一种钼硫化合物-蛋白质纳米复合物及其制备方法和用途

摘要

本发明属于生物医药材料领域，具体涉及一种钼硫化合物‑蛋白质纳米复合物及其制备方法和用途。一种钼硫化合物‑蛋白质纳米复合物，所述纳米复合物包括蛋白质和钼硫化合物，所述蛋白质包覆于所述钼硫化合物表面，所述钼硫化合物的化学通式为MoOaS2‑a，其中，0≤a＜2；所述蛋白质和钼元素的质量比是(8～12)：1。本申请的纳米复合物能够在肿瘤组织中有效富集，通过分解肿瘤组织内的双氧水，造成高活性氧的环境，杀灭肿瘤细胞。

权利要求

1.一种钼硫化合物‑蛋白质纳米复合物，其特征在于，所述纳米复合物包括蛋白质和钼硫化合物，所述蛋白质包覆于所述钼硫化合物表面，所述钼硫化合物的化学通式为MoOaS2‑a，其中，0≤a＜2；所述蛋白质和钼元素的质量比是(8～12)：1。

2.根据权利要求1所述的纳米复合物，其特征在于，所述纳米复合物为球形颗粒，粒径为5～10nm。

3.根据权利要求1所述的纳米复合物，其特征在于，所述蛋白质选自牛血清白蛋白、人血清白蛋白、转铁蛋白、辣根过氧化酶、谷胱甘肽巯基转移酶和超氧化物歧化酶中的至少一种。

4.根据权利要求1所述的纳米复合物的制备方法，其特征在于，所述方法以蛋白质为模板，钼源在硫化钠和蛋白质的作用下进行反应，得到所述的纳米复合物。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)将蛋白质、钼源和硫化钠溶于水，得到混合液；

2)调节所述混合液的pH值至11～14，接着调节pH值至6.5～7，然后于20℃～40℃进行反应；

3)将所述反应后的溶液纯化、冷冻干燥，获得所述的纳米复合物。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述混合液中蛋白质的浓度为1～2g/L；

和/或，所述钼源选自钼酸钠；

和/或，所述钼源和硫化钠的摩尔比为1:(0.5～2)；

和/或，所述硫化钠和蛋白质的质量比为1:(1～2)。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述反应在避光下进行；

和/或，所述纯化采用透析方式进行，所述透析的截留分子量为3200～14000Da。

8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，调节所述混合液的pH值至11～14时，采用碱进行调节，所述碱包括氢氧化钠、氢氧化钾中的一种如或多种；

和/或，调节pH值至6.5～7时，采用酸进行调节，所述酸包括盐酸、硝酸和硫酸中的一种或多种。

9.如权利要求1～3任一项所述的纳米复合物作为催化剂在过氧化氢制备活性氧药物中的用途。

10.如权利要求1～3任一项所述的纳米复合物在制备抗肿瘤药物中的用途。

说明书

一种钼硫化合物‑蛋白质纳米复合物及其制备方法和用途

技术领域

[0001] 本发明属于生物医药材料领域，具体涉及一种钼硫化合物‑蛋白质纳米复合物及其制备方法和用途。

背景技术

[0002] 仿生合成，即模仿自然界中生物矿化，通过生物大分子(如蛋白、核酸等)与金属离子作用、调控、最终形成无机矿化物的过程。利用生物大分子在体外作为模板来原位合成无机金属纳米颗粒，因其纳米级尺寸和独特的分子结构而具有异于常规的理化性质。蛋白分子是目前最为常用的仿生合成金属纳米颗粒的模板。与传统方法制备的相同颗粒相比，蛋白仿生合成具有以下一些优点：1)反应条件温和，多在室温或生理温度下进行，无需高温高压等反应条件或特殊设备，无有机溶剂参与，可以称为绿色合成；2)原料来源广泛，成本相对较低；3)合成步骤简单，重复性好；4)由于生成的纳米颗粒表面有蛋白保护，使其进入血液后不易形成蛋白冠，生物相容性较好。

[0003] 硫化钼(MoS2)属于过渡金属硫化物家族，具有层状结构，各层之间通过弱范德华力堆积在一起。因此，纳米硫化钼的制备方法通常是通过破坏层之间的弱作用力，将多层的块状硫化钼剥离成单层的片状纳米硫化钼。由于层之间的作用力消失、电子结构的改变以及尺寸效应使得纳米硫化钼具有不同的理化性质，被广泛应用于催化、储能、润滑剂、生物传感器、药物载体和肿瘤治疗等领域。研究发现二硫化钼有较高的近红外区吸收和光热转换效率，因此，硫化钼纳米片被广泛应用于光热治疗，但是由于硫化钼纳米片在水中分散性差，且尺度不均，因此生物相容性较差，通常需要先对硫化钼进行表面修饰才能进行生物学方面的应用。

发明内容

[0004] 鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种钼硫化合物‑蛋白质纳米复合物及其制备方法和用途，用于解决现有技术中的问题。

[0005] 为实现上述目的及其他相关目的，本发明是通过以下技术方案获得的。

[0006] 本发明的目的之一在于提供一种钼硫化合物‑蛋白质纳米复合物，所述纳米复合物包括蛋白质和钼硫化合物，所述蛋白质包覆于所述钼硫化合物表面，所述钼硫化合物的化学通式为MoOaS2‑a，其中，0≤a＜2；所述蛋白质和钼元素的质量比是(8～12)：1。

[0007] 优选地，所述纳米复合物为球形颗粒，粒径为5～10nm。

[0008] 优选地，所述蛋白质选自牛血清白蛋白、人血清白蛋白、转铁蛋白、辣根过氧化酶、谷胱甘肽巯基转移酶和超氧化物歧化酶中的至少一种。

[0009] 本发明的目的之二在于提供上述所述的纳米复合物的制备方法，所述方法以蛋白质为模板，钼源在硫化钠和蛋白质的作用下进行反应，得到所述的纳米复合物。

[0010] 优选地，包括如下步骤：

[0011] 1)将蛋白质、钼源和硫化钠溶于水，得到混合液；

[0012] 2)调节所述混合液的pH值至11～14，接着调节pH值至6.5～7，然后于20℃～40℃进行反应；

[0013] 3)将所述反应后的溶液纯化、冷冻干燥，获得所述的纳米复合药物。

[0014] 更优选地，所述反应在磁力搅拌下进行20min～180min。

[0015] 进一步优选地，所述反应在磁力搅拌下进行80min～100min。

[0016] 更优选地，所述混合液中蛋白质的浓度为1～2g/L。

[0017] 更优选地，所述钼源为钼酸钠。具体地，所述钼源为二水合钼酸钠。

[0018] 更优选地，所述硫化钠为九水合硫化钠。

[0019] 更优选地，所述钼源和硫化钠的摩尔比为1:(0.5～2)。

[0020] 进一步优选地，所述钼源和硫化钠的摩尔比为1:(0.8～1.2)。

[0021] 更优选地，所述硫化钠和蛋白质的质量比为1:(1～2)。

[0022] 更优选地，所述碱包括氢氧化钠、氢氧化钾中的一种如或多种。

[0023] 进一步优选地，所述碱为氢氧化钠。

[0024] 更优选地，所述酸包括盐酸、硝酸和硫酸中的一种或多种。

[0025] 进一步优选地，所述酸为盐酸。

[0026] 更优选地，所述反应在避光下进行。

[0027] 更优选地，所述纯化采用透析方式进行，所述透析袋截留分子量为3200～14000Da。本发明中通过透析将反应过程中未参与反应的钼酸根离子、盐离子等杂质去除。

[0028] 进一步优选地，所述透析时间为12～24h。

[0029] 进一步优选地，所述透析在避光下进行。

[0030] 本发明的目的之三在于提供上述所述的纳米复合物作为催化剂在过氧化氢制备活性氧中的用途。

[0031] 发明的目的之四在于提供上述所述的纳米复合物在制备抗肿瘤药物中的用途。

[0032] 本发明提供了一种利用仿生合成技术制备钼硫化合物‑蛋白质纳米复合物的方法，该方法合成的纳米复合物呈球形，直径为5～10nm，其水溶性和稳定性优异。此外，该纳米复合物具有硫化钼纳米片不具备的独特化学性质，能与双氧水反应生成活性氧(主要为活性氧中的单线态氧和超氧阴离子)。活性氧可以造成蛋白及核酸的氧化损伤，诱导细胞凋亡，是目前一些癌症治疗方法如光动力治疗中起关键作用的化学物质。经研究表明，本申请的纳米复合物能够在肿瘤组织中有效富集，通过分解肿瘤组织内的双氧水，造成高活性氧的环境，杀灭肿瘤细胞。此外，本申请的纳米复合药物还可应用于其他需要活性氧的场所，如杀灭细菌、化学发光检测、化学发光探针等领域。

[0033] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

[0034] 1)本发明制备纳米复合物的方法操作简单，成本低廉，反应条件温和，制备周期短，绿色环保。

[0035] 2)本发明制备的纳米复合物的粒径均一、分散性和稳定性好。

[0036] 3)本发明制备的纳米复合物对正常细胞的体外毒性较低，具有较好的生物相容性。

[0037] 4)本发明制备的纳米复合物通过分解双氧水造成高活性氧环境，从而杀灭肿瘤细胞。

附图说明

[0038] 图1显示为实施例1制备的纳米复合物的DLS图。

[0039] 图2显示为实施例1制备的纳米复合物的TEM图。

[0040] 图3显示为实施例1制备的纳米复合物的EDS能谱。

[0041] 图4显示为实施例1制备的纳米复合物的XPS图。

[0042] 图5显示为实施例4中纳米复合物与双氧水反应后的ESR图。

[0043] 图6显示为实施例4中纳米复合物与双氧水反应后产生单线态氧的荧光光谱图。

[0044] 图7显示为实施例5中纳米复合物在体外对乳腺癌细胞4T1的毒性评价图。

[0045] 图8显示为实施例6中纳米复合物在体内肿瘤治疗中瘤体积与时间的关系图。

[0046] 图9显示为实施例6中纳米复合物在体内肿瘤治疗后瘤重量的统计图。

[0047] 图10显示为实施例6中纳米复合物在体内肿瘤治疗后肿瘤的解剖图。

[0048] 图11显示为实施例7中纳米复合物给药后在小鼠血液中的半衰期图。

[0049] 图12显示为实施例8中纳米复合物给药后在小鼠各器官中的代谢残留量图。

[0050] 图13显示为实施例9中纳米复合物给药后小鼠的血常规和血生化数据图。

具体实施方式

[0051] 以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。

[0052] 在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。

[0053] 当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、颗粒外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、颗粒相似或等同的现有技术的任何方法、设备和颗粒来实现本发明。

[0054] 本申请实施例中，钼源为二水合钼酸钠，硫化钠为九水合硫化钠。

[0055] 本申请实施例中，牛血清白蛋白(BSA)购买于上海阿拉丁生化科技有限公司，辣根过氧化酶购买于上海阿拉丁生化科技有限公司，超氧化物歧化酶购买于上海源叶生物科技有限公司；商业化二维硫化钼纳米片购买于上海阿拉丁生化科技有限公司，标记为MoS2‑NS，纯度为99.9％，粒度为100‑300nm。

[0056] 实施例1

[0057] 本实施例1中，制备纳米复合物，包括如下步骤：

[0058] 1)将60mg牛血清白蛋白加入到30mL二次水中，磁力搅拌溶解成澄清透明水溶液，然后与66.9mg二水合钼酸钠和66.6mg九水合硫化钠进行搅拌混合，得到混合液。

[0059] 2)先用1mM的氢氧化钠溶液调节混合液的pH值至11并搅拌均匀，消耗约400μL氢氧化钠水溶液；接着用1.0M的盐酸水溶液，调节pH至6.5，于25℃避光磁力搅拌反应1小时。

[0060] 3)将反应后的溶液避光透析24h，透析袋截留分子量为3200～14000，透析后溶液经冷冻干燥成粉末进行保存，获得纳米复合物，标记为MoOaS2‑a‑B。

[0061] 本实施例中，a＝1，蛋白质和钼元素的质量比是8：1。

[0062] 取4mg的MoOaS2‑a‑B的冻干粉末溶于2mL二次水中，分别进行粒径分布测试和透射电镜形貌测试。

[0063] 图1为纳米复合物的动态光散射粒径分布图(DLS图)，从图可知，纳米复合物呈球形，平均粒径在7nm左右。

[0064] 图2为纳米复合物的透射电镜图(TEM图)，从图可知，纳米复合物的粒径大小与动态光散射粒径结果吻合，且分散均一。

[0065] 图3为纳米复合物的EDS能谱图，从图中可知，该纳米复合物中主要元素有钼、硫、氧、氮，氮的存在说明复合物中蛋白为主要成分，通过电感耦合等离子质谱仪(ICP‑MS)测得钼在复合物中的含量为9.9％，此外计算钼和硫的原子比约为1：0.64，说明该纳米复合物不同于二硫化钼，氧在其中也占有一定比例。

[0066] 图4为纳米复合物的XPS图，从图中可知，该纳米复合物中存在Mo6+和Mo4+，说明钼4+
酸钠中钼酸根离子部分被还原为Mo 。

[0067] 实施例2

[0068] 本实施例2中，制备纳米复合物，包括如下步骤：

[0069] 1)将60mg辣根过氧化酶加入到30mL二次水中，磁力搅拌溶解成澄清透明水溶液，然后与66.9mg二水合钼酸钠和66.6mg九水合硫化钠进行搅拌混合，得到混合液。

[0070] 2)先用1mM的氢氧化钠溶液调节混合液的pH值至14并搅拌均匀，消耗约400μL氢氧化钠水溶液；接着用1.0M盐酸水溶液，调节pH值至6.5，于40℃条件下避光搅拌反应1h。

[0071] 3)将反应后的溶液避光透析24h，透析袋截留分子量为3200～14000，透析后溶液经冷冻干燥成粉末进行保存，获得纳米复合物。

[0072] 本实施例中，蛋白质和钼元素的质量比是10：1；纳米复合物为球形颗粒，直径为10‑15nm。

[0073] 实施例3

[0074] 本实施例3中，制备纳米复合物，包括如下步骤：

[0075] 1)将60mg超氧化物歧化酶加入到30mL二次水中，磁力搅拌溶解成澄清透明水溶液，然后与66.9mg二水合钼酸钠和66.6mg九水合硫化钠进行搅拌混合，得到混合液。

[0076] 2)先用1mM的氢氧化钠溶液调节混合液的pH值至11并搅拌均匀，消耗约400μL氢氧化钠水溶液；接着用1.0M的盐酸水溶液，调节pH值至7，于20℃条件下避光搅拌反应1h。

[0077] 3)将反应后的溶液避光透析12h，透析袋截留分子量为3200～14000，透析后溶液经冷冻干燥成粉末进行保存，获得纳米复合物。

[0078] 本实施例中蛋白质和钼元素的质量比是9：1；纳米复合物为球形颗粒，直径为3‑8nm。

[0079] 实施例4

[0080] 本实施例4中，采用实施例1制备的纳米复合物(MoOaS2‑a‑B)催化双氧水产生活性氧的测试。

[0081] 超氧阴离子和单线态氧生成测试：将MoOaS2‑a‑B冻干粉末配制成0.3mg/mL的水溶液，取2mL加入500μL的超氧阴离子捕获剂5,5‑二甲基‑1‑吡咯啉‑N‑氧化物(DMPO)和500μL的单线态氧捕获剂为2,2,6,6‑四甲基哌啶‑氮‑氧化物(TEMPO)，之后加入100μL的30mM双氧水混匀后15分钟，采用电子自旋共振法进行检测。

[0082] 单线态氧生成测试：将MoOaS2‑a‑B冻干粉末配制成0.3mg/mL的水溶液，取2mL加入100μL的50μM单线态氧专一性指示剂SOSG，然后加入100μL的100mM双氧水，采用荧光光谱仪测定反应体系的荧光强度，记录其位于520nm‑530nm处的发射峰作为SOSG的荧光强度，分别在反应0min、2min、4min、6min、8min、10min的时候测试荧光强度，得到SOSG荧光强度随时间变化的关系图。

[0083] 图5为纳米复合物与双氧水反应后的电子顺磁共振波谱(ESR)图，从图可知，纳米复合物催化双氧水能产生单线态氧和超氧阴离子这两种活性氧。

[0084] 图6为纳米复合物与双氧水反应产生单线态氧的荧光光谱图，从图可知，SOSG的荧光强度随时间变化明显增强，证明产生的单线态氧浓度越来越高。

[0085] 实施例5

[0086] 本实施例中，采用实施例1制备的纳米复合物进行细胞毒性评价。

[0087] 实验组：将处于对数生长期的乳腺癌细胞4T1细胞接种于96孔板上每孔180μL，恒温培养箱中培养细胞数达到85％后，用无血清性培养基溶解实施例1制备的纳米复合物，浓度以ICP‑MS测得的钼含量为标准计，分别为0μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL、200μg/mL和300μg/mL，培养24h；加入10μL的5mg/mL MTT水溶液后继续培养4h，吸去培养基加入100μL DMSO溶解甲瓒晶体，用酶标仪于570nm波长处测定吸光度。

[0088] 对照组：商业化二维硫化钼纳米片MoS2‑NS替代纳米复合物MoOaS2‑a‑B，其他同实验组。

[0089] 空白对：将对数生长期的正常细胞DC2.4细胞接种于96孔板上，每孔接种180μL，其他同实验组。

[0090] 细胞存活率计算如下：

[0091]

[0092] 图7为纳米复合物及商业化二维硫化钼纳米片对乳腺癌细胞4T1的体外毒性评价结果图，从图可知，本法申请的纳米复合物对正常细胞基本无毒性，而对肿瘤细胞有明显化学毒性；与实验组比，对照组的商业化二维硫化钼纳米片对肿瘤细胞没有明显杀伤作用。

[0093] 实施例6

[0094] 本实施例中，采用实施例1制备的纳米复合物在体内对实体瘤进行治疗效果的研究。

[0095] 选取健康活泼的6周龄、体重18‑20g的BALB/c小白鼠，于右后腿接种乳腺癌细胞6
4T1，接种细胞密度为每只100μL细胞数为1×10的乳腺癌细胞4T1。当肿瘤长到约5mm×5mm左右时(设定为第0天)，荷瘤小鼠被随机分成3组，每组5只。将生理盐水组、纳米复合物组和商业化二维硫化钼纳米片组，以钼含量为标准计，按30mg/kg通过尾静脉注射200μL，每两天注射一次，共注射4次，用游标卡尺记录每两天肿瘤的尺寸，并按下式计算肿瘤体积V：

[0096]

[0097] 其中a，b分别为肿瘤最长宽度和最短宽度。

[0098] 图8为纳米复合物在体内实体瘤治疗中瘤体积与时间的关系图，图9为纳米复合物在治疗后瘤重量图，图10为治疗后肿瘤的解剖图。

[0099] 从图8、图9和图10可知，从瘤体积，瘤重量和解剖后实体瘤数据能看出本申请制备的纳米复合物MoOaS2‑a‑B的实体瘤治疗效果最为明显，而商业化二维硫化钼纳米片MoS2‑NS基本无治疗效果。

[0100] 实施例7

[0101] 本实施例中，采用实施例1制备的纳米复合物进行血液半衰期的研究。

[0102] 选取6周龄、体重为18‑20g的健康活泼BALB/c小白鼠，将小鼠分为9组，每组4只，每只通过尾静脉注射200μL的30mg/kg(以钼含量为标准)纳米复合物的水溶液，然后分别在2min、5min、10min、0.5h、1h、2h、4h、8h、24h取血400μL，经王水溶解后稀释进行钼元素含量分析。

[0103] 图11为本实施例注射纳米复合物的水溶液后小鼠血液的半衰期图，从图11可知，纳米复合物在血液中的半衰期为0.412h。

[0104] 实施例8

[0105] 本实施例中，采用实施例1制备的纳米复合物进行药物代谢的研究。

[0106] 选取6周龄、体重为18‑20g的健康活泼BALB/c小白鼠，于右后腿接种乳腺癌细胞6
4T1，每只小鼠注射100μL细胞数为1×10 的乳腺癌细胞4T1。当肿瘤长到约5mm×5mm左右时，荷瘤小鼠被随机分成5组，每组4只。每只尾静脉注射200μL的30mg/kg(以钼含量为标准)纳米复合物的水溶液，分别在1h、3h、7h、12h、24h处死并取出心、肝、脾、肺、肾、肿瘤，经王水浸泡消化后用ICP‑MS测得各脏器中的钼元素含量。

[0107] 图12为本实施例注射纳米复合物的水溶液后小鼠的心、肝、脾、肺、肾、肿瘤中钼元素的含量图，从图可知，纳米复合物在心、肝、脾、肺、肾、肿瘤等目标器官中随着时间增加明显降低，表明本申请制备的纳米复合物代谢非常快。

[0108] 实施例9

[0109] 本实施例中，采用实施例1制备的纳米复合物进行血常规和血生化试验的研究。

[0110] 选取6周龄、体重为18‑20g的健康活泼BALB/c小白鼠，分为对照组和纳米复合物组，每组5只，每组分别尾静脉注射200μL生理盐水、200μL的30mg/kg(以钼含量为标准)纳米复合物的水溶液，每两天注射一次，共注射4次，两周后每只取血0.5毫升进行血常规和血生化测试。

[0111] 图13为纳米复合物给药后小鼠的血常规和血生化数据结果图，从图可知，纳米复合物组的血常规、血生化参数与对照组无明显差异，说明硫纳米复合物在该剂量下无明显毒副作用。

[0112] 上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。