本发明提供基于不同分离机制HPLC指纹图谱串联法的建立与应用，涉及药品分离分析领域。该基于不同分离机制HPLC指纹图谱串联法的建立，包括如下具体步骤：首先实现H ILIC‑I SC串联HPLC指纹图谱的拟合、串联指纹图谱保留时间的计算和串联指纹图谱峰面积的计算。通过将串联谱与单一分离机制所得指纹图谱的评价结果相比较，串联指纹图谱与单一分离机制指纹图谱对27批苦参总碱样品和市售样品定性定量评价的结论基本一致，说明串联评价结果准确可靠，能整合不同分离机制下所得图谱的质量评价结果，具有实际意义。
1.基于不同分离机制的苦参总碱HILIC‑ISC串联HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于，包括如下具体步骤：首先实现HILIC‑ISC串联HPLC指纹图谱的拟合、串联指纹图谱保留时间的计算和串联指纹图谱峰面积的计算，再通过苦参总碱样品、市售样品的指纹图谱以及对照指纹图谱的信号分别导入评价系统软件，将检测波长为210nm的HILIC‑HPLC指纹图谱和检测波长为220nm的ISC‑HPLC指纹图谱按HILIC‑ISC串联HPLC指纹图谱的拟合原理用软件进行串联处理，即得到苦参总碱HILIC‑ISC串联HPLC指纹图谱；
HILIC‑ISC串联HPLC指纹图谱的拟合原理为：以矩阵
表示HILIC‑HPLC分离机制下所得到的指纹图谱的特征数据，该矩阵由p×n个数 排成，共有n个列向量，有p个行向量，其中p＝29，n＝18，i＝1,2,…,p；j1＝1,2,…,n；
表示ISC‑HPLC分离机制下所得到的指纹图谱的特征数据，该矩阵由p×q个数 排成，共有q个列向量，有p个行向量，其中p＝29，q＝17，i＝1,2,…,p；j2＝1,2,…,q；
所得苦参总碱HILIC‑ISC串联HPLC指纹图谱的特征数据可用矩阵
表示，该矩阵由p×u个数 排成，共有u个列向量，有p个行向量，其中p＝29，u＝n+q＝
18+17＝35，i＝1,2,…,p；j3＝1,2,…,u；
令矩阵Tp×u表示苦参总碱HILIC‑ISC串联HPLC指纹图谱中各指纹峰的保留时间为：
其中HILIC区域为前n个列向量，即为矩阵Xp×n中n个列向量所代表的保留时间，ISC区域为后q个列向量，实际是矩阵Wp×q所代表的列向量在时间维度上统一向后平移完成HILIC‑HPLC分离所需要的时间，即矩阵Wp×q所代表的保留时间特征数据都加上32min，在串联HPLC指纹图谱中，前32min内HILIC‑HPLC指纹图谱各指纹峰的峰号不变，仍然为1‑18号峰，其中
13号为MT，16号为SPR，17号峰为OMT；32‑74min内原ISC‑HPLC指纹图谱中指纹峰的峰号发生变化，即在原峰号的基础上均加18，也就是ISC‑HPLC指纹图谱中的1号峰在串联HPLC指纹图谱中变为19号峰，2号峰变为20号峰，依次类推，原6号峰即OMT峰变为24号峰，原14号峰即SPR峰变为32号峰，原16号峰即MT峰变为34号峰。
2.根据权利要求1所述的基于不同分离机制的苦参总碱HILIC‑ISC串联HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于：串联指纹图谱峰面积的计算原理为：令矩阵Ap×u表示苦参总碱HILIC‑ISC串联HPLC指纹图谱中各指纹峰的峰面积为：
由于HILIC指纹图谱与ISC指纹图谱的分离机制、流动相系统、检测波长、进样量均不同，供试品溶液的制备方法也不同，在串联时发现ISC指纹图谱中OMT、SPR和MT指标成分的峰高远高于HILIC指纹图谱中相应指标成分的峰高，为避免产生大峰掩蔽小峰现象，需对HILIC指纹图谱中各指纹成分的峰面积矩阵Xp×n进行校正，将矩阵Ap×u中前n个列向量，即HILIC区域，表示为Ap×n，则f为校正系数，mHILIC、mISC分别代表HILIC指纹图谱与ISC指纹图谱中供试品的称样量，VHILIC、VISC分别代表HILIC指纹图谱与ISC指纹图谱中供试品制备过程中起始溶液体积，DHILIC、DISC分别代表HILIC指纹图谱与ISC指纹图谱中供试品制备过程中溶液稀释倍数，JHILIC、JISC分别代表HILIC指纹图谱与ISC指纹图谱中供试品溶液的进样体积，以MT为参照，经校正可使串联谱中HILIC区域的MT，即第13列向量，与ISC区域的MT，即第34列向量，的峰面积较为接近，即只存在不同波长响应值的差异，将矩阵Ap×u中后q个列向量，即ISC区域，表示为Ap×q,则Ap×q即为Wp×q所代表向量的峰面积特征数据。
3.根据权利要求1‑2中任意一项所述的基于不同分离机制的苦参总碱HILIC‑ISC串联HPLC指纹图谱的建立方法在生物碱类药物的分离分析中的应用。
基于不同分离机制HPLC指纹图谱串联法的建立与应用
技术领域
[0001] 本发明涉及药品分离分析领域，具体为基于不同分离机制HPLC指纹图谱串联法的建立与应用。
背景技术
[0002] 高效液相色谱法在中药、生物样本等复杂样品的分离分析中应用最为广泛，但通常使用的一维分离模式的分辨率和峰容量较为有限。为了对多组分复杂样品进行更有效地分离分析，很多研究者使用多维色谱技术，即多种不同类型的色谱组合而成的联用系统，其主要作用是增加峰容量，而不同分离模式只有分离机理正交才能最大限度的提高峰容量。HPLC‑HPLC联用分析法是常用的多维色谱技术之一，其关键是选择性、分离速度、流动相和样品容量等兼容性问题，在实际应用中受到一定限制。
发明内容
[0003] (一)解决的技术问题
[0004] 针对现有技术的不足，本发明提供了基于不同分离机制HPLC指纹图谱串联法的建立与应用，解决了HPLC‑HPLC联用分析法在实际应用中受到一定限制的问题。
[0005] (二)技术方案
[0006] 为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：基于不同分离机制HPLC指纹图谱串联法的建立，包括如下具体步骤：首先实现HILIC‑ISC串联HPLC指纹图谱的拟合、串联指纹图谱保留时间的计算和串联指纹图谱峰面积的计算，再通过苦参总碱样品、市售样品的指纹图谱以及对照指纹图谱的信号分别导入“中药色谱指纹图谱定量相似度数字化评价系统3.0”软件，将HILIC‑HPLC(210nm)指纹图谱和ISC‑HPLC(220nm)指纹图谱按HILIC‑ISC串联HPLC指纹图谱的拟合远离用软件进行串联处理，即得到苦参总碱HILIC‑ISC串联HPLC指纹图谱。
[0007] 优选的，HILIC‑ISC串联HPLC指纹图谱的拟合原理为：以矩阵
[0008]
[0009] 表示HILIC‑HPLC分离机制下所得到的指纹图谱的特征数据，该矩阵由p×n个数Xij(i＝1,2,…,p；j＝1,2,…,n)排成，共有n个列向量，有p个行向量，其中p＝29，n＝18；
[0010] 以矩阵
[0011]
[0012] 表示ISC‑HPLC分离机制下所得到的指纹图谱的特征数据，该矩阵由p×q个数Wij(i＝1,2,…,p；j＝1,2,…,q)排成，共有q个列向量，有p个行向量，其中p＝29，q＝17；
[0013] 所得苦参总碱HILIC‑ISC串联HPLC指纹图谱的特征数据可用矩阵
[0014]
[0015] 表示，该矩阵由p×u个数Zij(i＝1,2,…,p；j＝1,2,…,u)排成，共有u个列向量，有p个行向量，其中p＝29，u＝n+q＝18+17＝35。
[0016] 优选的，串联指纹图谱保留时间的计算原理为：
[0017] 令矩阵Tp×u表示苦参总碱HILIC‑ISC串联HPLC指纹图谱中各指纹峰的保留时间为：
[0018]
[0019] 其中前n个列向量(HILIC区域)即为矩阵Xp×n中n个列向量所代表的保留时间，后q个列向量(ISC区域)实际是矩阵Wp×q所代表的列向量在时间维度上统一向后平移完成HILIC‑HPLC分离所需要的时间，即矩阵Wp×q所代表的保留时间特征数据都加上32min，在串联HPLC指纹图谱中，前32min内HILIC‑HPLC指纹图谱各指纹峰的峰号不变，仍然为1‑18号峰，其中13号为MT，16号为SPR，17号峰为OMT；32‑74min内原ISC‑HPLC指纹图谱中指纹峰的峰号发生变化，即在原峰号的基础上均加18，也就是ISC‑HPLC指纹图谱中的1号峰在串联HPLC指纹图谱中变为19号峰，2号峰变为20号峰，依次类推，原6号峰(OMT)变为24号峰，原14号峰(SPR)变为32号峰，原16号峰(MT)变为34号峰。
[0020] 优选的，串联指纹图谱峰面积的计算原理为：
[0021] 令矩阵Ap×u表示苦参总碱HILIC‑ISC串联HPLC指纹图谱中各指纹峰的峰面积为：
[0022]
[0023] 由于HILIC指纹图谱与ISC指纹图谱的分离机制、流动相系统、检测波长、进样量均不同，供试品溶液的制备方法也不同，在串联时发现ISC指纹图谱中OMT、SPR和MT指标成分的峰高远高于HILIC指纹图谱中相应指标成分的峰高为避免产生大峰掩蔽小峰现象，需对HILIC指纹图谱中各指纹成分的峰面积矩阵Xp×n进行校正，将矩阵Ap×u中前n个列向量(HILIC区域)表示为Ap×n，则
[0024]
[0025]
[0026] f为校正系数，mHILIC、mISC分别代表HILIC指纹图谱与ISC指纹图谱中供试品的称样量，VHILIC、VISC分别代表HILIC指纹图谱与ISC指纹图谱中供试品制备过程中起始溶液体积，DHILIC、DISC分别代表HILIC指纹图谱与ISC指纹图谱中供试品制备过程中溶液稀释倍数，JHILIC、JISC分别代表HILIC指纹图谱与ISC指纹图谱中供试品溶液的进样体积，[0027] 以MT为参照，经校正可使串联谱中HILIC区域的MT(第13列向量)与ISC区域的MT(第34列向量)的峰面积较为接近，即只存在不同波长响应值的差异，将矩阵Ap×u中后q个列向量(ISC区域)表示为Ap×q,则Ap×q即为Wp×q所代表向量的峰面积特征数据。
[0028] (三)有益效果
[0029] 本发明提供了基于不同分离机制HPLC指纹图谱串联法的建立与应用。具备以下有益效果：
[0030] 将串联谱与单一分离机制所得指纹图谱的评价结果相比较，串联指纹图谱与单一分离机制指纹图谱对27批苦参总碱样品和市售样品定性定量评价的结论基本一致，说明串联评价结果准确可靠，能整合不同分离机制下所得图谱的质量评价结果，具有实际意义。
附图说明
[0031] 图1为苦参总碱HILIC‑ISC串联HPLC指纹图谱的标准指纹图谱标号图。
具体实施方式
[0032] 下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0033] 实施例一：
[0034] 本发明实施例提供基于不同分离机制HPLC指纹图谱串联法的建立，包括如下具体步骤：首先实现HILIC‑ISC串联HPLC指纹图谱的拟合、串联指纹图谱保留时间的计算和串联指纹图谱峰面积的计算，再通过苦参总碱样品、市售样品的指纹图谱以及对照指纹图谱的信号分别导入“中药色谱指纹图谱定量相似度数字化评价系统3.0”软件，将HILIC‑HPLC(210nm)指纹图谱和ISC‑HPLC(220nm)指纹图谱按HILIC‑ISC串联HPLC指纹图谱的拟合原理用软件进行串联处理，即得到苦参总碱HILIC‑ISC串联HPLC指纹图谱。
[0035] HILIC‑ISC串联HPLC指纹图谱的拟合原理为：以矩阵
[0036]
[0037] 表示HILIC‑HPLC分离机制下所得到的指纹图谱的特征数据，该矩阵由p×n个数Xij(i＝1,2,…,p；j＝1,2,…,n)排成，共有n个列向量，有p个行向量，其中p＝29，n＝18；
[0038] 以矩阵
[0039]
[0040] 表示ISC‑HPLC分离机制下所得到的指纹图谱的特征数据，该矩阵由p×q个数Wij(i＝1,2,…,p；j＝1,2,…,q)排成，共有q个列向量，有p个行向量，其中p＝29，q＝17；
[0041] 所得苦参总碱HILIC‑ISC串联HPLC指纹图谱的特征数据可用矩阵
[0042]
[0043] 表示，该矩阵由p×u个数Zij(i＝1,2,…,p；j＝1,2,…,u)排成，共有u个列向量，有p个行向量，其中p＝29，u＝n+q＝18+17＝35。
[0044] 串联指纹图谱保留时间的计算原理为：
[0045] 令矩阵Tp×u表示苦参总碱HILIC‑ISC串联HPLC指纹图谱中各指纹峰的保留时间为：
[0046]
[0047] 其中前n个列向量(HILIC区域)即为矩阵Xp×n中n个列向量所代表的保留时间，后q个列向量(ISC区域)实际是矩阵Wp×q所代表的列向量在时间维度上统一向后平移完成HILIC‑HPLC分离所需要的时间，即矩阵Wp×q所代表的保留时间特征数据都加上32min，在串联HPLC指纹图谱中，前32min内HILIC‑HPLC指纹图谱各指纹峰的峰号不变，仍然为1‑18号峰，其中13号为MT，16号为SPR，17号峰为OMT；32‑74min内原ISC‑HPLC指纹图谱中指纹峰的峰号发生变化，即在原峰号的基础上均加18，也就是ISC‑HPLC指纹图谱中的1号峰在串联HPLC指纹图谱中变为19号峰，2号峰变为20号峰，依次类推，原6号峰(OMT)变为24号峰，原14号峰(SPR)变为32号峰，原16号峰(MT)变为34号峰。
[0048] 串联指纹图谱峰面积的计算原理为：
[0049] 令矩阵Ap×u表示苦参总碱HILIC‑ISC串联HPLC指纹图谱中各指纹峰的峰面积为：
[0050]
[0051] 由于HILIC指纹图谱与ISC指纹图谱的分离机制、流动相系统、检测波长、进样量均不同，供试品溶液的制备方法也不同，在串联时发现ISC指纹图谱中OMT、SPR和MT指标成分的峰高远高于HILIC指纹图谱中相应指标成分的峰高为避免产生大峰掩蔽小峰现象，需对HILIC指纹图谱中各指纹成分的峰面积矩阵Xp×n进行校正，将矩阵Ap×u中前n个列向量(HILIC区域)表示为Ap×n，则
[0052]
[0053]
[0054] f为校正系数，mHILIC、mISC分别代表HILIC指纹图谱与ISC指纹图谱中供试品的称样量，VHILIC、VISC分别代表HILIC指纹图谱与ISC指纹图谱中供试品制备过程中起始溶液体积，DHILIC、DISC分别代表HILIC指纹图谱与ISC指纹图谱中供试品制备过程中溶液稀释倍数，JHILIC、JISC分别代表HILIC指纹图谱与ISC指纹图谱中供试品溶液的进样体积，[0055] 以MT为参照，经校正可使串联谱中HILIC区域的MT(第13列向量)与ISC区域的MT(第34列向量)的峰面积较为接近，即只存在不同波长响应值的差异，将矩阵Ap×u中后q个列向量(ISC区域)表示为Ap×q,则Ap×q即为Wp×q所代表向量的峰面积特征数据。
[0056] HILIC‑HPLC(210nm)指纹图谱的建立
[0057] 1.溶液的制备
[0058] 对照品溶液的制备 精密称取苦参碱对照品9.0mg、槐定碱对照品8.0mg、氧化苦参碱对照品8.0mg，分别置50ml，50ml，25ml量瓶中，加乙醇溶液使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为贮备溶液；精密量取苦参碱贮备液1.00ml，槐定碱贮备液1.00ml，氧化苦参碱贮备液0.50ml，置50ml量瓶中，加乙醇溶液至刻度，摇匀，即得。
[0059] 供试品溶液的制备 取本品约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入乙醇25ml，称定重量，超声处理(功率320W，频率40kHz)15分钟，放冷，再称定重量，用乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密吸取续滤液1ml，置50ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
[0060] 2.色谱条件
[0061] 色谱柱为Agilent ZOBAX NH2色谱柱(250×4.6mm,5.0μm)，以乙腈‑无水乙醇‑3％磷酸溶液(82:10:8，v/v/v)为流动相等度洗脱；检测波长为210nm，进样量20μL，柱温(35±0.15)℃，流速1.0mL/min。
[0062] ISC‑HPLC(220nm)指纹图谱的建立
[0063] 1.溶液的制备
[0064] 对照品溶液的制备 精密称取苦参碱对照品、槐定碱对照品和氧化苦参碱对照品适量，加乙醇分别配制成400μg/ml，700μg/ml和200μg/ml的溶液，摇匀，即得。
[0065] 样品供试液的制备 取本品约0.13g，精密称定，置25ml量瓶中，加0.1％氨水至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
[0066] 2.色谱条件
[0067] ZORBAX Eclipse XDB‑C18(4.6×150mm，5μm)；流动相：A＝0.1％氨水，B＝甲醇(含0.05％氨水)；梯度程序：0‑30min，10～50％B；30‑50min，50～80％B；50‑70min，80～98％B；
70‑110min，98％B。检测波长为220nm，柱温(35±0.15)℃，流速0.70mL/min，进样量5μL。
[0068] 标准指纹图谱
[0069] 以ISC‑HPLC(220nm)中苦参碱峰，即串联后34号峰为参照物峰。
[0070] 标准指纹图谱数据如下：
[0071]
[0072] 串联指纹图谱的质量评价
[0073] 将苦参总碱样品分为S1‑S27组、市售样品RS，采用线性指纹定量法对所得信号串联指纹图谱进行质量评价，由串联法评价结果可知，S3、S4、S5、S7、S8、S10、S11、S13、S15、S18、S21、S22、S25、RS质量极好(1级)，S1、S16、S17、S20、S23、S24质量很好(2级)，S6、S9、S14、S26、S27质量好(3级)，S2、S12质量良好(4级)，S19质量中等(5级),两种分离机制下的评价结果大部分数据相差不大且等级一致，部分批次(S2、S10、S12、S13、S14、S15、S17、S19、S20、S21、S25)在不同分离机制下的质量相差一个等级。由于单一分离机制获得的指纹成分信息可能不够全面，采用综合鉴定结果才能更为可靠。
[0074] 尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
