人工构建的反义核苷酸片段Ri111在Th1细胞极化中的应用转让专利
申请号 : CN202110594248.5
文献号 : CN113337505B
文献日 : 2022-04-08
发明人 : 张毅 , 李雪 , 张晗 , 刘元林 , 刘伟江 , 王洋
申请人 : 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
摘要 :
权利要求 :
1.一种人工构建的双链RNA片段Ri111,其特征在于,所述Ri111的靶基因为IFN‑γ、STAT4、Tbx21、IL12Rβ1和IL12Rβ2;所述Ri111正义链的核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示,所述Ri111反义链的核苷酸序列为SEQ ID NO:2所示。
2.权利要求1所述的人工构建的双链RNA片段Ri111在制备抑制T淋巴细胞向Th1细胞分化的产品中的应用。
3.一种抑制T淋巴细胞向Th1细胞分化的生物制剂,其特征在于,所述生物制剂包括权利要求1所述的人工构建的双链RNA片段Ri111。
4.如权利要求3所述的生物制剂,其特征在于,所述的生物制剂还包括以下一种或多种基因或蛋白的抑制剂:IFN‑γ、STAT4、Tbx21、IL12Rβ1和IL12Rβ2。
5.权利要求3或4所述的生物制剂在制备预防或治疗Th1细胞极化导致免疫细胞过度激活相关的疾病药物组合物中的应用。
6.如权利要求5所述的应用,其特征在于,所述人工构建的双链RNA片段Ri111通过抑制IL12‑IFN‑γ信号通路,进而抑制T淋巴细胞向Th1细胞分化。
7.权利要求1所述的人工构建的双链RNA片段Ri111在制备IL12‑IFN‑γ信号通路抑制剂中的应用;所述抑制剂能降低IL12‑IFN‑γ信号通路中相关基因的表达;所述基因包括IFN‑γ、STAT4、Tbx21、IL12Rβ1和IL12Rβ2。
8.一种非治疗目的抑制 CD4+T淋巴细胞向Th1细胞分化的方法,其特征在于,包括以下步骤:
分离提取小鼠的脾淋巴细胞,经磁珠分选出其中的 CD4+T淋巴细胞,将权利要求1所述的人工构建的双链RNA片段Ri111导入 CD4+T淋巴细胞,在IL12/IL2/anti CD28/anti IL4/anti CD3ε的混合因子作用下,诱导其向Th1细胞分化。
说明书 :
人工构建的反义核苷酸片段Ri111在Th1细胞极化中的应用
技术领域
背景技术
用,维持机体内环境稳定,保障机体健康。
免疫系统稳态,抑制异常活化的免疫反应,确保免疫应答的可控性对于防治免疫紊乱所致
的自身免疫性系统疾病具有重要意义。
多种辅助性T细胞(Th,helper T cell)亚群,发挥免疫调控的多样性,共同维持机体的免疫
稳态。1型辅助性T淋巴细胞(Th1细胞)的异常活化与多种免疫稳态失调的发生密切相关,也
是导致多种免疫系统疾病如过敏反应、系统性红斑狼疮、急性移植物抗宿主病、多发性硬化
等疾病发生的根源。IL12可以诱导T淋巴细胞向Th1细胞分化,并激活IFN‑γ表达,是经典的
促炎因子,在炎症发生早期发挥重要功能,是启动炎症反应、驱动Th1细胞分化的关键促炎
因子。目前临床上应用于治疗免疫紊乱所致的自身免疫性系统疾病常依赖于激素类药物或
免疫抑制剂,但常伴发耐药性及长期免疫抑制所致感染等问题。
经Dicer酶切成月21nt的小干扰RNA(small interfering RNA),siRNA与Dicer/TRBP/
Argonaute2蛋白组装成RISC复合体,随后引导链与目标序列通过碱基互补方式,在核酸酶
活性Ago2作用下对靶RNA进行切割,降解目标序列,下调基因表达。与siRNA发挥RNAi作用相
类似,微小RNA(micro RNA,miRNA)也是生物体内一类具有调控基因表达作用的非编码小
RNA分子,其发夹状前体经Dicer酶切成为21‑24nt的成熟的miRNA,通过与靶基因mRNA碱基
互补配对的方式,启动mRNA降解并下调基因表达,miRNA的表达异常可以与多种疾病发生相
关。RNAi作用调控在生物体发育、细胞程序性凋亡坏死、细胞增殖、免疫和神经系统模式形
成等生命过程中,miRNA的表达与调控发挥着至关重要的作用,其表达异常可以与多种疾病
发生相关。
发明内容
治疗自身免疫性疾病。
NO:1和/或SEQ ID NO:2所示。
(siRNA)、dsRNA、微小RNA、反义核酸,或能表达或形成所述shRNA、小干扰RNA、dsRNA、微小
RNA、反义核酸的构建物等。
anti IL4/anti CD3ε的混合因子作用下,诱导其向Th1细胞分化。
μg/ml。
100nM,小鼠 CD4+T淋巴细胞培养密度为1×10 /mL,培养时间为72‑96小时,转染培养
基为含10%FBS的1640培养基,不含抗生素。
网上,用玻璃棒研磨,边研磨边滴入1640培养基,直至研磨分散的脾细胞全部经滤网流出,
收集脾细胞450g离心10min,去上清重悬,加入等体积淋巴细胞分离液,450g离心30min,吸
取淋巴细胞层,加入PBS重悬,400g离心10min,PBS洗涤后加入红细胞裂解液静置5min,
1500rpm离心10min,收集细胞计数,利用Miltenyi CD4+T细胞分离试剂盒,分离脾淋
6
巴细胞中的 CD4+T淋巴细胞,计数,按1×10 /mL种于6孔板中,加入混合因子诱导其
向Th1细胞分化,培养时间72‑96h。
异性靶向结合,抑制mRNA转录,且正义链或反义链均有一定匹配程度,最小范围干扰无关基
因,经小鼠全基因组范围blast比对,未发现对其他基因表达具有潜在干扰,能够特异性靶
向Th1极化相关基因IFN‑γ、STAT4、Tbx21、IL12Rβ1和IL12Rβ2的表达。
化效果,由此提出了一种抑制小鼠1型辅助性T淋巴细胞分化的生物制剂,可用于抑制Th1细
胞极化所致的免疫系统过度激活,从而开发出一种基于RNAi相关药物用于预防和治疗自身
免疫性疾病。
胞极化培养条件和Ri111转染体系,可快速、方便、高效地进行转染与细胞培养。
附图说明
IFN‑γ和CD4双阳细胞占比,其中正常诱导Th1极化可达74.5%(左),转染Ri111后Th1的极
化比例下降至68.0%(右)。
具体实施方式
eBioscience公司产品;PBS(8.0g NaCl、2.9gNa2HPO4·12H2O、0.2g KCl、0.24g KH2PO4定容
溶解于1000mL去离子水中,调整pH值至7.4,非特殊指出,本文中所用PBS皆为此配方);1640
培养基(2.4g HEPES、2.2g NaHCO3、10g 1640培养基溶解于1000mL去离子水中调整pH值至
7.4,非特殊指出,本文中所用1640培养基皆为此配方);anti‑IL‑14、anti‑CD28、anti‑CD3
ε、IL‑12、IL‑2为美国TONBO公司产品;NEAA美国为Gibco公司产品;鼠脾脏组织淋巴细胞分
离液购于中国灏洋华科生物科技有限公司;Miltenyi CD4+T细胞分离试剂盒购于德
国美天旎公司;TRIzol购于美国sigma公司;RT‑PCR试剂盒为Takara公司产品;Dual‑
Luciferase试剂盒购于美国PROMEGA公司;Ri111、引物购自上海生工生物工程(上海)股份
有限公司,其具体序列如表1所示。
滴入1640培养基,直至研磨分散的脾细胞全部经滤网流出,收集脾细胞450g离心10min,去
上清重悬,加入等体积淋巴细胞分离液,450g离心30min,吸取淋巴细胞层,加入PBS重悬,
400g离心10min,PBS洗涤后加入红细胞裂解液静置5min,1500rpm离心10min,收集细胞计
+ +
数,利用Miltenyi CD4 T细胞分离试剂盒,分离脾淋巴细胞中的 CD4 T淋巴细
胞。
anti CD28:0.5μg/mL,anti IL4:1μg/mL,anti CD3ε:1μg/ml加入NEAA及55μMβ‑巯基乙醇,
培养时间为72h至96h。在细胞培养至36h时,进行半量换液,移除1mL原始培养基,用1mL含
10%FBS的1640完全培养基混合2倍浓度因子、NEAA及55μMβ‑巯基乙醇。
配片段,确保该片段能够高度特异性靶向结合目的3’UTR,单纯抑制mRNA转录;同时,设计该
片段的正义链或反义链均在一定程度匹配目的3’UTR,并经小鼠全基因组范围blast比对,
未发现对其他基因表达具有潜在干扰,能够特异性靶向Th1极化相关基因IFN‑γ、STAT4、
Tbx21、IL12Rβ1和IL12Rβ2的表达,并经体外诱导Th1细胞极化、qPCR检测鉴定目的基因表达
水平等多种手段验证本设计的可靠性,最终筛选出反义核苷酸片段,命名为Ri111。
置15min,形成复合物。将脂质体复合物加入六孔板中,转染体系为100μL,Ri111终浓度为
100nM。36小时左右半量换液。
化培养后Th1分化组与Ri111处理组的细胞,加流式抗体Anti‑mouse CD4‑PE 4℃避光孵育
30min,PBS洗涤,离心,4%中性甲醛固定10min,0.1%Triton破膜10min,0.1%Tween‑20洗
涤,离心,流式抗体Anti‑mouse IFN‑γ‑APC 4℃孵育30min,洗涤,离心,加入PBS,上机检
测。
DTT 2μL、dNTP 1μL、M‑MLV 1μL、RNase inhibitor 1μL制备逆转录混合反应液20μL,在PCR
扩增仪上进行逆转录反应(70℃,10min;42℃,1h;70℃,10min),反应结束后,逆转录产物
cDNA置于冰上或储存于‑20℃保存。q‑PCR检测IL12Rβ1、IL12Rβ2、Tbx21、STAT1、STAT4和
IFN‑γ的基因表达量。其中RT‑PCR引物序列如表1所示。反应体系:cDNA 1μL,PCR上下游引
物(SEQ ID NO:5‑16,10μM)1μL,PT‑PCR Master Mix 10μL和RNA free water 8μL;反应条
件:95℃ 10min,95℃ 15s,60℃ 1min,共40个循环;95℃ 15s,60℃ 1min,95℃ 15s。GAPDH
作为内参,数据采用 法进行分析。
STAT1和IFN‑γ的基因表达水平显著低于Th1分化组。
13000rpm 4℃离心10min,BCA蛋白浓度测定试剂检测蛋白含量。取30μL蛋白样品加上样缓
冲液煮沸变性后,经10%SDS‑PAGE分离后,转移到PVDF膜上,含5%脱脂奶粉室温封闭1h。4
℃过夜孵育一抗,用TBST洗膜3次,加入二抗室温孵育1h,再用TBST洗膜3次,ECL化学发光显
影。
psiCHECK2双荧光素酶报告载体,分别构建IFN‑γ、STAT4、Tbx21、IL12Rβ1和IL12Rβ2的3’
UTR序列(psi‑wt)的克隆。将各psi‑wt载体分别与Ri111或NC(SEQ ID NO:3和/或SEQ ID
NO:4)共同转染至Hela细胞中,进行双荧光素酶报告系统,检测Ri111对IL12‑IFN‑γ通路是
否有一定靶向性。
稀释于20μL Jet Prime Buffer中,加入2μL Jet Prime轻轻混合,室温下静置15min,形成
转染复合物。将脂质体复合物加入80μL DMEM完全培养基,转染体系为100μL,加入96孔板
中,Ri111(或NC)终浓度为100nM。12小时左右弃上清,加入100μL含10%FBS的DMEM完全培养
基。37℃5%CO2孵箱培养,培养时间为36h。
Luciferase的表达。
此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。