一种CRGD序列肽修饰壳聚糖负载的PAD4抑制剂及其制备方法和应用转让专利
申请号 : CN202110652104.0
文献号 : CN113350296B
文献日 : 2022-07-15
发明人 : 王玉记 , 王彦明 , 贾翌江 , 阿依江 , 朱迪 , 卢玉 , 冯琦琦
申请人 : 首都医科大学
摘要 :
本发明提供了一种CRGD序列肽修饰壳聚糖负载的PAD4抑制剂及其制备方法和应用，属于抗肿瘤药物技术领域。本发明以CRGD序列肽修饰壳聚糖作为药物载体，其中壳聚糖具有具有良好的生物相容性和生物可降解性，CRGD序列肽中的RGD序列肽可以特异性的结合在目标细胞过表达的相应受体上，能够利用肿瘤细胞表面的受体与靶向制剂的配体特异性结合将药物靶向输送至靶区所达到的靶向效果。本发明使用CRGD序列肽修饰壳聚糖来负载PAD4抑制剂，能够增强PAD4抑制剂对目标肿瘤细胞的选择性，减少药物不良反应，使其具有良好的抗肿瘤活性。
权利要求 :
1.一种CRGD序列肽修饰壳聚糖负载的PAD4抑制剂，包括CRGD序列肽修饰壳聚糖载体和负载于CRGD序列肽修饰壳聚糖载体表面的PAD4抑制剂；
所述CRGD序列肽中的半胱氨酸通过丙烯酰氯连接到壳聚糖表面；
所述CRGD序列肽包括CRGDV、CRGDS和CRGDF中的一种或几种；所述CRGDV为半胱氨酸‑精氨酸‑甘氨酸‑天冬氨酸‑缬氨酸，所述CRGDS为半胱氨酸‑精氨酸‑甘氨酸‑天冬氨酸‑苯丙氨酸，所述CRGDF为半胱氨酸‑精氨酸‑甘氨酸‑天冬氨酸‑丝氨酸；
所述PAD4抑制剂包括PAD4抑制剂4B、PAD4抑制剂3B、PAD4抑制剂3B‑OH中的一种或几种；
所述PAD4抑制剂4B的结构式如式1所示：
所述PAD4抑制剂3B的结构式如式2所示：
所述PAD4抑制剂3B‑OH的结构式如式3所示：
2.根据权利要求1所述的CRGD序列肽修饰壳聚糖负载的PAD4抑制剂，其特征在于，所述CRGD序列肽修饰壳聚糖负载的PAD4抑制剂中PAD4抑制剂的负载量为12～18wt％。
3.权利要求1～2任意一项所述CRGD序列肽修饰壳聚糖负载的PAD4抑制剂的制备方法，包括以下步骤：(1)将壳聚糖、丙烯酰氯、第一缚酸剂与第一有机溶剂混合，进行亲核取代反应，得到丙烯酰氯修饰的壳聚糖；
(2)将所述丙烯酰氯修饰的壳聚糖、CRGD序列肽、第二缚酸剂与第二有机溶剂混合，进行迈克尔加成反应，得到CRGD序列肽修饰壳聚糖载体；
(3)将所述CRGD序列肽修饰壳聚糖载体、PAD4抑制剂与第三有机溶剂搅拌混合，得到CRGD序列肽修饰壳聚糖负载的PAD4抑制剂。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述壳聚糖与丙烯酰氯的摩尔比为
1.5～3:1，所述壳聚糖与CRGD序列肽的摩尔比为1～2:1.8。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述壳聚糖与PAD4抑制剂的摩尔比为
1:1～5。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述亲核取代反应的时间为12～24h。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述迈克尔加成反应的时间为12～
24h。
8.权利要求1～2任意一项所述CRGD序列肽修饰壳聚糖负载的PAD4抑制剂或权利要求3～7任意一项所述制备方法制备得到的CRGD序列肽修饰壳聚糖负载的PAD4抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。
说明书 :
一种CRGD序列肽修饰壳聚糖负载的PAD4抑制剂及其制备方法
和应用
技术领域
[0001] 本发明涉及抗肿瘤药物技术领域，特别涉及一种CRGD序列肽修饰壳聚糖负载的 PAD4抑制剂及其制备方法和应用。
背景技术
[0002] 据统计，癌症己经是绝大部分国家人口死亡的主要疾病，癌症细胞生长不受控，从宿主机体汲取养分可以无限生长繁殖，且癌症细胞的种类有很多种，因此对于癌症的治疗是非常具有挑战性的。
[0003] 多肽精氨酸脱亚胺酶4(Peptidylarginine deiminase 4，PAD4)成为癌症的重要靶点之一。PAD4作为p53的辅辅助性抑制剂，能够与组蛋白去乙酰化酶HDAC2共同抑制抑癌基因(例如p21/CDKN1A和GADD45)的表达。但是PAD4具有较低的生物利用度。
[0004] 为提高药物的生物利用度，采用药物载体对药物进行输送是一种常见的办法。发展到今天为止，已经有多种较为成熟药物载体，包括水溶性的高分子量聚合物载体、聚合物纳米颗粒、聚合物胶束、树枝状聚合物、脂质体、病毒粒子、碳纳米管和石墨烯氧化物等，但是，这些载体的主动靶向性往往不高。
发明内容
[0005] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种CRGD序列肽修饰壳聚糖负载的PAD4抑制剂及其制备方法和应用，本发明提供的CRGD序列肽修饰壳聚糖负载的PAD4抑制剂具有良好的主动靶向性和抗肿瘤活性。
[0006] 为了实现上述发明的目的，本发明提供以下技术方案：
[0007] 本发明提供了一种CRGD序列肽修饰壳聚糖负载的PAD4抑制剂，包括CRGD序列肽修饰壳聚糖载体和负载于CRGD序列肽修饰壳聚糖载体表面的PAD4抑制剂；
[0008] 所述CRGD序列肽中的半胱氨酸通过丙烯酰氯连接到壳聚糖表面。
[0009] 优选的，所述CRGD序列肽包括CRGDV、CRGDS和CRGDF中的一种或几种。
[0010] 优选的，所述PAD4抑制剂包括PAD4抑制剂4B、PAD4抑制剂3B、PAD4抑制剂 3B‑OH中的一种或几种。
[0011] 优选的，所述CRGD序列肽修饰壳聚糖负载的PAD4抑制剂中PAD4抑制剂的负载量为12～18wt％。
[0012] 本发明提供了上述CRGD序列肽修饰壳聚糖负载的PAD4抑制剂的制备方法，包括以下步骤：
[0013] (1)将壳聚糖、丙烯酰氯、第一缚酸剂与第一有机溶剂混合，进行亲核取代反应，得到丙烯酰氯修饰的壳聚糖；
[0014] (2)将所述丙烯酰氯修饰的壳聚糖、CRGD序列肽、第二缚酸剂与第二有机溶剂混合，进行迈克尔加成反应，得到CRGD序列肽修饰壳聚糖载体；
[0015] (3)将所述CRGD序列肽修饰壳聚糖载体、PAD4抑制剂与第三有机溶剂搅拌混合，得到CRGD序列肽修饰壳聚糖负载的PAD4抑制剂。
[0016] 优选的，所述壳聚糖与丙烯酰氯的摩尔比为1.5～3:1，所述壳聚糖与CRGD序列肽的摩尔比为1～2:1.8。
[0017] 优选的，所述壳聚糖与PAD4抑制剂的摩尔比为1:1～5。
[0018] 优选的，所述亲核取代反应的时间为12～24h。
[0019] 优选的，所述迈克尔加成反应的时间为12～24h。
[0020] 本发明提供了上述CRGD序列肽修饰壳聚糖负载的PAD4抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。
[0021] 本发明提供了一种CRGD序列肽修饰壳聚糖负载的PAD4抑制剂，本发明以CRGD 序列肽修饰壳聚糖作为药物载体，其中壳聚糖具有具有良好的生物相容性和生物可降解性，CRGD序列肽中的RGD序列肽可以特异性的结合在目标细胞过表达的相应受体上，能够利用肿瘤细胞表面的受体与靶向制剂的配体特异性结合将药物靶向输送至靶区所达到的靶向效果。本发明使用CRGD序列肽修饰壳聚糖来负载PAD4抑制剂，能够增强 PAD4抑制剂对目标肿瘤细胞的选择性，减少药物不良反应，使其具有良好的抗肿瘤活性。实施例结果表明，通过活性评价，显示本发明提供的CRGD序列肽修饰壳聚糖负载的 PAD4抑制剂具有良好的抗肿瘤效果。
[0022] 本发明提供了上述CRGD序列肽修饰壳聚糖负载的PAD4抑制剂的制备方法，此法操作简单，易于实现工业化批量生产。
附图说明
[0023] 图1为CRGD序列肽修饰壳聚糖负载的PAD4抑制剂的结构示意图；
[0024] 图2为壳聚糖的红外光谱图；
[0025] 图3为壳聚糖‑CRGDV的红外光谱图；
[0026] 图4为壳聚糖‑CRGDF的红外光谱图；
[0027] 图5为壳聚糖‑CRGDS的红外光谱图；
[0028] 图6为4B的红外光谱图；
[0029] 图7为CRGDV‑壳聚糖‑4B的红外光谱图；
[0030] 图8为3B的红外光谱图如图8所示；
[0031] 图9为CRGDV‑壳聚糖‑3B的红外光谱图；
[0032] 图10为3B‑OH的红外光谱图；
[0033] 图11为CRGDV‑壳聚糖‑3B‑OH的红外光谱图；
[0034] 图12为壳聚糖的1H NMR图；
[0035] 图13为壳聚糖‑丙烯酰氯的1H NMR图；
[0036] 图14为壳聚糖‑CRGDV的1HNMR图；
[0037] 图15为壳聚糖‑CRGDF的1H NMR图；
[0038] 图16为壳聚糖‑CRGDS的1H NMR图；
[0039] 图17为CRGDV‑壳聚糖‑4B的1H NMR图；
[0040] 图18为CRGDV‑壳聚糖‑3B的1H NMR图；
[0041] 图19为CRGDV‑壳聚糖‑3B‑OH的1H NMR图；
[0042] 图20为壳聚糖的透射电镜图；
[0043] 图21为壳聚糖‑CRGDV的透射电镜图；
[0044] 图22为壳聚糖‑CRGDF的透射电镜图；
[0045] 图23为壳聚糖‑CRGDS的透射电镜图；
[0046] 图24为壳聚糖‑CRGDV：4B＝1:1的透射电镜图；
[0047] 图25为壳聚糖‑CRGDV：4B＝1:2的透射电镜图；
[0048] 图26为壳聚糖‑CRGDV：4B＝1:3的透射电镜图；
[0049] 图27为壳聚糖‑CRGDV：4B＝1:4的透射电镜图；
[0050] 图28为壳聚糖‑CRGDV：4B＝1:5的透射电镜图；
[0051] 图29为壳聚糖：4B＝1:3的透射电镜图；
[0052] 图30为壳聚糖‑CRGDV：3B＝1:3的透射电镜图；
[0053] 图31为壳聚糖‑CRGDV：3B‑OH＝1:3的透射电镜图；
[0054] 图32为4B(4‑羧基苯硼酸‑Orn(Cl)‑NBzl)的标准曲线图。
具体实施方式
[0055] 本发明提供了一种CRGD序列肽修饰壳聚糖负载的PAD4抑制剂，包括CRGD序列肽修饰壳聚糖载体和负载于CRGD序列肽修饰壳聚糖载体表面的PAD4抑制剂；
[0056] 所述CRGD序列肽中的半胱氨酸通过丙烯酰氯连接到壳聚糖表面。
[0057] 在本发明中，所述CRGD序列肽优选包括CRGDV、CRGDS和CRGDF中的一种或几种。在本发明中，所述CRGDV为半胱氨酸‑精氨酸‑甘氨酸‑天冬氨酸‑缬氨酸，所述 CRGDS为半胱氨酸‑精氨酸‑甘氨酸‑天冬氨酸‑苯丙氨酸，所述CRGDF为半胱氨酸‑精氨酸‑甘氨酸‑天冬氨酸‑丝氨酸。
[0058] 在本发明中，所述PAD4抑制剂优选包括PAD4抑制剂4B、PAD4抑制剂3B、PAD4 抑制剂3B‑OH中的一种或几种。在本发明中，所述PAD4抑制剂4B为(s)‑(4‑((1‑ (苄氨基)‑5‑(2‑氯乙酰胺酰胺)‑1‑氧代戊烷‑2‑甲基)碳酰基)苯基)硼酸，所述PAD4 抑制剂4B的结构式如式1所示：
[0059]
[0060] 在本发明中，所述PAD4抑制剂3B为(s)‑(3‑((1‑(苄氨基)‑5‑(2‑氯乙酰胺酰胺)‑1‑氧代戊烷‑2‑甲基)碳酰基)苯基)硼酸，所述PAD4抑制剂3B的结构式如式2 所示：
[0061]
[0062] 在本发明中，所述PAD4抑制剂3B‑OH为(s)‑4‑((2‑(3‑硼硼酰胺)‑5‑(2‑氯乙酰胺)戊醛)甲基)苯甲酸，所述PAD4抑制剂3B‑OH放入结构式如式3所示：
[0063]
[0064] 在本发明中，所述CRGD序列肽修饰壳聚糖负载的PAD4抑制剂中PAD4抑制剂的负载量优选为12～18wt％，优选的为14.2wt％。
[0065] 本发明提供了上述CRGD序列肽修饰壳聚糖负载的PAD4抑制剂的制备方法，包括以下步骤：
[0066] (1)将壳聚糖、丙烯酰氯、第一缚酸剂与第一有机溶剂混合，进行亲核取代反应，得到丙烯酰氯修饰的壳聚糖；
[0067] (2)将所述丙烯酰氯修饰的壳聚糖、CRGD序列肽、第二缚酸剂与第二有机溶剂混合，进行迈克尔加成反应，得到CRGD序列肽修饰壳聚糖载体；
[0068] (3)将所述CRGD序列肽修饰壳聚糖载体、PAD4抑制剂与第三有机溶剂搅拌混合，得到CRGD序列肽修饰壳聚糖负载的PAD4抑制剂。
[0069] 本发明将壳聚糖、丙烯酰氯、第一缚酸剂与第一有机溶剂混合，进行亲核取代反应，得到丙烯酰氯修饰的壳聚糖。在本发明中，所述第一有机溶剂优选为N，N‑二甲基甲酰胺。在本发明中，所述第一缚酸剂优选为三乙胺。
[0070] 本发明对所述壳聚糖的种类没有特殊的要求，使用本领域常规市售的壳聚糖即可。在本发明中，所述壳聚糖与丙烯酰氯的摩尔比为优选1.5～3：1，更优选为2:1，所述壳聚糖与第一缚酸剂的摩尔比优选为1～2:1.8。在本发明中，所述丙烯酰氯优选以丙烯酰氯的二氯甲烷溶液加入。
[0071] 在本发明中，所述混合的方式优选为：先将壳聚糖、第一缚酸剂与第一有机溶剂混合，冷却至0℃，再滴加丙烯酰氯的二氯甲烷溶液。
[0072] 在本发明中，所述亲核取代反应优选在搅拌的条件下进行，所述亲核取代反应的温度优选为室温，时间优选为12～24h，更优选为16～20h。所述亲核反应过程中，丙烯酰氯与壳聚糖上的氨基或者羟基发生亲核取代。
[0073] 在本发明中，所述亲核取代反应后，本发明优选对所得亲核取代反应液进行后处理，所述后处理优选包括以下步骤：
[0074] 对所得亲核取代反应液依次进行透析和冻干，得到丙烯酰氯修饰的壳聚糖固体。本发明优选使用蒸馏水进行所述透析，透析时透析袋的截留分子量为700～1000Da。在本发明中，所述透析的时间优选为48h。本发明对所述冻干的方式没有特殊的要求，使用本领域技术人员熟知的冻干方式即可。
[0075] 得到所述丙烯酰氯修饰的壳聚糖后，本发明将所述丙烯酰氯修饰的壳聚糖、CRGD 序列肽、第二缚酸剂与第二有机溶剂混合，进行迈克尔加成反应，得到CRGD序列肽修饰壳聚糖载体。
[0076] 在本发明中，所述CRGD序列肽优选包括CRGDV、CRGDS和CRGDF中的一种或几种。在本发明中，所述CRGDV的制备方法，优选包括以下步骤：
[0077] (1)使用有机溶剂对Fmoc‑Val‑Wang resin进行浸泡，得到溶胀Fmoc‑Val‑Wang resin；
[0078] (2)对所述溶胀Fmoc‑Val‑Wang resin进行脱保护反应，得到脱保护Fmoc‑Val‑Wang resin；
[0079] (3)将所述脱保护Fmoc‑Val‑Wang resin、Fmoc‑Asp(OtBu)、缩合剂和偶联剂混合，进行固相合成；
[0080] (4)重复步骤(2)～(3)，直至最后一个氨基酸后脱保护；
[0081] (5)将步骤(4)所得产物与甲醇混合，除甲醇后加入裂解液进行裂解反应，得到 CRGDV。
[0082] 本发明使用有机溶剂对Fmoc‑Val‑Wang resin进行浸泡，得到溶胀Fmoc‑Val‑Wang resin。在本发明中，所述有机溶剂优选为无水DMF；所述溶胀的时间优选为3～6h。
[0083] 本发明对所述溶胀Fmoc‑Val‑Wang resin进行脱保护反应，得到脱保护 Fmoc‑Val‑Wang resin。在本发明中，所述脱保护反应之前，本发明优选对溶胀 Fmoc‑Val‑Wang resin进行减压抽滤，除去有机溶剂。在本发明中，所述脱保护试剂优选为无水DMF和六氢吡啶，所述无水DMF和六氢吡啶的体积比优选为4:1。在本发明中，所述脱保护反应优选分两次进行，先加入一次脱保护试剂，震荡反应3min后，减压抽滤除去脱保护剂后，再加入一次脱保护试剂，震荡反应8min，减压抽滤除去脱保护试剂。除去脱保护试剂后，本发明优选对所述脱保护Fmoc‑Val‑Wang resin进行洗涤，所述洗涤用洗涤剂优选依次为无水DMF、CH2Cl2和无水DMF，每种洗涤剂洗涤的次数优选为2 次。
[0084] 所述洗涤后，本发明优选使用茚三酮法检测‑NH2，显深紫色。
[0085] 本发明将所述脱保护Fmoc‑Val‑Wang resin、Fmoc‑Asp(OtBu)、缩合剂和偶联剂混合，进行固相合成。在本发明中，所述缩合剂优选为HBTU，所述偶联剂优选为无水DMF 和N‑甲基吗啉，所述无水DMF和N‑甲基吗啉的体积比优选为95:5。在本发明中，所述固相合成的时间优选为45min。
[0086] 所述固相合成后，本发明优选对所述固相合成产物进行洗涤，所述洗涤用洗涤剂优选依次为无水DMF、CH2Cl2和无水DMF，每种洗涤剂洗涤的次数优选为2次。
[0087] 所述洗涤后，本发明优选使用茚三酮法检测树脂，显无色透明。
[0088] 本发明重复步骤(2)～(3)，直至最后一个氨基酸后脱保护。
[0089] 本发明将步骤(4)所得产物与甲醇混合，除甲醇后加入裂解液进行裂解反应，得到CRGDV。在本发明中，所述裂解液优选为三氟乙酸：水：三异丙基硅烷：1,2‑乙二硫醇＝92.5:2.5:2.5:2.5。在本发明中，所述裂解反应优选在冰浴条件下进行，所述裂解反应的时间优选为2.5。
[0090] 在本发明中，所述裂解反应后，本发明优选对所得反应液进行过滤，将滤液中的三氟乙酸用氮气吹干。然后向滤液中加入冰乙醚洗涤，洗涤三次，离心弃上清得到CRGDV。
[0091] 在本发明中，所述CRGDF的制备方法与所述CRGDV的制备方法相似，区别在于，步骤(1)的Fmoc‑Val‑Wang resin替换为Fmoc‑Val‑Wang resin。
[0092] 在本发明中，所述CRGDS的制备方法与所述CRGDV的制备方法相似，区别在于，步骤(1)的Fmoc‑Val‑Wang resin替换为Fmoc‑Ser‑Wang resin。
[0093] 本发明将所述丙烯酰氯修饰的壳聚糖、CRGD序列肽、三乙胺与第二有机溶剂混合，进行迈克尔加成反应，得到CRGD序列肽修饰壳聚糖载体。在本发明中，所述第二有机溶剂优选为二甲基亚砜和/或二氧六环，当所述第二有机溶剂为二甲基亚砜和二氧六环时，所述二甲基亚砜和二氧六环的体积比优选为1:1。在本发明中，所述第二缚酸剂优选为三乙胺。
[0094] 在本发明中，所述壳聚糖与CRGD序列肽的摩尔比优选为1:1.8，所述壳聚糖与第二缚酸剂的摩尔比优选为1:0.7。在本发明中，所述迈克尔加成反应优选在搅拌的条件下进行，所述迈克尔加成反应的温度优选为室温，时间优选为12～24h，更优选为16～20h。在本发明中，亲核取代反应中接到壳聚糖的丙烯酰氯的双键，与CRGD肽链中半胱氨酸侧链巯基发生迈克尔加成反应。
[0095] 在本发明中，所述迈克尔加成反应后，本发明优选对所得迈克尔加成反应液进行后处理，所述后处理优选包括以下步骤：
[0096] 对所得迈克尔加成反应液依次进行透析和冻干，得到CRGD序列肽修饰壳聚糖载体固体。本发明优选使用蒸馏水进行所述透析，透析时透析袋的截留分子量为700～1000Da。在本发明中，所述透析的时间优选为48h。本发明对所述冻干的方式没有特殊的要求，使用本领域技术人员熟知的冻干方式即可。
[0097] 得到所述CRGD序列肽修饰壳聚糖载体后，本发明将所述CRGD序列肽修饰壳聚糖载体、PAD4抑制剂与第三有机溶剂搅拌混合，得到CRGD序列肽修饰壳聚糖负载的 PAD4抑制剂。在本发明中，所述PAD4抑制剂优选包括PAD4抑制剂4B、PAD4抑制剂 3B、PAD4抑制剂3B‑OH中的一种或几种。本发明对所述PAD4抑制剂4B、PAD4抑制剂3B、PAD4抑制剂3B‑OH的来源没有特殊的要求，使用本领域常规市售的上述物质或自行制备均可。
[0098] 在本发明中，所述第三有机溶剂优选为二甲基亚砜和/或二氧六环，当所述第二有机溶剂为二甲基亚砜和二氧六环时，所述二甲基亚砜和二氧六环的体积比优选为1:1。
[0099] 在本发明中，所述壳聚糖与PAD4抑制剂的摩尔比优选为1:1～5，更优选为1:2～4，进一步优选为1:3。
[0100] 在本发明中，所述搅拌混合的温度优选为室温，时间优选为8h。
[0101] 在本发明中，所述搅拌混合后，本发明优选对所得迈克尔加成反应液进行后处理，所述后处理优选包括以下步骤：
[0102] 对所得迈克尔加成反应液依次进行透析和冻干，得到CRGD序列肽修饰壳聚糖载体固体。本发明优选使用蒸馏水进行所述透析，透析时透析袋的截留分子量为700～1000Da。在本发明中，所述透析的时间优选为24h。本发明对所述冻干的方式没有特殊的要求，使用本领域技术人员熟知的冻干方式即可。
[0103] 在本发明中，所述CRGD序列肽修饰壳聚糖负载的PAD4抑制剂的结构示意图如图 1所示。
[0104] 本发明提供了上述CRGD序列肽修饰壳聚糖负载的PAD4抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。
[0105] 下面结合实施例对本发明提供的CRGD序列肽修饰壳聚糖负载的PAD4抑制剂及其制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0106] 实施例1
[0107] (一)CRGD序列肽的合成
[0108] (1)CRGDV的固相合成
[0109] 1)溶胀：在固相合成管中，用10mL无水DMF对300mg Fmoc‑Val‑Wang resin浸泡3h，使其溶胀。
[0110] 2)脱保护：减压抽滤除去无水DMF，并加入8‑10mL脱保护剂(无水DMF:六氢吡啶＝4:1)，振荡反应3min后，减压抽滤除去脱保护剂，再加入8‑10mL脱保护剂，振荡反应8min。
[0111] 3)洗涤：减压抽滤除去脱保护剂，依次用无水DMF、CH2Cl2、无水DMF洗涤，每种溶液洗两次。
[0112] 4)显色：茚三酮法检测树脂(检测‑NH2)，显深紫色。
[0113] 5)偶联：称量Fmoc‑Asp(OtBu)和缩合剂HBTU，用偶联剂(无水DMF:N‑甲基吗啉＝95:5)溶解，加入到固相合成管中，振荡反应45min。
[0114] 6)洗涤：减压抽滤除去偶联剂，依次用无水DMF、CH2Cl2、无水DMF洗涤，每种溶液洗两次。
[0115] 7)显色：茚三酮法检测树脂，显无色透明。
[0116] 重复2～7步骤直至合成到最后一个氨基酸后脱保护。
[0117] 8)甲醇收缩：向固相合成管中加入甲醇，减压抽滤除去甲醇，重复三次，将树脂转移到10mL的试剂瓶中。
[0118] 9)裂解：将3mL裂解液(三氟乙酸：水：三异丙基硅烷：1,2‑乙二硫醇＝92.5:2.5:2.5:2.5) 加入到试剂瓶中，冰水浴下搅拌反应2.5h。反应结束后过滤，将滤液中的三氟乙酸用氮气吹干。然后向滤液中加入冰乙醚洗涤，洗涤三次，离心弃上清得到CRGDV。
[0119] (2)CRGDF的固相合成
[0120] 采用与CRGDV相同的制备方法，以300mg Fmoc‑Phe‑Wang resin为原料得到 CRGDF。
[0121] (3)CRGDS的固相合成
[0122] 采用与CRGDV相同的制备方法，以300mg Fmoc‑Ser‑Wang resin为原料得到 CRGDS。
[0123] (二)PAD4抑制剂的合成
[0124] (1)4B(4‑羧基苯硼酸‑Orn(Cl)‑NBzl)的合成
[0125] 1)Boc‑Orn(Cbz)‑NBzl的制备：
[0126] 将Boc‑Orn(Cbz)‑OH 10mmol溶于20mL无水四氢呋喃(THF)中，冰浴条件下加入N‑羟基苯并三氮唑(HOBt)12mmol，并使完全溶解，缓慢加入二环己基羰二亚胺(DCC) 12mmol，搅拌30min，得到反应液A。冰浴条件下将12mmol苄胺溶于20mL无水THF 中加至反应液A中，加入1mLN‑甲基吗啉(NMM)，调pH 8～9。冰浴搅拌1h，再室温搅拌48h，TLC(氯仿:甲醇＝20:1)显示Boc‑Orn(Cbz)‑OH消失。滤除二环己基脲(DCU)，减压蒸去THF。残留物用50ml乙酸乙酯(EA)溶解，所得溶液依次用饱和NaHCO3水溶液、饱和NaCl水溶液、5％KHSO4水溶液、饱和NaCl水溶液、饱和NaHCO3水溶液、饱和NaCl水溶液洗三次，乙酸乙酯层用无水Na2SO4干燥，减压抽滤除干燥剂，滤液减压浓缩至干，得到化合物Boc‑Orn(Cbz)‑NBzl。
[0127] 2)HCl·H‑Orn(Cbz)‑NBzl的制备：
[0128] 将Boc‑Orn(Cbz)‑NBzl(10mmol)用少量干燥乙酸乙酯溶解，冰浴搅拌下加入4N HCl/EtOAc溶液，TLC(EA：H2O：HAc＝4:1:2d)显示原料点消失，溶液用水泵抽干，加入无水乙醚，再次用水泵将反应液抽干，反复三次，得到HCl·H‑Orn(Cbz)‑NBzl。
[0129] 3)4‑羧基苯硼酸‑Orn(Cbz)‑NBzl的制备：
[0130] 将4‑羧基苯硼酸10mmol溶于20mL无水四氢呋喃(THF)中，冰浴条件下加入 N‑羟基苯并三氮唑(HOBt)12mmol，并使完全溶解，缓慢加入二环己基羰二亚胺(DCC) 12mmol，搅拌30min，得到反应液A。冰浴条件下将12mmol HCl·H‑Orn(Cbz)‑NBzl溶于20mL无水THF中加至反应液A中，加入1mLN‑甲基吗啉(NMM)，调pH 8～9。冰浴搅拌1h，再室温搅拌48h，TLC(氯仿:甲醇＝20:1)显示4‑羧基苯硼酸消失。滤除二环己基脲(DCU)，减压蒸去THF。残留物用
50ml乙酸乙酯(EA)溶解，所得溶液依次用饱和NaHCO3水溶液、饱和NaCl水溶液、5％KHSO4水溶液、饱和NaCl水溶液、饱和NaHCO3水溶液、饱和NaCl水溶液洗三次，乙酸乙酯层用无水Na2SO4干燥，减压抽滤除干燥剂，滤液减压浓缩至干，得到化合物4‑羧基苯硼酸‑Orn(Cbz)‑NBzl。
50ml乙酸乙酯(EA)溶解，所得溶液依次用饱和NaHCO3水溶液、饱和NaCl水溶液、5％KHSO4水溶液、饱和NaCl水溶液、饱和NaHCO3水溶液、饱和NaCl水溶液洗三次，乙酸乙酯层用无水Na2SO4干燥，减压抽滤除干燥剂，滤液减压浓缩至干，得到化合物4‑羧基苯硼酸‑Orn(Cbz)‑NBzl。
[0131] 4)4‑羧基苯硼酸‑Orn‑NBzl的制备：
[0132] 将4‑羧基苯硼酸‑Orn(Cbz)‑NBzl 10mmol用适量甲醇搅拌溶解，加入Pd/C适量，反应体系保持密闭，用三通抽出空气，通入装在气袋内的氢气，再用三通抽气，如此反复置换反应体系中的空气，三通最终停留在通氢气状态下，保持氢气环境室温搅拌直至原料点消失，TLC监测。反应毕，减压过滤去除Pd/C，滤液减压浓缩至干，得到化合物 4‑羧基苯硼酸‑Orn‑NBzl。
[0133] 5)4B(4‑羧基苯硼酸‑Orn(Cl)‑NBzl)的制备：
[0134] 将4‑羧基苯硼酸‑Orn‑NBzl 1mmol用适量无水甲醇搅拌溶解，冰水浴下，加入5 mmol 2‑氯乙酰亚氨酸乙酯盐酸盐，并用N,N‑二异丙基乙胺(DIPEA)调pH至10。室温搅拌12h，TLC(EA：H2O：HAc＝4:1:2d)显示4‑羧基苯硼酸‑Orn‑NBzl消失，减压浓缩至干， C18柱层析纯化，得到4B(4‑羧基苯硼酸‑Orn(Cl)‑NBzl)。
[0135] (2)3B(3‑羧基苯硼酸‑Orn(Cl)‑NBzl)的合成
[0136] 采用与4B(4‑羧基苯硼酸‑Orn(Cl)‑NBzl)相同的制备方法，以3‑羧基苯硼酸得到 3B(3‑羧基苯硼酸‑Orn(Cl)‑NBzl)。
[0137] (3)3B‑OH(3‑羧基苯硼酸‑Orn(Cl)‑NBzl)的合成
[0138] 1)3‑羧基苯硼酸‑Orn(Boc)‑OBzl的制备：
[0139] 将3‑羧基苯硼酸10mmol溶于20mL无水四氢呋喃(THF)中，冰浴条件下加入 N‑羟基苯并三氮唑(HOBt)12mmol，并使完全溶解，缓慢加入二环己基羰二亚胺(DCC) 12mmol，搅拌30min，得到反应液A。冰浴条件下将12mmol HCl·H‑Orn(Boc)‑OBzl 溶于20mL无水THF中加至反应液A中，加入1mLN‑甲基吗啉(NMM)，调pH 8～9。冰浴搅拌1h，再室温搅拌48h，TLC(氯仿:甲醇＝20:1)显示3‑羧基苯硼酸消失。滤除二环己基脲(DCU)，减压蒸去THF。残留物用
50ml乙酸乙酯(EA)溶解，所得溶液依次用饱和NaHCO3水溶液、饱和NaCl水溶液、5％KHSO4水溶液、饱和NaCl水溶液、饱和 NaHCO3水溶液、饱和NaCl水溶液洗三次，乙酸乙酯层用无水Na2SO4干燥，减压抽滤除干燥剂，滤液减压浓缩至干，得到化合物3‑羧基苯硼酸‑Orn(Boc)‑OBzl。
50ml乙酸乙酯(EA)溶解，所得溶液依次用饱和NaHCO3水溶液、饱和NaCl水溶液、5％KHSO4水溶液、饱和NaCl水溶液、饱和 NaHCO3水溶液、饱和NaCl水溶液洗三次，乙酸乙酯层用无水Na2SO4干燥，减压抽滤除干燥剂，滤液减压浓缩至干，得到化合物3‑羧基苯硼酸‑Orn(Boc)‑OBzl。
[0140] 2)3‑羧基苯硼酸‑Orn(Boc)‑OH的制备：
[0141] 将3‑羧基苯硼酸‑Orn(Boc)‑OBzl 10mmol用适量甲醇搅拌溶解，加入Pd/C适量，反应体系保持密闭，用三通抽出空气，通入装在气袋内的氢气，再用三通抽气，如此反复置换反应体系中的空气，三通最终停留在通氢气状态下，保持氢气环境室温搅拌直至原料点消失，TLC监测。反应毕，减压过滤去除Pd/C，滤液减压浓缩至干，得到化合物3‑ 羧基苯硼酸‑Orn(Boc)‑OH。
[0142] 3)3‑羧基苯硼酸‑Orn(Boc)‑4‑氨基苯甲酸甲酯的制备：
[0143] 将3‑羧基苯硼酸‑Orn(Boc)‑OH 10mmol溶于20mL无水四氢呋喃(THF)中，冰浴条件下加入N‑羟基苯并三氮唑(HOBt)12mmol，并使完全溶解，缓慢加入二环己基羰二亚胺(DCC)12mmol，搅拌30min，得到反应液A。冰浴条件下将12mmol 4‑氨基苯甲酸甲酯溶于20mL无水THF中加至反应液A中，加入1mLN‑甲基吗啉(NMM)，调pH 8～9。冰浴搅拌1h，再室温搅拌48h，TLC(氯仿:甲醇＝20:1)显示3‑羧基苯硼酸‑Orn(Boc)‑OH 消失。滤除二环己基脲(DCU)，减压蒸去THF。残留物用50ml乙酸乙酯(EA)溶解，所得溶液依次用饱和NaHCO3水溶液、饱和NaCl水溶液、5％KHSO4水溶液、饱和NaCl 水溶液、饱和NaHCO3水溶液、饱和NaCl水溶液洗三次，乙酸乙酯层用无水Na2SO4干燥，减压抽滤除干燥剂，滤液减压浓缩至干，得到化合物3‑羧基苯硼酸‑Orn(Boc)‑4‑氨基苯甲酸甲酯。
[0144] 4)3‑羧基苯硼酸‑Orn(Boc)‑4‑氨基苯甲酸的制备：
[0145] 将3‑羧基苯硼酸‑Orn(Boc)‑4‑氨基苯甲酸甲酯用适量甲醇搅拌溶解，冰水浴下，用 2N NaOH溶液调节pH至13，冰水浴下反应6h，TLC(氯仿:甲醇＝20:1)显示3‑羧基苯硼酸‑Orn(Boc)‑4‑氨基苯甲酸甲酯消失。用饱和KHSO4水溶液调节反应液pH至中性，减压浓缩至干，残留物用适量饱和NaCl水溶液溶解，用饱和KHSO4水溶液调节pH至2，水层用乙酸乙酯萃取3次，乙酸乙酯层用无水Na2SO4干燥，减压抽滤除干燥剂，滤液减压浓缩至干，得到化合物3‑羧基苯硼酸‑Orn(Boc)‑4‑氨基苯甲酸。
[0146] 5)3‑羧基苯硼酸‑Orn‑4‑氨基苯甲酸的制备：
[0147] 将物3‑羧基苯硼酸‑Orn(Boc)‑4‑氨基苯甲酸用少量干燥乙酸乙酯溶解，冰浴搅拌下加入4N HCl/EtOAc溶液，TLC(EA：H2O：HAc＝4:1:2d)显示原料点消失，溶液用水泵抽干，加入无水乙醚，再次用水泵将反应液抽干，反复三次，得到3‑羧基苯硼酸‑Orn‑4‑氨基苯甲酸。
[0148] 6)3B‑OH(3‑羧基苯硼酸‑Orn(Cl)‑4‑氨基苯甲酸)的制备：
[0149] 将3‑羧基苯硼酸‑Orn‑4‑氨基苯甲酸1mmol用适量无水甲醇搅拌溶解，冰水浴下，加入5mmol 2‑氯乙酰亚氨酸乙酯盐酸盐，并用N,N‑二异丙基乙胺(DIPEA)调pH至10。室温搅拌12h，TLC(EA：H2O：HAc＝4:1:2d)显示3‑羧基苯硼酸‑Orn‑4‑氨基苯甲酸消失，减压浓缩至干，C18柱层析纯化，得到3B‑OH(3‑羧基苯硼酸‑Orn(Cl)‑4‑氨基苯甲酸)。
[0150] 实施例2 CRGDV‑壳聚糖‑4B的合成
[0151] (一)壳聚糖‑丙烯酰氯的合成
[0152] 首先，将壳聚糖(0.6g、0.20mmol)和三乙胺(Et3N、50μL、0.36mmol)溶解在 20mLN，N‑二甲基甲酰胺(DMF)中。0℃冷却后，将在8mL二氯甲烷溶液中的丙烯酰氯(8μL，0.10mmol)滴加到搅拌的溶液中。反应在室温下进行24小时，然后用蒸馏水透析(截留分子量为700～1000Da)48小时。冻干后获得淡黄色固体。
[0153] (二)壳聚糖‑CRGDV的合成
[0154] 将壳聚糖‑丙烯酰氯(0.3g、0.10mmol)和CRGDV(98mg、0.18mmol)溶于5mL 二甲基亚砜中，并在室温下添加Et3N(10μL、0.07mmol)。反应在室温下搅拌12～24 小时，并用蒸馏水透析(MWCO：700～1000Da)48小时。冻干后，得到淡黄色固体。
[0155] (三)CRGDV‑壳聚糖‑4B的合成
[0156] 将PAD4抑制剂4B(5mg、10μmol)与不同量的壳聚糖‑CRGDV(32mg、10μmol；16mg、5μmol；10.56mg、3.3μmol；8mg、2.5μmol；6.4mg、2μmol)溶解在5mL无水DMSO 中。反应在室温下搅拌8h，然后将反应混合物用蒸馏水透析(MWCO：1000Da)24小时。然后将所得溶液冻干以获得4B：壳聚糖‑CRGDV＝1:1、2:1、3:1、4:1、5:1的CRGDV‑ 壳聚糖‑4B。
[0157] 实施例3 CRGDV‑壳聚糖‑3B的合成
[0158] 将PAD4抑制剂3B(5mg、10μmol)与壳聚糖‑CRGDV(10.56mg、3.3μmol)溶解在5mL无水DMSO中。反应在室温下搅拌8h，然后将反应混合物用蒸馏水透析 (MWCO：1000Da)24小时。然后将所得溶液冻干以获得3B：壳聚糖‑CRGDV＝3:1的 CRGDV‑壳聚糖‑3B。
[0159] 实施例4 CRGDV‑壳聚糖‑3B‑OH的合成
[0160] 将PAD4抑制剂3B‑OH与壳聚糖‑CRGDV(10.56mg、3.3μmol)溶解在5mL无水 DMSO中。反应在室温下搅拌8h，然后将反应混合物用蒸馏水透析(MWCO：1000Da) 24小时。然后将所得溶液冻干以获得3B‑OH：壳聚糖‑CRGDV＝3:1的CRGDV‑壳聚糖 ‑3B‑OH。
[0161] 实施例5 CRGDF‑壳聚糖‑4B的合成
[0162] (一)壳聚糖‑CRGDF的合成
[0163] 将壳聚糖‑丙烯酰氯(0.3g、0.10mmol)和CRGDF(107mg、0.18mmol)溶于5mL 二甲基亚砜(DMSO)中，并在室温下添加Et3N(10μL、0.07mmol)。反应在室温下搅拌24小时，并用蒸馏水透析(MWCO：1000Da)48小时。冻干后，得到淡黄色固体。
[0164] (二)CRGDF‑壳聚糖‑4B的合成
[0165] 将PAD4抑制剂4B(5mg、10μmol)与壳聚糖‑CRGDF(3.3μmol)溶解在5mL无水DMSO中。反应在室温下搅拌8h，然后将反应混合物用蒸馏水透析(MWCO：1000Da) 24小时。然后将所得溶液冻干以获得4B：壳聚糖‑CRGDF＝3:1的CRGDF‑壳聚糖‑4B。
[0166] 实施例6 CRGDF‑壳聚糖‑3B的合成
[0167] 将PAD4抑制剂3B(5mg、10μmol)与壳聚糖‑CRGDF(3.3μmol)溶解在5mL无水DMSO中。反应在室温下搅拌8h，然后将反应混合物用蒸馏水透析(MWCO：1000Da) 24小时。然后将所得溶液冻干以获得3B：壳聚糖‑CRGDF＝3:1的CRGDF‑壳聚糖‑3B。
[0168] 实施例7 CRGDF‑壳聚糖‑3B‑OH的合成
[0169] 将PAD4抑制剂3B‑OH与壳聚糖‑CRGDF(3.3μmol)溶解在5mL无水DMSO中。反应在室温下搅拌8h，然后将反应混合物用蒸馏水透析(MWCO：1000Da)24小时。然后将所得溶液冻干以获得3B‑OH：壳聚糖‑CRGDF＝3:1的CRGDF‑壳聚糖‑3B‑OH。
[0170] 实施例8 CRGDS‑壳聚糖‑4B的合成
[0171] (一)壳聚糖‑CRGDS的合成
[0172] 将壳聚糖‑丙烯酰氯(0.3g、0.10mmol)和CRGDS(104mg、0.18mmol)溶于5mL 二甲基亚砜(DMSO)中，并在室温下添加Et3N(10μL、0.07mmol)。反应在室温下搅拌24小时，并用蒸馏水透析(MWCO：1000Da)48小时。冻干后，得到淡黄色固体。
[0173] (二)CRGDS‑壳聚糖‑4B的合成
[0174] 将PAD4抑制剂4B(5mg、10μmol)与壳聚糖‑CRGDS(3.3μmol)溶解在5mL无水DMSO中。反应在室温下搅拌8h，然后将反应混合物用蒸馏水透析(MWCO：1000Da) 24小时。然后将所得溶液冻干以获得4B：壳聚糖‑CRGDS＝3:1的CRGDS‑壳聚糖‑4B。
[0175] 实施例9 CRGDS‑壳聚糖‑3B的合成
[0176] 将PAD4抑制剂3B(5mg、10μmol)与壳聚糖‑CRGDS(3.3μmol)溶解在5mL无水DMSO中。反应在室温下搅拌8h，然后将反应混合物用蒸馏水透析(MWCO：1000Da) 24小时。然后将所得溶液冻干以获得3B：壳聚糖‑CRGDS＝3:1的CRGDS‑壳聚糖‑3B。
[0177] 实施例10 CRGDS‑壳聚糖‑3B‑OH的合成
[0178] 将PAD4抑制剂3B‑OH(10μmol与壳聚糖‑CRGDF(3.3μmol)溶解在5mL无水 DMSO中。反应在室温下搅拌8h，然后将反应混合物用蒸馏水透析(MWCO：1000Da) 24小时。然后将所得溶液冻干以获得3B‑OH：壳聚糖‑CRGDS＝3:1的CRGDS‑壳聚糖 ‑3B‑OH。
[0179] 结构表征
[0180] (一)Zeta电位与粒径
[0181] 对以上部分产物、中间产物的Zeta电位与粒径进行测试，所得结果见表1。
[0182] 表1部分产物、中间产物的Zeta电位与粒径
[0183] Zeta(mV) 粒径(nm)壳聚糖 27.3 233.2±23.36
壳聚糖‑CRGDV 36.0 458.3±81.38
壳聚糖‑CRGDF 31.7 413.6±133.5
壳聚糖‑CRGDS 21.9 195.5±50.44
壳聚糖:4B＝1:3 31.7 /
壳聚糖‑CRGDV:4B＝1:1 / /
壳聚糖‑CRGDV:4B＝1:2 6.82 209.1±26.33
壳聚糖‑CRGDV:4B＝1:3 10.4 221.1±36.82
壳聚糖‑CRGDV:4B＝1:4 27.8 /
壳聚糖‑CRGDV:4B＝1:5 12.2 262.3±37.43
壳聚糖‑CRGDV:3B＝1:3 12.7 202.3±58.8
壳聚糖‑CRGDV:3B‑OH＝1:3 30.3 188.9±63.09
壳聚糖‑CRGDV 36.0 458.3±81.38
壳聚糖‑CRGDF 31.7 413.6±133.5
壳聚糖‑CRGDS 21.9 195.5±50.44
壳聚糖:4B＝1:3 31.7 /
壳聚糖‑CRGDV:4B＝1:1 / /
壳聚糖‑CRGDV:4B＝1:2 6.82 209.1±26.33
壳聚糖‑CRGDV:4B＝1:3 10.4 221.1±36.82
壳聚糖‑CRGDV:4B＝1:4 27.8 /
壳聚糖‑CRGDV:4B＝1:5 12.2 262.3±37.43
壳聚糖‑CRGDV:3B＝1:3 12.7 202.3±58.8
壳聚糖‑CRGDV:3B‑OH＝1:3 30.3 188.9±63.09
[0184] 表1中，/表示未能测出有效数据。
[0185] (二)红外谱图
[0186] 壳聚糖的红外光谱图如图2所示；
[0187] 壳聚糖‑CRGDV的红外光谱图如图3所示；
[0188] 壳聚糖‑CRGDF的红外光谱图如图4所示；
[0189] 壳聚糖‑CRGDS的红外光谱图如图5所示；
[0190] 4B的红外光谱图如图6所示；
[0191] CRGDV‑壳聚糖‑4B的红外光谱图如图7所示；
[0192] 3B的红外光谱图如图8所示；
[0193] CRGDV‑壳聚糖‑3B的红外光谱图如图9所示；
[0194] 3B‑OH的红外光谱图如图10所示；
[0195] CRGDV‑壳聚糖‑3B‑OH的红外光谱图如图11所示。
[0196] 由以上红外光谱图可以看出，图2壳聚糖的红外谱图与图3、4、5壳聚糖‑CRGD系列‑1的红外谱图相比，多了1670cm 的吸收，此处是酰胺键上羰基的特征吸收，证明了壳聚糖接上了CRGD序列肽。图7、9、11分别于图3壳聚糖‑CRGDV的红外谱图相比，红外吸收都发生变‑1
化，1020cm 附近的吸收都显著增强，证明壳聚糖‑CRGD系列与PAD4 抑制剂连接成功。
化，1020cm 附近的吸收都显著增强，证明壳聚糖‑CRGD系列与PAD4 抑制剂连接成功。
[0197] (三)核磁共振氢谱图
[0198] 壳聚糖的1HNMR图(300MHz,D2O)如图12所示；
[0199] 壳聚糖‑丙烯酰氯的1H NMR图(300MHz,D2O)如图13所示；
[0200] 壳聚糖‑CRGDV的1HNMR图(300MHz,D2O)如图14所示；
[0201] 壳聚糖‑CRGDF的1H NMR图(300MHz,D2O)如图15所示；
[0202] 壳聚糖‑CRGDS的1H NMR图(300MHz,D2O)如图16所示；
[0203] CRGDV‑壳聚糖‑4B的1H NMR图(300MHz,D2O)如图17所示；
[0204] CRGDV‑壳聚糖‑3B的1H NMR图(300MHz,D2O)如图18所示；
[0205] CRGDV‑壳聚糖‑3B‑OH的1H NMR图(300MHz,D2O)如图19所示。
[0206] (四)透射电镜图
[0207] 壳聚糖的透射电镜图(浓度：0.1mg/mL)如图20所示；
[0208] 壳聚糖‑CRGDV的透射电镜图(浓度：0.1mg/mL)如图21所示；
[0209] 壳聚糖‑CRGDF的透射电镜图(浓度：0.1mg/mL)如图22所示；
[0210] 壳聚糖‑CRGDS的透射电镜图(浓度：0.1mg/mL)如图23所示；
[0211] 壳聚糖‑CRGDV：4B＝1:1的透射电镜图(0.1mg/mL)如图24所示；
[0212] 壳聚糖‑CRGDV：4B＝1:2的透射电镜图(0.1mg/mL)如图25所示；
[0213] 壳聚糖‑CRGDV：4B＝1:3的透射电镜图(0.1mg/mL)如图26所示；
[0214] 壳聚糖‑CRGDV：4B＝1:4的透射电镜图(0.1mg/mL)如图27所示；
[0215] 壳聚糖‑CRGDV：4B＝1:5的透射电镜图(0.1mg/mL)如图28所示；
[0216] 壳聚糖：4B＝1:3的透射电镜图(0.1mg/mL)如图29所示；
[0217] 壳聚糖‑CRGDV：3B＝1:3的透射电镜图(0.1mg/mL)如图30所示；
[0218] 壳聚糖‑CRGDV：3B‑OH＝1:3的透射电镜图(0.1mg/mL)如图31所示。
[0219] 由图20可以看出，壳聚糖未形成结构大小分布均匀的纳米粒子。图21～23表明，壳聚糖接上CRGDV/F/S后，可形成结构大小分布均匀的纳米粒子。图24～28表明壳聚糖 ‑CRGDV：4B＝1:4时，能够形成结构紧密、大小均一的纳米粒子，由图27可看出，纳米粒子具有更为致密的内层与较为疏松的外层，表明CRGDV与PAD4抑制剂4B包裹壳聚糖构成纳米粒子。图29表明壳聚糖：4B＝1:3时，可形成结构紧密、大小均一的纳米粒子。图30、31表明壳聚糖‑CRGDV：3B/3B‑OH＝1:3，可形成结构紧密、大小均一的纳米粒子。
[0220] 性能测试
[0221] (一)CRGDV‑壳聚糖‑4B(壳聚糖‑CRGDV：4B＝1:3)载药量的测试
[0222] 使用分析天平称取600μg的4B(4‑羧基苯硼酸‑Orn(Cl)‑NBzl)后，取4mL超纯水进行溶解，使4B(4‑羧基苯硼酸‑Orn(Cl)‑NBzl)浓度最终为150μg/mL，作为储备液。依次稀释，得到浓度分别为9.38、18.75、37.5、75、150μg/mL浓度梯度的4B(4‑羧基苯硼酸‑Orn(Cl)‑NBzl)标准溶液，再分别测定紫外吸收光谱图，得到标准曲线。如图32 所示。
[0223] 4B(4‑羧基苯硼酸‑Orn(Cl)‑NBzl)的标准曲线线性拟合方程为y＝0.026x+0.0694， R2＝0.9982。称取CRGDV‑壳聚糖‑4B(壳聚糖‑CRGDV：4B＝1:3)640μg，取4mL超纯水进行溶解，使CRGDV‑壳聚糖‑4B浓度最终为150μg/mL，测得吸光度为0.259，计算得 4B浓度为7.3μg/mL，则CRGDV‑壳聚糖‑4B中，4B的载药量＝7.3/150＝4.7％。称取CRGDV‑ 壳聚糖‑
4B(壳聚糖‑CRGDV:4B＝1:5)1370μg，取4mL超纯水进行溶解，使CRGDV‑壳聚糖‑4B浓度最终为342.5μg/mL，测得吸光度为1.334，计算得4B浓度为48.6μg/mL，则 CRGDV‑壳聚糖‑4B中，
4B的载药量＝48.6/342.5＝14.2％。
4B(壳聚糖‑CRGDV:4B＝1:5)1370μg，取4mL超纯水进行溶解，使CRGDV‑壳聚糖‑4B浓度最终为342.5μg/mL，测得吸光度为1.334，计算得4B浓度为48.6μg/mL，则 CRGDV‑壳聚糖‑4B中，
4B的载药量＝48.6/342.5＝14.2％。
[0224] (二)体外肿瘤细胞活性
[0225] 以不同的受试药物对HCT‑116、以及S180两株细胞的体外抗细胞增殖活性进行评价，以抑制率对所测受试化合物的浓度进行统计分析，使用SPSS中回归分析‑概率统计的方法，计算出阳性药及纳米载药体系的IC50值,其结果见表2。
[0226] 表2受试药物体外抗细胞增殖活性的IC50值
[0227]受试药物 HCT‑116 S180
DOX 0.39±0.14 0.40±0.24
4B 41.3±7.2 36.8±3.8
3B 53.4±6.2 86.4±4.1
3B‑OH 67.5±4.2 73.2±6.9
CRGDV‑壳聚糖 ND ND
CRGDV‑壳聚糖‑4B 4.7±1.4 6.2±1.8
CRGDV‑壳聚糖‑3B 15.6±1.3 18.9±3.4
CRGDV‑壳聚糖‑3B‑OH 21.3±3.8 23.9±4.3
CRGDF‑壳聚糖 ND ND
CRGDF‑壳聚糖‑4B 6.8±2.1 9.4±2.5
CRGDF‑壳聚糖‑3B 20.2±3.1 28.7±4.2
CRGDF‑壳聚糖‑3B‑OH 23.5±2.9 29.3±4.6
CRGDS‑壳聚糖 ND ND
CRGDS‑壳聚糖‑4B 10.7±2.3 20.9±4.9
CRGDS‑壳聚糖‑3B 21.6±1.9 29.4±5.3
CRGDS‑壳聚糖‑3B‑OH 26.4±1.5 34.1±4.5
DOX 0.39±0.14 0.40±0.24
4B 41.3±7.2 36.8±3.8
3B 53.4±6.2 86.4±4.1
3B‑OH 67.5±4.2 73.2±6.9
CRGDV‑壳聚糖 ND ND
CRGDV‑壳聚糖‑4B 4.7±1.4 6.2±1.8
CRGDV‑壳聚糖‑3B 15.6±1.3 18.9±3.4
CRGDV‑壳聚糖‑3B‑OH 21.3±3.8 23.9±4.3
CRGDF‑壳聚糖 ND ND
CRGDF‑壳聚糖‑4B 6.8±2.1 9.4±2.5
CRGDF‑壳聚糖‑3B 20.2±3.1 28.7±4.2
CRGDF‑壳聚糖‑3B‑OH 23.5±2.9 29.3±4.6
CRGDS‑壳聚糖 ND ND
CRGDS‑壳聚糖‑4B 10.7±2.3 20.9±4.9
CRGDS‑壳聚糖‑3B 21.6±1.9 29.4±5.3
CRGDS‑壳聚糖‑3B‑OH 26.4±1.5 34.1±4.5
[0228] 注：ND表示测不到，n＝9。
[0229] 由表2可以看出，本发明提供的CRGD序列肽修饰壳聚糖负载的PAD4抑制剂具有良好的体内生物活性。
[0230] (三)体内抗肿瘤活性评价
[0231] 阴性对照组：生理盐水(NS)，每组10只，给药途径为尾静脉注射；阳性对照组：阿霉素(DOX)，每组10只，剂量为2.0μmol/kg，给药途径为腹腔注射；受试组：PAD4 抑制剂4B、CRGDV‑壳聚糖、CRGDV‑壳聚糖‑4B，共5组，每组10只，4B的剂量为10.0 μmol/kg，CRGDV‑壳聚糖‑4B组4B的剂量为2.0μmol/kg，给药途径为尾静脉注射。
[0232] 实验步骤
[0233] 移植性小鼠S180肉瘤模型所用的瘤源为S180小鼠纤维肉瘤细胞，购自北京大学医学部动物实验中心，自行传代维持。将S180小鼠纤维肉瘤细胞接种于SPF级雄性ICR 小鼠腹腔内，自行传代，将传代一周后的荷S180腹水瘤的小鼠，用适量乙醚麻醉后，脱颈处死，将小鼠置于75％的酒精中浸泡消毒1min，然后剖开小鼠腹腔，收集腹水S180 瘤液，将瘤液以1000rpm离心10min，弃去上清，用生理盐水洗涤去除非细胞碎片、组织以及浮血，将其充分混合，得到S180细胞悬液，稀释至一定倍数后与新鲜配制的0.2％台盼蓝以9:1的体积比混匀染色。活细胞不会被染成蓝色，而死细胞会被染成淡蓝色。
[0234] 用红细胞计数板计数，按以下公式计算细胞浓度和细胞存活率：
[0235] 细胞浓度(细胞数/mL)＝4个大方格内活细胞数/4×104×稀释倍数细胞存活率＝活细胞数/(活细胞数+死细胞数)×100％
[0236] 用生理盐水将存活率大于90％的细胞悬液稀释至2×107个/mL，此时应当尽快完成实验的接种，接种时，左手抓取小鼠进行固定，右手持注射器刺入小鼠右侧腋下至皮下约2mm深，使用针头钝性分离出一个小空腔，注射0.2mL制备好的细胞悬液，每次注射前应将细胞悬液混合均匀。至此动物模型建立完成。模型建立后每日观察小鼠，待大部分小鼠腋下可见黄豆粒大小的实体瘤后进行分组，本实验在接种后第5天进行随机分组，使每组小鼠肿瘤大小平均分布，当天开始给药，每天1次，至第11天进行第7次给药。最后一次给药24h后取出小鼠，各组小鼠进行称重，乙醚麻醉后摘除眼球进行取血，之后脱颈处死，左手用镊子固定小鼠腋下实体瘤生长部位，右手用剪刀剪开皮肤，充分暴露肿瘤组织，沿皮肤、上肢进行钝性分离，取出肿瘤组织，进行称重。再依次解剖取出小鼠的心、肝、脾、肾、脑等脏器组织进行称重。
[0237] 实验结果与分析
[0238] 原位肿瘤组织质量以均值±SD g表示，经t检验进行组间统计学比较。抑制率＝[(阴性对照组瘤重平均值‑受试化合物瘤重平均值)/(阴性对照组瘤重平均值)/]×100％。
[0239] 移植性小鼠S180肉瘤模型评价受试药物体内抑制肿瘤增殖活性的结果如表3。
[0240] 表3受试药物体内抑制肿瘤增殖活性评价
[0241]受试药物 瘤重(g) 抑制率(％)
NS 1.91±0.55
DOX 0.84±0.14a 56.0％
4B 1.34±0.22a 29.8％
3B 1.45±0.42a 24.1％
3B‑OH 1.52±0.34a 20.4％
CRGDV‑壳聚糖 1.87±0.56 2.1％
CRGDV‑壳聚糖‑4B 0.97±0.43a 49.2％
CRGDV‑壳聚糖‑3B 1.31±0.33a 31.4％
CRGDV‑壳聚糖‑3B‑OH 1.43±0.41a 25.1％
CRGDF‑壳聚糖 1.81±0.55 5.2％
CRGDF‑壳聚糖‑4B 1.09±0.44a 42.9％
CRGDF‑壳聚糖‑3B 1.37±0.34a 28.3％
CRGDF‑壳聚糖‑3B‑OH 1.52±0.37a 20.4％
CRGDS‑壳聚糖 1.77±0.39 7.3％
CRGDS‑壳聚糖‑4B 1.27±0.35a 33.5％
CRGDS‑壳聚糖‑3B 1.46±0.39a 23.6％
CRGDS‑壳聚糖‑3B‑OH 1.62±0.54 15.2％
NS 1.91±0.55
DOX 0.84±0.14a 56.0％
4B 1.34±0.22a 29.8％
3B 1.45±0.42a 24.1％
3B‑OH 1.52±0.34a 20.4％
CRGDV‑壳聚糖 1.87±0.56 2.1％
CRGDV‑壳聚糖‑4B 0.97±0.43a 49.2％
CRGDV‑壳聚糖‑3B 1.31±0.33a 31.4％
CRGDV‑壳聚糖‑3B‑OH 1.43±0.41a 25.1％
CRGDF‑壳聚糖 1.81±0.55 5.2％
CRGDF‑壳聚糖‑4B 1.09±0.44a 42.9％
CRGDF‑壳聚糖‑3B 1.37±0.34a 28.3％
CRGDF‑壳聚糖‑3B‑OH 1.52±0.37a 20.4％
CRGDS‑壳聚糖 1.77±0.39 7.3％
CRGDS‑壳聚糖‑4B 1.27±0.35a 33.5％
CRGDS‑壳聚糖‑3B 1.46±0.39a 23.6％
CRGDS‑壳聚糖‑3B‑OH 1.62±0.54 15.2％
[0242] 注：Dox尾静脉0.2mg/kg a
[0243] 4B,3B和3B‑OH尾静脉10.0μmol/kg
[0244] CRGDV/F/S‑壳聚糖‑4B，CRGDV/F/S‑壳聚糖‑3B和CRGDV/F/S‑壳聚糖‑3B‑OH，2.0 μmol/kg
[0245] CRGDV/F/S‑壳聚糖0.2mg/kg
[0246] n＝10，经t检验，a：与NS相比，P<0.01；
[0247] 由表3可以看出，本发明提供的CRGD序列肽修饰壳聚糖负载的PAD4抑制剂具有良好的体内抑制肿瘤增殖活性。
[0248] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。