鞘氨醇-1-磷酸4受体激动剂及其与真武汤联合在制备治疗慢性肾小球肾炎药物中的应用

摘要

本发明公开了鞘氨醇‑1‑磷酸4受体激动剂及其与真武汤联合在制备治疗慢性肾小球肾炎药物中的应用。本发明首次发现，给予鞘氨醇‑1‑磷酸4受体特异性激动剂后，对于慢性肾小球肾炎的肾功能、病理损伤均有显著的改善作用，各项观察指标均回到或接近正常的状态，抑制了炎症、纤维化的进展，提示S1PR4是开发CGN治疗药物的重要潜在靶点。本发明还发现鞘氨醇‑1‑磷酸4受体特异性激动剂和真武汤联用也可显著改善慢性肾小球肾炎的肾功能、病理损伤。GPCRs家族具有良好的成药性，本发明将有可能为CGN临床治疗提供用药选择，以解决CGN的针对性治疗用药缺失问题，具有良好的应用前景。

权利要求

1.鞘氨醇‑1‑磷酸4受体激动剂在制备治疗慢性肾小球肾炎药物中的应用，其特征在于：所述的鞘氨醇‑1‑磷酸4受体激动剂为CYM50260。

2.根据权利要求1所述的鞘氨醇‑1‑磷酸4受体激动剂在制备治疗慢性肾小球肾炎药物中的应用，其特征在于：所述的应用为鞘氨醇‑1‑磷酸4受体激动剂在制备降低尿蛋白、血清肌酐、血清尿氮素，降低肾组织促炎因子IL‑1β、TNF‑α表达水平，提高肾组织抑炎因子IL‑10、Fizz1表达水平，降低肾组织α‑SMA、FN、Vimentin表达水平，提高Ecadherin表达水平药物中的应用。

3.根据权利要求1所述的鞘氨醇‑1‑磷酸4受体激动剂在制备治疗慢性肾小球肾炎药物中的应用，其特征在于：所述的治疗慢性肾小球肾炎药物还含有真武汤。

4.根据权利要求3所述的鞘氨醇‑1‑磷酸4受体激动剂在制备治疗慢性肾小球肾炎药物中的应用，其特征在于：所述的真武汤按重量比例计包括如下原料药：附子3份、茯苓3份、白芍3份、白术2份、生姜3份；所述的真武汤的制备方法为：按重量比例分别称取各原料药，然后加10倍体积的超纯水浸泡30min，回流提取2h，过滤；取药渣加8倍体积的超纯水继续回流提取1.5h；将前后两次回流提取的滤液合并，最终浓缩为1.12g/ml的生药浓度，即可。

5.根据权利要求1所述的鞘氨醇‑1‑磷酸4受体激动剂在制备治疗慢性肾小球肾炎药物中的应用，其特征在于：所述的治疗慢性肾小球肾炎药物还含有一种或多种药学上可接受的辅料；

所述的辅料为缓释剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂或润滑剂中的至少一种。

6.根据权利要求3所述的鞘氨醇‑1‑磷酸4受体激动剂在制备治疗慢性肾小球肾炎药物中的应用，其特征在于：所述的鞘氨醇‑1‑磷酸4受体激动剂的剂型为注射剂；所述的真武汤的剂型为口服剂。

说明书

鞘氨醇‑1‑磷酸4受体激动剂及其与真武汤联合在制备治疗慢

性肾小球肾炎药物中的应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物医药领域，具体涉及鞘氨醇‑1‑磷酸4受体激动剂及其与真武汤联合在制备治疗慢性肾小球肾炎药物中的应用。

背景技术

[0002] 慢性肾小球肾炎(CGN)是一种免疫介导的炎症性疾病，其病因通常不明，发病迁延缓慢，最终将发展为严重的肾功能不全和终末期肾病。临床上CGN的诊断是延缓肾功能损伤、肾功能衰竭进展的重要时间节点，绝大多数CGN会发展成为慢性肾脏疾病，是继发慢性肾脏病的重要基础疾病。2020年2月《Lancet》报道，截止2017年，我国罹患CKD的人数已高达1.32亿，占世界人口的9.1％，其中1‑2期占世界人口的5.0％，3期占3.9％，4期占0.16％，5期占0.07％。可见绝大部分慢性肾脏病患者为1‑3期，而CGN是该时期的重要基础疾病。倘若能将疾病遏制在CGN阶段，将在极大程度上缓解沉重的社会医疗压力和经济负担。因此，发明能够有效延缓慢性肾脏病(CKD)进展到终末期肾脏病(ESRD)阶段的药物一直是临床与科研人员迫切解决的难题。

[0003] G蛋白偶联受体(G protein‑coupled receptors,GPCRs)是人类基因组编码的最大膜蛋白受体，目前主要分为谷氨酸类受体、视紫红质样受体、黏附类受体、Frizzled/Taste2受体和分泌素受体5类，其家族成员超过800个。GPCRs结合细胞周围环境中的化学物质并激活细胞内的一系列信号通路，参与调控人体内的重要细胞生理过程。GPCRs相关研究在2004及2012年两度获诺贝尔医学生理学奖，目前已明确市场上大约30％的药物都以GPCRs为靶点。

[0004] 近年来，GPCRs在调控肾脏病理生理过程中的重要作用逐渐被挖掘，例如，柠檬酸循环琥珀酸酯的受体GPR91参与琥珀酸诱导的高血压作用涉及肾素‑血管紧张素系统调控，从而影响肾血管性高血压，这一过程与动脉粥样硬化、糖尿病和肾功能衰竭密切相关；激动GPCR19能够影响肾脏脂质代谢并减轻肥胖相关的肾小球疾病，改善肾小球滤过率、肾小管钠重吸收等过程。新近《JASN》报道，敲除Gpr97抑制了AKI诱导的信号蛋白3A(Sema3A)的表达，该信号蛋白可能是肾脏损伤的早期诊断生物标志物；在肾脏足细胞中发现一个新型的GPCR‑‑GPRC5b，GPRC5b在人肾小球病变中的上调，并通过调节 信号通路调控肾小球的炎症反应。。由此可见，GPCRs与调控肾脏疾病中的炎症、肾损等病理生理过程关系紧密。提示我们，真武汤可能通过调控肾脏系膜细胞的GPCRs进而影响其炎症进展，从而治疗CGN。

[0005] 截至目前，临床上对于CGN的治疗主要是通过糖皮质激素抑制炎症，或通过降压药降低肾脏滤过压力等给药方案缓解CGN的症状，尚未有针对治疗的药物。因此，对CGN的发病机制，主要靶点的深入研究，有助于研发治疗CGN的药物。

发明内容

[0006] 基于GPCRs成药性及研究可行性的考虑，我们调研发现，截至2017年11月，美国或欧盟当局已批准134个GPCRs为靶点的药物。通过实时荧光定量PCR(qRT‑PCR)检测分析上述134个GPCRs的mRNA表达差异情况。结果显示，鞘氨醇1‑磷酸受体4(Sphingosine1‑phosphate receptor 4,S1PR4)在阳离子化牛血清白蛋白(Cationized bovine serum albumin,C‑BSA)诱导CGN模型小鼠肾脏中表达受到抑制。进一步使用该受体的激动剂CYM50260干预后，CGN模型小鼠的肾脏功能及病理有显著改善作用，提示S1PR4是开发CGN治疗药物的重要潜在靶点。

[0007] 为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供鞘氨醇‑1‑磷酸4受体激动剂在制备治疗慢性肾小球肾炎药物中的应用。

[0008] 本发明的另一目的在于提供鞘氨醇‑1‑磷酸4受体激动剂与真武汤联合在制备治疗慢性肾小球肾炎药物中的应用。

[0009] 本发明的目的通过下述技术方案实现：

[0010] 鞘氨醇‑1‑磷酸4受体激动剂在制备治疗慢性肾小球肾炎药物中的应用。

[0011] 所述的应用为鞘氨醇‑1‑磷酸4受体激动剂在制备降低尿蛋白、血清肌酐、血清尿氮素，降低肾组织促炎因子IL‑1β、TNF‑α表达水平，提高肾组织抑炎因子IL‑10、Fizz1表达水平，降低肾组织α‑SMA、FN、Vimentin表达水平，提高Ecadherin表达水平药物中的应用。

[0012] 所述的鞘氨醇‑1‑磷酸4受体激动剂优选CYM50260。CYM50260是一种特异性激动S1PR4的人工合成化合物，CAS编号为1355026‑60‑6，分子式为C14H11Cl3FNO2，分子量为350.6，结构简式见图1。该化合物能够在体内特异性激活S1PR4以发挥生物活性，对S1PR家族其余成语S1PR1、S1PR2、S1PR3、S1PR5均无活性。该化合物可直接购买于Tocris公司(货号：4677)，本发明实施例所用CYM50260均从该公司购买。目前关于该化合物的应用，仅有文献报道显示，CYM50260抑制胶原蛋白刺激的血小板聚集，sCD40L释放和PDGF‑AB分泌；
CYM50260减少了胶原蛋白磷酸化的HSP27的释放以及HSP27的磷酸化，尚未见有关应用于治疗CGN的使用报道。

[0013] 所述的治疗慢性肾小球肾炎药物还含有真武汤。

[0014] 所述的真武汤按重量比例计包括如下原料药：附子3份、茯苓3份、白芍3份、白术2份、生姜3份。所述的真武汤的制备方法为：按重量比例分别称取各原料药，然后加10倍体积的超纯水浸泡30min，回流提取2h，过滤；取药渣加8倍体积的超纯水继续回流提取1.5h；将前后两次回流提取的滤液合并，最终浓缩为1.12g/ml的生药浓度，即可。4℃冰箱保存待用。

[0015] 所述的治疗慢性肾小球肾炎药物还含有一种或多种药学上可接受的辅料。

[0016] 所述的辅料为缓释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂或润滑剂中的至少一种。

[0017] 所述的鞘氨醇‑1‑磷酸4受体激动剂的剂型为注射剂；所述的真武汤的剂型为口服剂。

[0018] 一种治疗慢性肾小球肾炎的药物组合物，含有鞘氨醇‑1‑磷酸4受体激动剂和真武汤作为活性成分。

[0019] 所述的鞘氨醇‑1‑磷酸4受体激动剂优选CYM50260。

[0020] 所述的药物还含有一种或多种药学上可接受的辅料。

[0021] 所述的辅料为缓释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂或润滑剂中的至少一种。

[0022] 在CGN疾病发展的过程中，免疫复合物在肾小球中的沉积造成的慢性炎症是关键的病理特征，肾小球系膜细胞是参与慢性炎症的重要细胞，其分泌的炎症因子会促进肾小球的炎症浸润，并激发纤维原细胞等分泌纤维蛋白最终造成肾脏的纤维化。而S1PR4在机体中主要参与慢性炎症和纤维化进程。由此看来，S1PR4调控的病理过程与CGN的发病机制密切相关。

[0023] 本发明首次发现，在CGN模型小鼠肾脏中的S1PR4明显降低，给予CYM50260激动S1PR4后，对于CGN的肾功能、病理损伤均有显著的改善作用。这是首次发现该化合物用于治疗CGN的重要作用和机制。

[0024] 通过CYM50260的干预治疗，S1PR4在小鼠体内的肾脏中激动，并改善了肾功能指标，抑制了炎症、纤维化的进展，各项观察指标均回到或接近正常的状态。

[0025] 为了探究S1PR4激动剂以及其与真武汤联用对CGN小鼠肾功能、肾组织炎症反应和肾组织纤维化的影响，进行了如下实验：

[0026] 方法：Balb/c小鼠，SPF级喂养。Balb/c小鼠适应性喂养一周后，将其随机分为正常组(Normal)、模型组(CGN)、CYM50260组、真武汤高(11.2g/kg，ZWT‑H)、低(5.6g/kg，ZWT‑L)剂量组、真武汤高剂量(11.2g/kg)+CYM50260组，共6组，每组6只小鼠。用生理盐水配制浓度为2mg/ml C‑BSA溶液，C‑BSA与弗氏不完全佐剂按照1:1的比例制成乳剂，造模组每只小鼠以多点皮下注射的方式注射1mL C‑BSA弗氏不完全佐剂乳剂以引起致敏免疫反应。从第2周开始，造模组每只小鼠隔日尾静脉注射0.1mg/mL C‑BSA，此操作持续3周。第5周起，分别给予小鼠相应的药物，连续给药4周，其中：

[0027] CYM50260组：第5周起每周腹腔注射1次5mg/kg S1PR4特异性激动剂CYM50260，持续4周，总共注射4次。

[0028] 真武汤高、低剂量组：第5周起每日灌胃一次，真武汤高剂量组每只用量为11.2g/kg体重，真武汤低剂量组每只用量为5.6g/kg体重，持续4周。

[0029] 真武汤高剂量+CYM50260组：第5周起每日真武汤灌胃一次(11.2g/kg)，每周腹腔注射1次激动剂CYM50260(5mg/kg)，持续4周。

[0030] 结果：

[0031] 1，改善肾功能：

[0032] 肾功能损伤是CGN的重要临床表现。为了探究S1PR4激动剂对CGN小鼠肾功能的影响，我们分别在第1、4、5、6、7周收集小鼠24小时尿液，通过考马斯亮蓝快速定量试剂盒(南京建成)测定尿总蛋白。在第7周结束后处死小鼠，收集血清，并通过尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)试剂盒(南京建成)检测肌酐和尿素氮含量。结果如图2所示，在第7周结束时，模型组小鼠的血清中的BUN和SCr均上升，24h尿蛋白增多。在第7周结束时，给药组小鼠的血清中的BUN和SCr均降低，24h尿蛋白减少。CYM50260显著缓解肾功能损伤(n＝3， **P＜0.01.)。S1PR4激动剂CYM50260能对抗CGN中的肾功能异常。此外，联用组与CYM50260组相比，可以发现，CYM50260和真武汤两者联用对缓解肾功能损伤有良好效应，具有协同保护作用。

[0033] 2，改善肾脏炎症：

[0034] 为了探究S1PR4激动剂对CGN小鼠肾组织炎症反应的影响，在第7周结束后，取新鲜肾组织研磨后提取肾脏总RNA，然后采用qRT‑PCR检测小鼠肾组织炎症因子的表达水平。结果如图3所示，与模型组相比，CYM50260可显著降低CGN小鼠肾组织炎症因子IL‑1β、TNF‑αmRNA水平(P<0.01)。另一方面，与模型组相比，CYM50260可显著增加CGN小鼠肾组织IL‑10、Fizz1 mRNA水平(P<0.01)。这一结果表明，S1PR4激活后，可抑制CGN小鼠肾组织炎症反应，从而抑制炎症因子的释放，减轻CGN过程中的炎症反应。与模型组相比，CYM50260和真武汤联用也可显著降低小鼠肾组织炎症因子IL‑1β、TNF‑αmRNA水平(P<0.01)。与模型组相比，CYM50260和真武汤联用也可显著增加小鼠肾IL‑10、Fizz1 mRNA水平(P<0.01)。3，改善肾脏纤维化：

[0035] 为了探究S1PR4激动剂对CGN小鼠肾组织纤维化的影响，在第7周结束后，取新鲜肾组织研磨后提取肾脏总蛋白，然后利用Western blot检测小鼠肾组织炎症因子的表达水平。结果如图4所示，给予CYM50260单独治疗，可明显降低CGN小鼠肾组织α‑SMA、FN、和Vimentin蛋白的表达水平，同时显著提高Ecadherin蛋白的表达水平，与模型组相比，差异具有统计学意义(P<0.01)。CYM50260与真武汤联用时，α‑SMA、FN、和Vimentin蛋白的表达水平明显被抑制，同时Ecadherin蛋白的表达水平被显著提高，与模型组相比，差异具有统计学意义(P<0.01)。

[0036] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

[0037] 本发明发现了CGN治疗的新靶点S1PR4。CGN进展过程中炎症和纤维化是重要的病理特征，而激动S1PR4有效抑制CGN中炎症和纤维化的进展，以起到治疗CGN的作用。

[0038] GPCRs家族具有良好的成药性，本发明将有可能为CGN临床治疗提供用药选择，以解决CGN的针对性治疗用药缺失问题。

附图说明

[0039] 图1为CYM50260的结构简式图。

[0040] 图2为S1PR4激动剂对CGN小鼠肾功能的影响研究结果图；其中A为血清尿素氮(BUN)含量测定结果，B为血清肌酐(Scr)含量测定结果，C为24h尿蛋白含量测定结果。

[0041] 图3为S1PR4激动剂对CGN小鼠肾组织炎症的影响研究结果图；其中A为IL‑1β表达水平，B为TNF‑α表达水平，C为IL‑10表达水平，D为Fizz1表达水平。

[0042] 图4为S1PR4激动剂对CGN小鼠肾组织纤维化的影响研究结果图；其中A为Western blot结果，B为统计结果。

具体实施方式

[0043] 下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

[0044] 除非另有定义，本发明中所使用的所有科学和技术术语具有与本发明涉及技术领域的技术人员通常理解的相同的含义。

[0045] 实施例1：CYM50260治疗慢性肾小球肾炎肾功能及病理损害

[0046] 方法：Balb/c小鼠，SPF级。用C‑BSA进行造模。用生理盐水配制浓度为2mg/mL C‑BSA溶液，C‑BSA与弗氏不完全佐剂按照1:1的比例制成乳剂，造模组每只小鼠以多点皮下注射的方式注射1mL C‑BSA弗氏不完全佐剂乳剂以引起致敏免疫反应。从第2周开始，造模组每只小鼠隔日尾静脉注射0.1mg/mL C‑BSA，此操作持续3周。第5周起每周腹腔注射1次5mg/kg S1PR4特异性激动剂CYM50260，持续4周，总共注射4次。

[0047] 实施例2：CYM50260联合真武汤治疗慢性肾小球肾炎肾功能及病理损害[0048] 方法：Balb/c小鼠，SPF级。用C‑BSA进行造模。用生理盐水配制浓度为2mg/mL C‑BSA溶液，C‑BSA与弗氏不完全佐剂按照1:1的比例制成乳剂，造模组每只小鼠以多点皮下注射的方式注射1mL C‑BSA弗氏不完全佐剂乳剂以引起致敏免疫反应。从第2周开始，造模组每只小鼠隔日尾静脉注射0.1mg/mL C‑BSA，此操作持续3周。第5周起每日真武汤灌胃一次(11.2g/kg)，每周腹腔注射1次激动剂CYM50260(5mg/kg)，持续4周。

[0049] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。