一种与Aβ诱导构建的AD细胞模型相关的生物标志物的筛选与应用

摘要

本发明属于生物标志物领域，尤其涉及一种与Aβ诱导构建的AD细胞模型相关的生物标志物的筛选与应用。所述的生物标志物包括如下一种或几种的组合：Cysteine desulfurase，mitochondrial，编码NFS1；NADH dehydrogenase[ubiquinone]1 alpha subcomplex subunit 9，mitochondrial，编码NDUFA9；3‑hydroxyacyl‑CoA dehydrogenase type‑2，编码HSD17B10；Cytochrome c oxidase subunit NDUFA4，编码NDUFA4；NADH‑ubiquinone oxidoreductase 75 kDa subunit，mitochondrial，编码NDUFS1；Succinate dehydrogenase[ubiquinone]iron‑sulfur subunit，mitochondrial，编码SDHB；NADH dehydrogenase[ubiquinone]iron‑sulfur protein 4，mitochondrial，编码NDUFS4；Lipoprotein lipase，编码LPL；NADH dehydrogenase[ubiquinone]1 alpha subcomplex subunit 5，编码NDUFA5。本发明采用蛋白质组学的方法，在Aβ诱导AD细胞模型中发现一组生物标志物，并且发现这些生物标志物在Aβ诱导的AD细胞模型中相互配合，共同发挥重要作用。本发明丰富了检测Aβ诱导构建的AD细胞模型的方法，为临床研究提供新的靶标。

权利要求

1.一种与Aβ诱导构建的AD细胞模型相关的生物标志物的应用，其特征在于，所述应用包括用于检测Aβ1‑42寡聚体诱导SH‑SY5Y细胞构建AD细胞模型是否成功，所述标志物包括如下完整蛋白：蛋白名称为Cysteine desulfurase，mitochondrial，编码基因为NFS1、蛋白名称为NADH dehydrogenase [ubiquinone] 1 alpha subcomplex subunit 9，mitochondrial，编码基因为NDUFA9、蛋白名称为3‑hydroxyacyl‑CoA dehydrogenase type‑2，编码基因为HSD17B10、蛋白名称为Cytochrome c oxidase subunit NDUFA4，编码基因为NDUFA4、蛋白名称为NADH‑ubiquinone oxidoreductase 75 kDa subunit，mitochondrial，编码基因为NDUFS1、蛋白名称为Succinate dehydrogenase [ubiquinone] iron‑sulfur subunit，mitochondrial，编码基因为SDHB、蛋白名称为NADH dehydrogenase [ubiquinone] iron‑sulfur protein 4，mitochondrial，编码基因为NDUFS4、蛋白名称为Lipoprotein lipase，编码基因为LPL以及蛋白名称为NADH dehydrogenase [ubiquinone] 1 alpha subcomplex subunit 5，编码基因为NDUFA5；

与正常对照组相比，AD细胞模型中，Cysteine desulfurase，mitochondrial、NADH dehydrogenase [ubiquinone] 1 alpha subcomplex subunit 9，mitochondrial、3‑hydroxyacyl‑CoA dehydrogenase type‑2、Cytochrome c oxidase subunit NDUFA4、NADH‑ubiquinone oxidoreductase 75 kDa subunit，mitochondrial、Succinate dehydrogenase [ubiquinone] iron‑sulfur subunit，mitochondrial、NADH dehydrogenase [ubiquinone] iron‑sulfur protein 4，mitochondrial以及Lipoprotein lipase上调，NADH dehydrogenase [ubiquinone] 1 alpha subcomplex subunit 5下调；

所述生物标志物的蛋白质氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1 SEQ ID NO.9所示；

~

所述AD为阿尔茨海默病。

2.根据权利要求1所述一种与Aβ诱导构建的AD细胞模型相关的生物标志物的应用，其特征在于，所述应用还包括用于制备检测Aβ诱导AD细胞模型的试剂盒。

3.如权利要求1所述的一种与Aβ诱导构建的AD细胞模型相关的生物标志物的应用，其特征在于，其中相关生物标志物的筛选方法包括如下步骤：（1）构建Aβ诱导的AD细胞；（2）蛋白质提取；（3）蛋白质定量；（4）蛋白质酶解；（5）LC‑MS/MS 分析；（6）数据库检索；（7）生物信息学分析。

4.根据权利要求3所述的一种与Aβ诱导构建的AD细胞模型相关的生物标志物的应用，其特征在于，步骤(6)中，数据库为：Uniprot‑Homo  sapiens  Human‑173343‑

20191013.fasta，物种：人。

5.根据权利要求3所述的一种与Aβ诱导构建的AD细胞模型相关的生物标志物的应用，其特征在于，步骤(7)中，生物信息学分析包括：差异蛋白质的Gene Ontology富集分析、差异蛋白质显著性功能分析、差异蛋白KEGG通路分析以及蛋白质相互作用分析。

说明书

一种与Aβ诱导构建的AD细胞模型相关的生物标志物的筛选与

应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物标志物领域。具体地，本发明涉及一种与Aβ诱导构建的AD细胞模型相关的生物标志物的筛选与应用。

背景技术

[0002] 阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是最常见的中枢神经系统退行性疾病，导致认知功能下降、记忆缺陷、神经精神症状等，占痴呆症的50% 75%。随着人类寿命的延~长，AD的患病率在65岁以后大约每5年翻1倍。目前，AD患者的数量不断攀升，全球超过1.5亿人受到影响，给家庭和社会带来了巨大负担，已经成为公共卫生的全球性挑战。但由于其发病机制的复杂性，目前没有有效的治疗方法来治愈AD或阻止其发展。因此，AD的早期诊断已成为AD防治工作的重点。AD的临床诊断耗时繁琐，需要结合临床评估、心理测试、影像学检查等，以排除其他神经系统疾病。最新指南明确将生物标记物作为AD临床诊断的指标，尤其在AD发病早期，几乎是唯一手段。

[0003] 大量的研究证明在临床诊断AD所致痴呆之前的数十年间AD的病理生理过程就已经开始，而能反映这一过程的生物学标志物在AD临床前期这一进程中基本没有变化，所以生物标记物将在AD的早期诊断、病情进展以及治疗效果的评价中发挥重要作用。蛋白质组学在筛选疾病相关生物标志物上显示出较大优势，在阐明AD的分子致病机制及其导致的病理生理变化方面具有广泛的应用前景。虽然近年来对于AD的生物标记物的的研究取得了突破性的进展，但目前各种生物标记物对AD的早期诊断都有其局限性，因此，开发新的生物标志物，建立标准化检测方法，提高AD的鉴别诊断效率是AD研究仍需努力的方向。

[0004] 细胞模型是研究阿尔茨海默病( Alzheimer’s disease，AD)的有效方法之一，因其具有来源丰富、实验条件易控制、干扰因素小、评价机制灵活的特点而被广泛应用。AD细胞模型为AD发病机制微观层面的研究提供实验对象，并可根据不同的需求选择符合研究目的的细胞模型。Aβ是前体淀粉样蛋白前体蛋白( amy‑ loid precursor protein，APP)经β‑和γ‑分泌酶连续剪切后形成长度在39 ‑42个氨基酸的短肽。APP表达量上升，Aβ产量增加，积聚形成的老年斑是AD的病理学特征之一，目前研究常采用Aβ1‑42、Aβ25‑35 诱导细胞建立AD细胞模型。

[0005] 综上所述，基于蛋白质组学方法，在Aβ诱导AD细胞模型中筛选生物标志物，对于AD的早期诊断与干预显得尤为重要。目前，基于蛋白质组学开发AD细胞模型中的新型生物标志物未见报道。

发明内容

[0006] 为了解决上述问题，本发明提供了一种基于蛋白质组学方法筛选Aβ诱导AD细胞模型中多个标志物，并对筛选出的生物标志物进行包括生物学进程、分子功能等分析发现其在Aβ诱导AD细胞模型中的多个信号通路中相互配合，共同发挥作用，为临床上对于AD预测、诊断、治疗及预后提供新的评估标志物及方法，具有重要意义。

[0007] 为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案。

[0008] 本发明提供了一种与Aβ诱导构建的AD细胞模型相关的生物标志物，其特征在于，所述标志物包括如下完整蛋白的一种或几种的组合：

[0009] 蛋白名称为Cysteine desulfurase，mitochondrial，编码基因为NFS1、蛋白名称为NADH dehydrogenase [ubiquinone] 1 alpha subcomplex subunit 9，mitochondrial，编码基因为NDUFA9、蛋白名称为3‑hydroxyacyl‑CoA dehydrogenase type‑2，编码基因为HSD17B10、蛋白名称为Cytochrome c oxidase subunit NDUFA4，编码基因为NDUFA4、蛋白名称为NADH‑ubiquinone oxidoreductase 75 kDa subunit，mitochondrial，编码基因为NDUFS1、蛋白名称为Succinate dehydrogenase [ubiquinone] iron‑sulfur subunit，mitochondrial，编码基因为SDHB、蛋白名称为NADH dehydrogenase [ubiquinone] iron‑sulfur protein 4，mitochondrial，编码基因为NDUFS4、蛋白名称为Lipoprotein lipase，编码基因为LPL、蛋白名称为NADH dehydrogenase [ubiquinone] 1 alpha subcomplex subunit 5，编码基因为NDUFA5。

[0010] 进一步的，所述标志物包括所述完整蛋白的生物降解产物的一种或几种的组合。

[0011] 进一步地，所述生物标志物的蛋白质氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1 SEQ ID ~NO.9所示。

[0012] 进一步地，所述生物标志物在Aβ诱导AD细胞模型中的多个信号通路中相互配合，共同发挥作用。

[0013] 本发明还提供一种如上所述任一种与Aβ诱导构建的AD细胞模型相关的生物标志物的应用，其特征在于，所述应用包括用于检测Aβ诱导AD细胞模型。

[0014] 进一步次，所述应用还包括用于制备检测Aβ诱导AD细胞模型的试剂盒。

[0015] 本发明还提供一种基于蛋白质组学方法筛选生物标志物的应用，其特征在于，所述应用为用于筛选Aβ诱导构建的AD细胞模型的生物标志物。

[0016] 本发明还提供一种Aβ诱导构建的AD细胞模型相关的生物标志物的筛选方法，其特征在于，所述筛选方法包括如下步骤：（1）构建Aβ诱导的AD细胞；（2）蛋白质提取；（3）蛋白质定量；（4）蛋白质酶解；（5）LC‑MS/MS 分析；（6）数据库检索；（7）生物信息学分析分析。

[0017] 进一步地，所述步骤(6)中，数据库为：Uniprot‑Homo sapiens(Human)‑173343‑20191013.fasta，物种：人。

[0018] 进一步地，所述步骤(7)中，生物信息学分析分析包括：差异蛋白质的Gene Ontology(GO)富集分析、差异蛋白质显著性功能分析、差异蛋白KEGG通路分析以及蛋白质相互作用分析。

[0019] 与现有技术相比，本发明的有益效果如下。

[0020] 本发明采用蛋白质组学的方法，研究筛选正常对照组和Aβ诱导AD细胞模型组的差异蛋白，发现了较为稳定的可用于检测Aβ诱导AD细胞模型的一组生物标志物。对筛选出的差异蛋白进行包括生物学进程、分子功能、细胞组分的GO富集分析、蛋白质相互作用以及KEGG信号通路分析，发现这些参与Metabolic pathways与Alzheimer's disease的生物标志物在Aβ诱导的AD细胞模型中相互配合，共同发挥重要作用。这一结果提供了一种检测Aβ诱导AD细胞模型的评估手段并为临床上对于AD预测、诊断、治疗及预后评估方法的研究提供新的技术手段。

附图说明

[0021] 图1本发明的蛋白质组学技术实验流程图。

具体实施方式

[0022] 下面将结合本发明的实施例和附图，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[0023] 实施方式1。

[0024] 细胞培养。

[0025] 1.1细胞传代：实验前，超净台与细胞间紫外照射 30min 杀菌，通风10min。将配制好的完全培养液、PBS、胰酶由 4℃转移至室温。使用酒精棉球擦拭操作台后点燃酒精灯，将装有细胞的培养瓶从培养箱中取出，观察培养液颜色及清澈度，在显微镜下观察细胞形态、贴壁情况以及融合度，细胞融合度达到 80%左右可进行传代。将细胞转移至超净台内，吸出培养液，加入 PBS，晃动瓶身，吸掉PBS，反复洗涤三次后，加入胰酶，显微镜下可见细胞变圆，快速吸出胰酶，加入完全培养液终止消化。将细胞吹打成单细胞悬液后，转移至离心管中，2000 转离心 1min，缓慢吸去上清，加入 1ml 完全培养液将细胞吹打成单细胞悬液，将单细胞悬液转移至新的培养瓶中，加入 2ml 完全培养液吹匀，另取两个新培养瓶将 3ml 单细胞悬液分装在三瓶中，每瓶再加入 2ml 完全培养液吹匀，瓶口过火后拧紧瓶盖，在瓶上做好标记，放入培养箱中继续培养。

[0026] 1.2细胞冻存：在超净台内，吸去废弃的培养液，加入 PBS，反复三次洗涤，用移液器吸净瓶内 PBS 后，加入胰酶消化细胞，细胞消化成熟后加入完全培养液终止消化，将细胞吹打成单细胞悬液后转移至离心管内，2000 转离心 1min，吸去上清，缓慢滴入1ml 细胞冻存液，将细胞吹打为单细胞悬液后转移至冻存管内，盖紧瓶盖，用封口膜封口，在管壁上做好标记，放入梯度降温盒内，置于‑80℃冰箱保存。

[0027] 1.3细胞复苏：从液氮中取出装有细胞的冻存管，放入提前预热好的 37℃水浴锅内，不断摇动，使细胞在 1min 内溶解，细胞溶解后，1200 转离心 3min，用酒精轻轻擦拭冻存管消毒后转移至超净台内，缓慢吸掉上清，加入含 10%胎牛血清的完全培养液吹打细胞成单细胞悬液，将细胞转移至培养瓶中，加入含 10%胎牛血清的完全培养液，用移液器混匀细胞，瓶盖过火后盖紧，做好标记，放入培养箱内培养。

[0028] 实验分组及Aβ诱导AD细胞模型构建。

[0029] 将处于对数生长期的 SH‑SY5Y 细胞分为2组：对照组和模型组。待细胞贴壁后，对照组给予含10%空白血清的完全培养液；模型组给予含 10%空白血清的完全培养液和终浓度为 20μmol/L的Aβ1‑42寡聚体（根据前期预实验的结果，确定 Aβ1‑42寡聚体的给药浓度）各组加药完成后培养48h。Aβ诱导AD细胞模型组VS正常对照组，为减少实验误差，Aβ诱导AD细胞模型组、正常对照组各设置3个组别。

[0030] 实验技术流程(图1)。

[0031] 3.1 .样本制备。

[0032] （1）取样本加入 300 µL SDT，沸水浴 5min，超声 2min，再沸水浴 5min，4℃ 20000g 离心取上清。

[0033] （2）使用 BCA 法进行蛋白定量。每例样品各取 300ug 蛋白进行 FASP 酶解，每例样品中分别加 DTT 至 100mM，沸水浴 5min，冷却至室温。

[0034] （3）加入 200µL UA buffer (8M Urea，150mM Tris‑HCl，pH8.0)混匀，转入 10KD 超滤离心管，离心 12000g 15min。

[0035] （4）加入 200µL UA buffer 离心 12000g 15min，弃滤液。

[0036] （5）加入 100µL IAA(50mM IAA in UA)，600rpm 振荡 1min，避光室温 30min，离心 12000g 10min。

[0037] （6）加入 100µL UA buffer，离心 12000g 10min 重复 2 次。

[0038] （7）加入 100µL NH4HCO3 buffer，离心 14000g 10min 重复 2 次。

[0039] （8）加入 40µL Trypsin buffer (6µg Trypsin in 40µL NH4HCO3 buffer)， 600rpm 振荡 1min，37℃ 16‑18h。换新收集管，离心 12000g 10min，收集滤液，加入适量 
0.1% TFA 溶液。

[0040] （9）酶解后的肽段使用 C18 Cartridge 脱盐，真空冻干。

[0041] （10）酶解后的肽段干燥后用 0.1% FA 复溶，肽段浓度测定，以备 LC‑MS 分析。

[0042] 3.2.LC‑MS/MS 分析 。

[0043] （1）每例样品取适量肽段使用纳升流速 Easy nLC 1200 色谱系统(Thermo Scientific) 进行色谱分离。

[0044] （2）色谱柱以95%的0.1%甲酸水溶液平衡。

[0045] （3）样品进样到 Trap Column后经过色谱分析柱进行梯度分离。

[0046] （4）肽段分离后用 Q‑Exactive Plus 质谱仪（Thermo Scientific）进行 DDA（数据依赖采集）质谱分析。

[0047] （5）肽段二级质谱分析按照下列方法采集：每次全扫描（full scan）后触发采集 15 个最高强度母离子的二级质谱图谱（MS2 scan），二级质谱分辨率：17,500 @ m/z 200，AGC target: 1e5，二级 Maximum IT：100 ms，MS2 Activation Type: HCD，Isolation window：1.6 Th，Normalized collision energy：27。

[0048] 3.3.质谱鉴定、分析。

[0049] 项目采用的质谱数据库检索软件为 MaxQuant 1.6.0.16。使用Uniprot date base，蛋白质数据库：Uniprot‑Homo sapiens(Human)‑173343‑20191013.fasta，物种：人。

[0050] 结果分析。

[0051] 步骤3.3的分析结果对模型组和正常对照组进行对比实验，定量蛋白质组学研究结果显示：鉴定2232个蛋白；与正常对照组相比，其中符合表达差异倍数大于 2 倍（上、下调）且 P‑value 小于 0.05 的显著性差异表达蛋白质共336个，其中上调蛋白172个，下调蛋白164，两个比较组中差异蛋白的变化倍数为上下调20倍及以上的为有无差异蛋白，有无差异的蛋白共173个。

[0052] 实施方式2。

[0053] 2.1生物信息学分析。

[0054] 利用Panther Classificition System对筛选出的差异蛋白进行包括生物学进程、分子功能和细胞组分的GO富集分析；利用STRING分析软件对差异蛋白进行蛋白质相互作用分析；对差异蛋白进行KEGG信号通路分析。

[0055] 结果分析 。

[0056] 差异蛋白质的Gene Ontology(GO)富集分析。

[0057] 对AD细胞模型和正常对照组表达蛋白分别从细胞生物学过程、细胞组分以及分子功能进行GO功能富集分析。发现差异蛋白在生物学过程中，cellular process、single‑organism process、metabolic process、single‑organism cellular process、cellular metabolic process等显示了较良好的富集效果；在细胞组分中，cell、cell part、intracellular、intracellular part、organelle等显示了较良好的富集效果；在分子功能中，binding、protein binding、organic cyclic compound binding、heterocyclic compound binding、ion binding等显示了较好的富集效果。

[0058] 差异蛋白质显著性功能分析。

[0059] 利用PANTHER蛋白相关通路分析软件对AD模型组和正常对照组差异表达蛋白进行GO功能聚类注释分析，分别从差异蛋白参与的生物学过程、所属的细胞组分及其分子功能，三个发面进行具体分析。分子共发现差异蛋白在细胞参与的生物学过程富集中，在Cellular componet organization or biogenesis、cellular component organization、organelle organization、macromolecular complex subunit organization、organelle organization、macromolecular complex subunit organization、cellular metabolic process、protein complex subunit organization 等过程中有较好的富集效果。在细胞组分富集中，membrane‑bounded organelle、extracellular membrane‑bounded organelle、cytoplasm、extracellular exosome、extracellular vesicle、extracellular organelle、cytoplasmic part、intracellular part、intracellular organelle part、organelle part等显示了较好的富集结果。在分子功能富集中，protein binding、poly（A）RNA binding、binding、identical protein binding、RNA binding、enzyme binding、protein N‑terminus binding、small molecule binding、macromolecular complex binding、protein dimerization activity等显示了较好的富集效果。

[0060] 差异蛋白KEGG通路分析。

[0061] 通过查阅KEGG有关Pathway的主要公共数据库对所鉴定得到的差异蛋白进行KEGG通路注释，共发现186例差异蛋白主要参与的信号通路：Metabolic pathways、Carbon metabolism、Biosynthesis of amino acids、Valine, leucine and isoleucine degradation、Parkinson's disease、Citrate cycle (TCA cycle)、Fatty acid degradation、2‑Oxocarboxylic acid metabolism、Propanoate metabolism、Fatty acid metabolism、PPAR signaling pathway、Huntington's disease、Pentose phosphate pathway、Other glycan degradation、Alzheimer's disease、RNA transport、Oocyte meiosis、Terpenoid backbone biosynthesis、Glycine, serine and threonine metabolism、Pyruvate metabolism等。其中Metabolic pathways发生显著性变化，在本研究鉴定到的差异蛋白中，NFS1是参与该通路的重要蛋白；LPL、NDUFA9、HSD17B10、NDUFA4、NDUFS1、SDHB、NDUFS4、NADUFA5都在Alzheimer's disease通路中发生显著性改变，其中NDUFA9、HSD17B10、NDUFA4、NDUFS1、SDHB、NDUFS4也参与了Metabolic pathways。以此提示，这些参与Metabolic pathways与Alzheimer's disease的差异蛋白在Aβ诱导SH‑SY5Y细胞构建AD细胞模型中起着重要作用。

[0062] 蛋白质相互作用分析。

[0063] 为了研究AD模型组和正常对照组差异表达蛋白之间的相互作用我们对差异表达蛋白进行了STRING分析。结果显示NDUFA9（SDHB、NDUFA5、NDUFS4、NDUFA4）、NDUFS1（NDUFA5）、NDUFS4（SDHB、NDUFA5、NDUFA4）连接程度较高，它们之间形成了紧密相连。以此提示，这些蛋白在Aβ诱导SH‑SY5Y细胞构建AD细胞膜型中，相互配合，共同发挥重要作用。

[0064] 筛选结果

[0065] 。

[0066] 本发明能够可靠、快速的基于蛋白质组学技术方案来发现Aβ诱导SH‑SY5Y细胞构建AD细胞模型的特异性蛋白标记物，为检测Aβ诱导SH‑SY5Y细胞构建AD细胞模型是否成功建立了一种简便、实用的监测评估手段；本发明发现的生物标记物Aβ诱导AD细胞模型中的多个信号通路中相互配合，共同发挥作用。

[0067] 如上所述的实施方式的目的在于对本发明的具体实施方式作进一步的说明，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术方案所作的任何简单修改、变更及等效变化，均仍落入本发明技术方案的保护范围内。