌胃三次，持续四周。

[0051] 本实施例2中对实验组进行灌胃的菌种组合具体如表3所示。

[0052] 表3实施例2中拟杆菌的实验组合

[0053]组分 卵形拟杆菌 多氏拟杆菌 普通拟杆菌
实验组2‑1 100％    
实验组2‑2   100％  
实验组2‑3     100％
实验组2‑4 20％ 30％ 50％

[0054] 末次给药后灌注取脑，做冰冻切片，通过免疫荧光染色观察小鼠脑内的Aβ沉积情况，具体如图1至图4所示。

[0055] 图1左侧ctrl为对照组，右侧B.ovatus为灌胃卵形拟杆菌的实验组2‑1，Y为X图中的方框区域的局部放大图。如图1所示，与对照组相比，实验组2‑1卵形拟杆菌灌胃处理后的
小鼠海马下托区Aβ沉积的密度降低，Aβ斑块大小减小。

[0056] 图2左侧ctrl为对照组，右侧B.dorei为灌胃多式拟杆菌的实验组2‑2，Y为X图中的方框区域的局部放大图。如图2所示，与对照组相比，实验组2‑2多式拟杆菌灌胃处理在减少
海马下托区Aβ沉积的同时可以抑制Aβ向皮层扩散，还能有效减少大脑白质区域的Aβ沉积。

[0057] 图3左侧ctrl为对照组，右侧B.vulgatus为灌胃普通拟杆菌的实验组2‑3，Y为X图中的方框区域的局部放大图。如图3所示，与对照组相比，实验组2‑3普通拟杆菌灌胃处理后
的小鼠海马下托区和CA1区的Aβ沉积减少。

[0058] 图4左侧ctrl为对照组，右侧Mix treated为灌胃普通拟杆菌的实验组2‑4，Y为X图中的方框区域的局部放大图。如图4所示，与对照组相比，实验组2‑4三种拟杆菌混合菌液灌
胃处理可使包括大脑皮层区，海马区和白质区等全脑的Aβ沉积密度整体减少至很低水平，
三者协同作用的区域范围更为广泛，作用更加全面。

[0059] 说明卵形拟杆菌，多氏拟杆菌，普通拟杆菌或其组合，对成年小鼠大脑皮层和海马8
区Aβ淀粉样蛋白沉积有明显抑制作用，经口服用浓度为1×10cfu/ml左右的活性菌剂，对
成年雄性小鼠的阿尔兹海默病的治疗和预防有着明显的作用。

[0060] 实施例3、拟杆菌对幼年小鼠脑内Aβ沉积的影响

[0061] 本实验采用一种阿尔茨海默病模型小鼠—5×FAD小鼠，5×FAD小鼠购自Jackson转基因小鼠保藏中心；饲养温度20‑24℃，环境湿度50‑60％，光照12小时(8:00‑20:00)，隔
音，自由摄食和饮水。

[0062] 采用雄性5×FAD转基因小鼠，在21天离乳后，第22天开始抗生素处理，采用灌胃的方法，灌胃量为0.2ml/只，每天一次，连续三天，具体的抗生素组成如表2所示。每3只为一
组，随机分组，分为实验组和对照组。

[0063] 从第25天开始，实验组小鼠接受实施例1中培养的活性菌剂灌胃，菌液需提前培养，每周活化保证新鲜，并在使用前分别测定浓度。灌胃菌控制OD600值在0.7左右，灌胃量
7
定为0.2ml/只，单独菌剂菌液中的活菌浓度约为8.5×10 cfu/ml，复合菌剂采用等体积或
8
表4所示的比例混合，其中最终菌量不少于1×10cfu/ml。频率为每周三次，持续16次。对照
组接受培养基灌胃，频率为每周三次，持续16次。

[0064] 本实施例3中对实验组进行灌胃的菌种组合具体如表4所示。

[0065] 表4实施例3中拟杆菌的实验组合

[0066]

[0067]

[0068] 到小鼠2月龄时，末次给药后灌注取脑，做冰冻切片，通过免疫荧光染色观察小鼠脑内Aβ沉积，结果如图5‑8所示。

[0069] 图5左侧ctrl为对照组，右侧B.ovatus为灌胃卵形拟杆菌的实验组3‑1，Y为X图中的方框区域的局部放大图。如图5所示，与对照组相比，实验组3‑1卵形拟杆菌灌胃处理后的
幼年小鼠海马区Aβ沉积数量显著减少。

[0070] 图6左侧ctrl为对照组，右侧B.dorei为灌胃多式拟杆菌的实验组3‑2，Y为X图中的方框区域的局部放大图。如图6所示，与对照组相比，实验组3‑2多式拟杆菌灌胃处理后的幼
年小鼠海马区Aβ沉积减少，且有抑制Aβ向海马下托区和皮层扩散趋势的作用。

[0071] 图7左侧ctrl为对照组，右侧B.vulgatus为灌胃普通拟杆菌的实验组3‑3，Y为X图中的方框区域的局部放大图。如图7所示，与对照组相比，实验组3‑3普通拟杆菌灌胃处理后
的幼年小鼠海马区沉积的Aβ斑块颗粒直径显著减小，斑块数量也减少。

[0072] 图8左侧ctrl为对照组，右侧Mix treated为灌胃普通拟杆菌的实验组3‑4，Y为X图中的方框区域的局部放大图。如图8所示，与对照组相比，实验组3‑4三种拟杆菌混合菌剂灌
胃处理后的幼年小鼠脑内大脑皮层和海马区的Aβ荧光染色信号显著降低，提示Aβ沉积减少
明显。

[0073] 结果：口服补充卵形拟杆菌、多氏拟杆菌、普通拟杆菌及三者组合的活性菌均可以显著减少幼年5×FAD转基因小鼠脑内Aβ沉积，表现为Aβ斑块密度降低，斑块体积减小，Aβ沉
积从海马下托区向皮层扩散的趋势被抑制等方面。由于幼年5×FAD转基因小鼠处于脑内Aβ
沉积的早期阶段，提示拟杆菌有抑制Aβ沉积的作用。

[0074] 实施例4、拟杆菌对老年雄性小鼠脑内Aβ沉积的影响

[0075] 本实验采用一种阿尔茨海默病模型小鼠—5×FAD小鼠，5×FAD小鼠购自Jackson转基因小鼠保藏中心；饲养温度20‑24℃，环境湿度50‑60％，光照12小时(8:00‑20:00)，隔
音，自由摄食和饮水。

[0076] 采用12月龄雄性5×FAD转基因小鼠，进行抗生素处理，采用水饲的方法，连续两周，具体的抗生素组成如表2所示。每2只为一组，随机分组，分为实验组和对照组。

[0077] 实验组小鼠接受实施例1中培养的活性菌剂灌胃，菌液需提前培养，每周活化保证新鲜，并在使用前分别测定浓度，灌胃菌控制OD600值在0.7左右，灌胃量定为0.2ml/只，菌
8
液中的活菌浓度约为1×10cfu/ml，频率为每周三次，持续四周。对照组接受培养基灌胃，
频率为每周三次，持续四周。

[0078] 由于考虑到老年小鼠的代谢速率减慢，病程发展较长，使用的活性菌剂为卵形拟杆菌、多氏拟杆菌和普通拟杆菌的混合菌剂，采用等体积混合法，控制复合菌剂中菌量不少
8
于1×10cfu/ml，末次给药后灌注取脑，做冰冻切片，通过免疫荧光染色观察小鼠脑内Aβ沉
积，结果如图9所示。

[0079] 图9左侧ctrl为对照组，右侧Mix treated为灌胃三种拟杆菌混合菌液的实验组4，Y为X图中的方框区域的局部放大图。如图9所示，与对照组相比，实验组4三种拟杆菌混合灌
胃处理后的老年小鼠脑内大脑皮层和海马区的Aβ抗体荧光染色信号显著降低。

[0080] 实施例5、拟杆菌对小鼠脑内Aβ沉积的长期影响

[0081] 实施例5‑1：

[0082] 采用6周龄雄性5×FAD转基因小鼠，利用水饲法进行抗生素处理，持续两周，具体的抗生素组成如表2所示，从2月龄开始接受活性拟杆菌灌胃。每3只为一组，随机分组，分为
实验组和对照组。

[0083] 实验组小鼠接受实施例1中培养的活性菌剂灌胃，菌液需提前培养，每周活化保证新鲜，并在使用前分别测定浓度，灌胃菌控制OD600值在0.7左右，灌胃量定为0.2ml/只，使
用的活性菌剂为包含卵形拟杆菌、多氏拟杆菌和普通拟杆菌的复合菌剂，采用等体积混合
8
法，菌量不少于1×10cfu/ml，频率为每周三次，持续四个月。对照组接受培养基灌胃，频率
为每周三次，持续四个月。

[0084] 末次给药后灌注取脑，做冰冻切片，通过免疫荧光染色观察小鼠脑内Aβ沉积，结果如图10所示。

[0085] 图10左侧ctrl为对照组，右侧Mix treated为灌胃三种拟杆菌混合菌液的实验组，Y为X图中的方框区域的局部放大图。如图10所示，与对照组相比，实验组5‑1三种拟杆菌混
合灌胃处理后的小鼠脑内大脑皮层几乎无Aβ沉积，海马区的Aβ沉积密度显著降低，沉积范
围显著缩小。

[0086] 实验组5‑1小鼠脑片免疫荧光结果与2‑3月龄5×FAD转基因小鼠相似，提示从Aβ沉积早期开始长期服用这三种卵形拟杆菌菌剂可能同时存在减缓Aβ产生和清除已产生的Aβ
的作用。

[0087] 实施例5‑2：

[0088] 采用4月龄雄性5×FAD转基因小鼠，利用水饲法进行抗生素处理，持续两周，具体的抗生素组成如表2所示，从4个半月龄开始接受活性拟杆菌灌胃。每3只为一组，随机分组，
分为实验组和对照组。

[0089] 实验组小鼠接受实施例1中培养的活性菌剂灌胃，菌液需提前培养，每周活化保证新鲜，并在使用前分别测定浓度，灌胃菌控制OD600值在0.7左右，灌胃量定为0.2ml/只，使用
的活性菌剂为包含卵形拟杆菌、多氏拟杆菌和普通拟杆菌的复合菌剂，采用等体积混合法，
8
菌量不少于1×10cfu/ml，频率为每周三次，持续八周。对照组接受培养基灌胃，频率为每
周三次，持续八周。

[0090] 末次给药后灌注取脑，做冰冻切片，通过免疫荧光染色观察小鼠脑内Aβ沉积，结果如图11所示。

[0091] 图11左侧ctrl为对照组，右侧Mix treated为灌胃三种拟杆菌混合菌液的实验组，Y为X图中的方框区域的局部放大图。如图11所示，与对照组相比，实验组5‑2三种拟杆菌混
合灌胃处理后的小鼠海马区的Aβ斑块数较对照组明显减少，特别是从海马下托区，甚至比
自然状态下4月龄转基因小鼠海马内沉积还要少，提示拟杆菌不仅可以抑制海马区Aβ生成，
抑制Aβ从海马向皮层的扩散，还有一定的清除Aβ沉积的作用。此外处理组大脑皮层和脑白
质区Aβ沉积数量也显著降低。

[0092] 综上所述，在小鼠中老年期，三种拟杆菌等体积混合，通过灌胃的方法长期回补，重塑5×FAD小鼠肠道菌群可以有效改善脑内Aβ沉积。采用两种实验方案：1、从开始出现Aβ
沉积的时期(2月龄左右)开始，持续回补直至中老年期；2、从已有较多Aβ沉积的四月龄时期
再开始回补，持续两个月直至中老年期。我们惊喜地发现无论是从Aβ沉积早期开始还是从
疾病中晚期开始，通过上述两种方案回补三种拟杆菌都能有效地减少小鼠脑内各脑区Aβ沉
积，甚至能够使6月龄5×FAD小鼠脑内Aβ沉积恢复至2‑3月龄左右的水平，表明拟杆菌不仅
能够抑制Aβ沉积的生成和扩散，还能清除病理性Aβ沉积。而且在2个月和4个月持续补充的
过程中，未发现小鼠有其他异常反应，提示该拟杆菌菌剂安全性较高，无明显副作用，可长
期服用。实施例4与实施例5相比，老年时期(12月龄)才开始服用拟杆菌的小鼠，可能由于此
时小鼠脑内Aβ沉积已很严重，菌剂补充持续时间较短，其缓解效果不如幼年期和成年期开
始回补并长期补充的实施例。

[0093] 因此我们认为从疾病早期开始，长期补充卵形拟杆菌、多氏拟杆菌、普通拟杆菌的混合菌剂，对于AD的治疗具有显著效果。

[0094] 实施例6、拟杆菌对雌性成年小鼠脑内Aβ沉积的长期影响

[0095] 本实验采用一种阿尔茨海默病模型小鼠—5×FAD小鼠，5×FAD小鼠购自Jackson转基因小鼠保藏中心；饲养温度20‑24℃，环境湿度50‑60％，光照12小时(8:00‑20:00)，隔
音，自由摄食和饮水。

[0096] 采用6周龄雌性5×FAD转基因小鼠，利用水饲法进行抗生素处理，持续两周，具体的抗生素组成如表2所示。每3只为一组，随机分组，分为实验组和对照组。

[0097] 从2月龄开始，实验组小鼠接受实施例1中培养的活性菌剂灌胃，菌液需提前培养，每周活化保证新鲜，并在使用前分别测定浓度，灌胃菌控制OD600值在0.7左右，灌胃量定为
0.2ml/只，使用的活性菌剂为包含卵形拟杆菌、多氏拟杆菌和普通拟杆菌的复合菌剂，采用
8
等体积混合法，菌量不少于1×10 cfu/ml，频率为每周三次，持续四周。对照组接受培养基
灌胃，频率为每周三次，持续四周。

[0098] 末次给药后灌注取脑，做冰冻切片，通过免疫荧光染色观察小鼠脑内Aβ沉积，结果如图12所示。

[0099] 图12左侧ctrl为对照组，右侧Mix treated为灌胃三种拟杆菌混合菌液的实验组，Y为X图中的方框区域的局部放大图。如图12所示，与对照组相比，实验组6三种菌剂混合灌
胃处理后的成年雌性小鼠脑内大脑皮层Aβ沉积显著减少，且能有效减少海马区的Aβ的沉积
密度。

[0100] 以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方
案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。