用于辅助鉴别大豆油脂含量高低的分子标记Oil-11-6708663、试剂盒和方法转让专利
申请号 : CN202110678257.2
文献号 : CN113355443B
文献日 : 2022-06-07
发明人 : 孙君明 , 张晟瑞 , 李斌 , 艾哈迈德·马布鲁克·阿卜杜勒法德尔·阿卜杜勒加尼 , 刘艺田 , 李静
申请人 : 中国农业科学院作物科学研究所
摘要 :
本发明“用于辅助鉴别大豆油脂含量高低的分子标记Oil‑11‑6708663、试剂盒和方法”，属于分子标记技术领域。所述一种用于辅助鉴别大豆油脂含量高低的分子标记Oil‑11‑6708663，其特征在于，所述分子标记Oil‑11‑6708663的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。通过对90份大豆种质资源的DNA检测，本发明提供的分子标记Oil‑11‑6708663及辅助鉴别大豆油脂含量高低的方法，总有效率高达98.9％，鉴别出高油型大豆和低油型大豆的准确率达到87.6％。
权利要求 :
1.一种用于辅助鉴别大豆油脂含量高低的分子标记Oil‑11‑6708663，其特征在于，所述分子标记Oil‑11‑6708663的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种用于辅助鉴别大豆油脂含量高低的试剂盒，其特征在于，包括分子标记Oil‑11‑
6708663；所述分子标记Oil‑11‑6708663的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括分子标记Oil‑11‑6708663的特异性引物。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述特异性引物的序列如SEQ ID NO.
2、SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4所示。
5.根据权利要求2‑4任一所述的试剂盒，其特征在于，还包括：用于PCR的试剂。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述用于PCR的试剂包括：dNTPs、Taq酶、PCR缓冲液、ddH2O。
7.一种用于辅助鉴别大豆油脂含量高低的方法，其特征在于，采用分子标记Oil‑11‑
6708663的特异性引物进行辅助鉴别；所述分子标记Oil‑11‑6708663的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；采用所述分子标记Oil‑11‑6708663的特异性引物对待测大豆材料的DNA进行竞争性等位基因特异性PCR扩增，利用Kluster Caller基因分型仪检测PCR产物的荧光信号，对Oil‑11‑6708663标记进行分型；检测结果为AA的大豆材料为候选高油型大豆；检测结果为GG的大豆材料为候选低油型大豆。
8.根据权利要求7所述的一种用于辅助鉴别大豆油脂含量高低的方法，其特征在于，所述分子标记Oil‑11‑6708663的特异性引物序列分别如SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4所示。
9.根据权利要求7所述的一种用于辅助鉴别大豆油脂含量高低的方法，其特征在于，所述待测大豆材料的DNA可提取自大豆叶片、种子、根、茎、花、果实。
10.根据权利要求7所述的一种用于辅助鉴别大豆油脂含量高低的方法，其特征在于，所述PCR反应体系为2.5 μL基因组DNA，如SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3的正向引物1和2各
0.00672 μL，如SEQ ID NO. 4所示的反向引物0.0168 μL，2.5 μL 2×KASP Master mix缓冲液，0.231 μL ddH2O。
11.根据权利要求7或10所述的一种用于辅助鉴别大豆油脂含量高低的方法，其特征在于，PCR反应程序为：95℃，15 min；以94℃、20s，65‑57℃、60s，每个循环下降0.8度，共10个循环；以94℃、20s，57℃、60s，共33个循环。
12.一种大豆分子辅助育种方法，其特征在于，采用权利要求7‑11任一所述的方法在大豆生长周期的任意阶段筛选出候选高油型大豆或候选低油型大豆用于大豆育种。
说明书 :
用于辅助鉴别大豆油脂含量高低的分子标记Oil‑11‑
6708663、试剂盒和方法
技术领域
[0001] 本发明属于分子标记技术领域，具体涉及一种用于辅助鉴别大豆油脂含量高低的分子标记Oil‑11‑6708663、试剂盒和方法。
背景技术
[0002] 大豆(Glycine max L.Merr.)是世界上最重要的经济作物，也是潜在的生物能源作物。大豆可为人类和动物提供大量的蛋白质，大豆油也是植物油和工业原料的重要来源。2018年世界大豆总产量为3.61亿公吨(www.soystats.com)。全球植物油有56.3％是由大豆提供的，而大豆蛋白的消费量约占世界植物蛋白消费量的23.54％(www.soystats.com)。对油分急剧增长的需求与世界人口不断增长有关。因此，全球在食品和工业方面对大豆油的需求已成为重中之重，鉴定可以调节植物油分合成的因素也是一个至关重要的问题。虽然已经发现了多个与油分合成相关的基因，但目前对种子油分合成调控机制的了解还很有限。
[0003] 大豆的种子油脂含量由多个数量性状位点(QTL)或基因控制，同时受各种环境因素的影响。使用传统的育种方法复杂且难以提高大豆油脂含量。分子标记为育种者寻找新的变异来源提供了快速而准确的方法，也可以用于调查控制数量遗传性状的遗传因子。使用分子标记间接选择重要的农艺性状(如种子大小种子油脂含量等)或标记辅助选择(MAS)可以提高传统植物育种计划的效率，因此现有技术也出现了一些利用分子标记辅助筛选大豆油脂含量的方法，例如：
[0004] 发明专利申请201810776908.X披露了一种大豆油脂含量显著相关的SNP标记，该SNP标记为碱基C或G，位于大豆第18号染色体54211957bp处。
[0005] 发明专利申请201910168673.0公开了一种油分相关性状的功能分子标记Indel6，其在大豆油分相关基因GmOLEO1的CDS起始位点ATG下游6bp处存在14bp的缺失。
[0006] 但现有的分子标记可选范围十分有限，本领域亟需开发更多新的分子标记用于辅助筛选高油大豆种质资源。
发明内容
[0007] 基于本领域的上述不足和需求，本发明开发出一种全新的分子标记，用于辅助鉴别大豆油脂含量高低，以解决难以有效筛选大豆种子油脂含量高和油脂含量低以及现有筛选技术稳定性较差等问题。
[0008] 本发明的技术方案如下：
[0009] 一种用于辅助鉴别大豆油脂含量高低的分子标记Oil‑11‑6708663，其特征在于，为大豆11号染色体第6708663位点的SNP突变g.11‑6708663A>G。
[0010] 本发明的所述分子标记Oil‑11‑6708663为大豆11号染色体第6708663位点的核苷酸为G或A，并经实验证实大部分高油型大豆的该位点由A突变为G后表型上即突变为低油型大豆。
[0011] 所述分子标记Oil‑11‑6708663的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0012] 所述的一种用于辅助鉴别大豆油脂含量高低的分子标记Oil‑11‑6708663的特异性引物序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
[0013] 一种用于辅助鉴别大豆油脂含量高低的试剂盒，其特征在于，包括分子标记Oil‑11‑6708663；所述分子标记Oil‑11‑6708663为大豆11号染色体第6708663位点的SNP突变g.11‑6708663A>G。
[0014] 优选地，所述分子标记Oil‑11‑6708663的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0015] 所述的试剂盒还包括分子标记Oil‑11‑6708663的特异性引物。
[0016] 优选地，所述特异性引物的序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
[0017] 所述用于PCR的试剂包括：dNTPs、Taq酶、PCR缓冲液、ddH2O。
[0018] 一种用于辅助鉴别大豆油脂含量高低的方法，其特征在于，采用分子标记Oil‑11‑6708663进行鉴别；所述分子标记Oil‑11‑6708663为大豆11号染色体第6708663位点的SNP突变g.11‑6708663A>G。
[0019] 所述分子标记Oil‑11‑6708663的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0020] 采用所述分子标记Oil‑11‑6708663的特异性引物进行辅助鉴别。
[0021] 优选地，采用所述分子标记Oil‑11‑6708663的特异性引物对待测大豆材料的DNA进行竞争性等位基因特异性PCR扩增，利用Kluster Caller基因分型仪检测PCR产物的荧光信号，对Oil‑11‑6708663标记进行分型。
[0022] 优选地，所述分子标记Oil‑11‑6708663的特异性引物序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
[0023] 优选地，所述检测结果为AA的大豆材料为高油型大豆。
[0024] 所述检测结果为GG的大豆材料为低油型大豆。
[0025] 大豆为古四倍体植物，本发明中检测结果为纯合子的情况才可判断高油型或低油型大豆，杂合子情况或未检出的情况均为无效检测结果。
[0026] 优选地，所述待测大豆材料的DNA可提取自大豆叶片、种子、根、茎、花、果实。
[0027] 优选地，所述PCR反应体系为2.5μL基因组DNA，正向引物1和2各0.00672μL，反向引物0.0168μL，2.5μL2×KASP Master mix缓冲液，0.231μL ddH2O。
[0028] 2×KASP Master mix缓冲液中含有荧光染料，经PCR后可使扩增产物产生荧光信号。
[0029] 优选地，PCR反应程序为：95℃，15min；以94℃、20s，65‑57℃、60s，每个循环下降0.8度，共10个循环；以94℃、20s，57℃、60s，共33个循环。
[0030] 一种大豆分子辅助育种方法，其特征在于，采用所述的方法在大豆生长周期的任意阶段筛选出高油型大豆或低油型大豆用于大豆育种。
[0031] 本发明中，高油大豆/高油型大豆指：大豆种子的油脂含量高，即，大豆种子的油脂含量在21.5％以上的大豆；低油大豆/低油型大豆指：大豆种子的油脂含量低，即，大豆种子的油脂含量在17.0％以下的大豆。本发明利用基于NGS测序的BSA方法，在一个不同来源的、具有广泛遗传多样性自然群体中对大豆油分进行定位。本发明从一个具有很多不同油分含量的群体中，选择具有极端油分含量表型的材料，BSA结合NGS将可以快速鉴定大豆油分生物合成关键基因组变异。本发明开发出1个可区分高油大豆和低油大豆的分子标记Oil‑11‑6708663，并获得其有效的特异性引物，由于高油大豆和低油大豆中的该分子标记位点单核苷酸多态性差异，基于本发明得到的分子标记Oil‑11‑6708663的特异性引物，可通过本领域常见的简单操作：竞争性等位基因特异性PCR扩增，在大豆生长的任意阶段对其进行鉴别，即可获知待测品种是否为高油大豆。通过对90份大豆种质资源的DNA检测，本发明提供的分子标记Oil‑11‑6708663及辅助鉴别大豆油脂含量高低的方法，总有效率高达98.9％，在有效数据的基础上，鉴别出高油型大豆和低油型大豆的准确率达到87.6％。
附图说明
[0032] 图1为本发明实验例中采用Oil‑11‑6708663分子标记竞争性等位基因特异性PCR扩增待测大豆材料的DNA扩增产物的基因分型检测结果。红色点表示鉴定结果为AA的样品，为高油基因型；蓝色点表示鉴定结果为GG的样品，为低油基因型；粉色点表示鉴定失败的样品。
具体实施方式
[0033] 下面结合具体实施例及附图对本发明的内容做进一步详细说明，但并不以此限制本发明的保护范围。
[0034] 生物材料的来源或记载出处
[0035] 本发明实验例使用的90份大豆种质资源均来自国家作物种质库，同时也为申请人单位自有种质资源库所有，申请人承诺自本发明申请日起20年内可向公众发放用于验证本发明。第1组实施例、本发明的分子标记Oil‑11‑6708663
[0036] 本组实施例提供一种用于辅助鉴别大豆油脂含量高低的分子标记Oil‑11‑6708663。本组实施例具备如下共同特征：所述分子标记Oil‑11‑6708663为大豆11号染色体第6708663位点的SNP突变g.11‑6708663A>G(基因组版本Gmax_275_Wm82.a2.v1)。
[0037] 在优选的实施例中，所述分子标记Oil‑11‑6708663的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0038] 在具体的实施例中，所述分子标记Oil‑11‑6708663为位于大豆11号染色体6708663位点的SNP突变。
[0039] 本领域技术人员可根据本发明的记载，找到大豆11号染色体第6708663碱基处的基因组序列，再结合本发明披露的分子标记Oil‑11‑6708663的SNP序列，以该SNP所在位点的前后基因组序列为目标序列设计引物，从而得到可用特异性引物用于扩增本发明的分子标记Oil‑11‑6708663的SNP序列。因此任何基于本发明分子标记Oil‑11‑6708663序列的引物设计、序列扩增、电泳检测、测序检测、鉴别大豆种质资源的行为均落入本发明的保护范围。
[0040] 在一些优选的实施例中，其特异性引物序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
[0041] 本领域技术人员可根据本发明公开的内容，即，以本发明披露的分子标记Oil‑11‑6708663的SNP序列所在大豆11号染色体6708663碱基处位点的前后基因组序列为目标序列，并采用本领域常规的技术手段，例如，利用引物设计软件对目标序列设计引物，从而得到可用的可扩增分子标记Oil‑11‑6708663的SNP序列的引物，理论上，存在若干对引物，不仅限于本发明上述的序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的这对引物。任何基于本发明分子标记Oil‑11‑6708663的SNP序列及其所在染色体位置的前后的基因组序列设计引物、获得引物的行为均落入本发明的保护范围。
[0042] 第2组实施例、本发明的试剂盒
[0043] 本组实施例提供一种用于辅助鉴别大豆油脂含量高低的试剂盒。本组实施例都具备如下共同特征：所述试剂盒包括分子标记Oil‑11‑6708663；所述分子标记Oil‑11‑6708663的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0044] 在进一步的实施例中，所述试剂盒还包括分子标记Oil‑11‑6708663的特异性引物。
[0045] 优选地，所述特异性引物的序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
[0046] 优选地，所述试剂盒还包括用于PCR的试剂。
[0047] 优选地，所述用于PCR的试剂包括：dNTPs、Taq酶、PCR缓冲液、ddH2O。
[0048] 第3组实施例、本发明的辅助鉴别大豆油脂含量高低的方法
[0049] 本组实施例提供一种用于辅助鉴别大豆油脂含量高低的方法。本组实施例的共同特征在于，采用分子标记Oil‑11‑6708663进行鉴别；所述分子标记Oil‑11‑6708663的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0050] 在优选的实施例中，所述分子标记Oil‑11‑6708663为位于11号染色体6708663碱基处的SNP突变，该位点从A突变成G。
[0051] 在具体的实施例中，采用所述分子标记Oil‑11‑6708663的特异性引物进行辅助鉴别。
[0052] 优选地，采用所述分子标记Oil‑11‑6708663的特异性引物对待测大豆材料的DNA进行竞争性等位基因特异性PCR扩增(KASP)，所得PCR扩增产物通过Kluster Caller基因分型仪读取结果；
[0053] 优选地，所述分子标记Oil‑11‑6708663的特异性引物序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
[0054] 优选地，所述检测结果为AA的大豆材料为高油型大豆；
[0055] 所述电泳检测结果为GG的大豆材料为低油型大豆。
[0056] 大豆为双倍体植物，检测结果为纯合子的情况才可判断高油型或低油型大豆，杂合子情况或未检出的情况均为无效检测结果。
[0057] 优选地，所述待测大豆材料的DNA可提取自大豆叶片、种子、根、茎、花、果实。
[0058] 优选地，所述PCR反应体系为2.5μL基因组DNA，正向引物1和2各0.00672μL，正向引物1和2各0.0168μL，2.5μL 2×KASP Master mix缓冲液，0.231μL ddH2O。
[0059] PCR反应体系不局限于本发明记载的上述反应体系，本领域技术人员也可采用混合了Taq酶、dNTP、缓冲液、双蒸水的商品化的PCR反应混合液(PCR反应Mix)来进行PCR反应，并对反应体系进行适应性调整和选择，均能获得预期的PCR扩增效果。
[0060] 优选地，PCR反应程序为：95℃，15min；以94℃、20s，65‑57℃(退火温度)、60s为1个循环，共10个循环，从第2个循环开始，每个循环比上个循环的退火温度下降0.8度；以94℃、20s，57℃、60s为1个循环，共33个循环。
[0061] KASP是本领域公知技术，本领域技术人员可根据实际试验中的具体情况，参照本领域常规技术手段进行常规选择和调整的，例如，可购买“KASP Master mix”并参照其产品说明书记载的反应条件，根据本发明所得的PCR扩增产物的片段大小选择合适的参数、调整合适的反应条件。
[0062] KASP、DNA测序均为本领域公知技术，也是目前市场上成熟的商品化技术，本领域技术人员可根据本发明记载的引物序列进行PCR扩增，将扩增产物送至有偿进行KASP、DNA测序的公司进行PCR扩增产物的片段大小确定或序列确定，从而得出PCR扩增产物的片段大小或具体序列，根据SNP位点是AA还是GG来判断模板所对应的大豆品种是高油型还是低油型。
[0063] 本领域技术人员也可采用本领域其它常规手段检测PCR扩增产物，例如，可采用竞争性等位基因特异性PCR扩增、电泳、DNA测序等方法均可获知PCR扩增产物序列，进而得知待测大豆材料具体是低油型大豆还是高油型大豆。
[0064] 在另一些实施例中，可采用Kluster Caller基因分型仪，检测PCR产物序列。
[0065] Kluster Caller基因分型仪是本领域常见的可商购获得的仪器，其操作方法可参考该仪器的产品说明书进行操作。
[0066] 第4组实施例、本发明的大豆分子辅助育种方法
[0067] 本组实施例提供一种大豆分子辅助育种方法。
[0068] 本组所有的实施例都具备如下共同特征：采用第2组实施例任一所述的一种用于辅助鉴别大豆油脂含量高低的方法在大豆生长周期的任意阶段筛选出高油型大豆或低油型大豆用于大豆育种。
[0069] 实验例、本发明的分子标记Oil‑11‑6708663的效果验证
[0070] 大豆(Glycine max L.Merr.)分子标记Oil‑11‑6708663的核苷酸序列：
[0071] ACTCAATGCTGCATAAGTGCCTTCAATATAGAATAAATATTTCCCCACCCACACACAAAAAGCTTGCAAGTTATTAAAAAAGCTGATCGAAAAAAGGCAT[A/G]CATCCTACACAACATCATTTGAATCCACCTTTTCGAATCCCATTTAGCAAATATTTTGAGCTTATTCCCTACAAAAATTGAACTATTCACTTTACTACTG(SEQ ID NO.1)。
[0072] 大豆(Glycine max L.Merr.)分子标记Oil‑11‑6708663的正向引物1：
[0073] 5'‑GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGGATTCAAATGATGTTGTGTAGGATGT‑3'(SEQ ID NO.2)；
[0074] 大豆(Glycine max L.Merr.)分子标记Oil‑11‑6708663的正向引物2：
[0075] 5'‑GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAAATGATGTTGTGTAGGATGC‑3’(SEQ ID NO.3)；
[0076] 大豆(Glycine max L.Merr.)分子标记Oil‑11‑6708663的反向引物：
[0077] 5'‑CCACCCACACACAAAAAGCTTGCAA‑3’(SEQ ID NO.4)。
[0078] 使用LGC公司的KASP genotyping试剂盒(Mannheim，英国)进行PCR扩增反应。首先配置引物混合液，混合正向引物1(12μL)、正向引物2(12μL)、反向引物(30μL)和ddH2O(46μL)，待用；PCR体系包括2.5μL基因组DNA，2.5μL 2×KASP Master mix，0.056μL引物混合液，0.205μL ddH2O。PCR反应程序为：95℃，15min；以94℃、20s，65‑57℃(退火温度)、60s为1个循环，共10个循环，从第2个循环开始，每个循环比上个循环的退火温度下降0.8度；以94℃、
20s，57℃、60s为1个循环，共33个循环。PCR产物Kluster Caller基因分型仪检测Oil‑11‑
6708663标记基因型。Oil‑11‑6708663标记基因型为AA，属于高油大豆；Oil‑11‑6708663标记基因型为GG，属于低油大豆。
20s，57℃、60s为1个循环，共33个循环。PCR产物Kluster Caller基因分型仪检测Oil‑11‑
6708663标记基因型。Oil‑11‑6708663标记基因型为AA，属于高油大豆；Oil‑11‑6708663标记基因型为GG，属于低油大豆。
[0079] 本发明使用的90份大豆种质资源的自然群体分别于2017年11月14日和2018年11月16日种植在海南三亚(18°24′N,109°5′E)，2017年6月12日种植于北京昌平(40°13′N,116°12′E)。90份大豆种质资源中，通过油分含量测定，高油大豆有45份(油脂含量高于
21.5％)，低油大豆有45份(油脂含量低于17.0％)。所述油分含量测定方法为记载于“Estimations of Protein and Oil Concentration in Corn,Soybean,and Oat Seed by Near‑Infrared Light Reflectance”一文中的近红外广谱法，通过分子标记Oil‑11‑
6708663的特异性引物进行竞争性等位基因特异性PCR扩增和荧光信号检测，具体检测结果如下表1所示：
21.5％)，低油大豆有45份(油脂含量低于17.0％)。所述油分含量测定方法为记载于“Estimations of Protein and Oil Concentration in Corn,Soybean,and Oat Seed by Near‑Infrared Light Reflectance”一文中的近红外广谱法，通过分子标记Oil‑11‑
6708663的特异性引物进行竞争性等位基因特异性PCR扩增和荧光信号检测，具体检测结果如下表1所示：
[0080] 表1
[0081]
[0082]
[0083]
[0084] 上表1中“‑”代表未检出SNP突变位点，检测结果无效。