一种提高虾青素水溶性且保护其免受Fe2+氧化降解的方法转让专利
申请号 : CN202110707277.8
文献号 : CN113367335B
文献日 : 2022-05-06
发明人 : 赵广华 , 张晨曦 , 吕晨艳
申请人 : 中国农业大学
摘要 :
本发明涉及一种提高虾青素水溶性且保护其免受Fe2+氧化降解的方法，包括如下步骤：a)制备虾青素溶液，将其溶于二甲基亚砜/乙醇/丙酮中；b)分离纯化虾铁蛋白，制备浓度为0.5～20μmol/L的虾铁蛋白溶液；c)将所述虾铁蛋白溶液缓慢搅拌，之后将所述虾青素溶液缓慢滴加到虾铁蛋白溶液中；d)缓慢搅拌反应，获得虾青素‑虾铁蛋白复合物溶液。将所得溶液过0.45μm滤膜，得到虾青素‑虾铁蛋白复合物溶液。采用本发明方法制备的虾青素‑虾铁蛋白复合物呈现透亮的橘红色，具有很好的水溶性和稳定性，可以保护虾青素免受Fe2+的氧化降解，利于其加工和贮藏，扩宽虾青素使用条件和范围。
权利要求 :
2+
1.一种提高虾青素水溶性且保护其免受Fe 氧化降解的方法，其特征在于，包括如下步骤：
a)制备浓度为0.25 3.0 mmol/L的虾青素溶液，即称取0.0036 g虾青素将其溶于2.0 ~
mL 24.0 mL二甲基亚砜、乙醇或丙酮中；
~
b)分离纯化虾铁蛋白，制备浓度为0.5 20 µmol/L的虾铁蛋白溶液；
~
c)将步骤b制备的虾铁蛋白溶液缓慢搅拌，之后将步骤a制备的虾青素溶液缓慢滴加到虾铁蛋白溶液中，虾铁蛋白与虾青素的摩尔比为1:10 1:200；
~
d)缓慢搅拌反应，反应时间为0.5 2 h，反应温度为15℃ 35℃，获得虾青素‑虾铁蛋白~ ~
复合物溶液。
2.一种根据权利要求1所述的方法制备的虾青素‑虾铁蛋白复合物，其特征在于：所述虾铁蛋白和虾青素最终结合的摩尔比为1：10 1：48；所述虾青素‑虾铁蛋白复合物在450 nm~
和280 nm处具有紫外可见光谱特征吸收峰，溶液颜色为橘红色；虾铁蛋白浓度为1.0 µmol/L时，虾青素的水溶性可达到48 µmol/L。
3.根据权利要求2所述的虾青素‑虾铁蛋白复合物，其特征在于：在加入的虾铁蛋白与2+
Fe 的摩尔比例为1:200时，所述虾青素‑虾铁蛋白复合物在450 nm的紫外可见光谱分析中，2+
提高虾青素的保留率，保护虾青素免受Fe 的氧化降解。
说明书 :
2+
一种提高虾青素水溶性且保护其免受Fe 氧化降解的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种提高虾青素水溶性且保护其免受Fe2+氧化降解的方法，该方法不2+
仅可以提高虾青素水溶性，还可保护虾青素免受Fe 氧化降解，属于功能活性小分子的保护
技术。
仅可以提高虾青素水溶性，还可保护虾青素免受Fe 氧化降解，属于功能活性小分子的保护
技术。
背景技术
[0002] 虾青素(3,3′‑二羟基‑4,4′‑二酮基‑β,β′‑胡萝卜素)，分子式为C40H52O4，相对分子量为596.86，是1种酮式萜烯类不饱和结构的天然类胡萝卜素，广泛存在于海洋动植物中，
如藻类、鲑鱼、鳟鱼、虾和螃蟹等。虾青素分子结构中有2个β‑紫罗酮环和11个共轭双键，具
有极强的抗氧化性和良好的生理活性，能够有效淬灭单线态氧、清除氧自由基、防紫外线辐
射等，同时，在保护机体免受糖尿病、癌症、高血压、心血管疾病、神经退行性疾病以及某些
免疫系统疾病等多种疾病的侵袭方面具有非凡的潜力，另外目前虾青素已经被用作鱼类、
虾蟹等甲壳类动物以及家禽的饲料添加剂，提高畜禽、鱼类的繁殖能力和成活率，优化体色
肉质；用作食品添加剂改善食品的着色、保鲜及增强营养，因而在食品、保健品、药品、化妆
品、水产养殖等领域中具有巨大的潜在应用价值和广阔开发前景。虽然缺乏维生素A原活
性，但虾青素的抗氧化能力是玉米黄质、叶黄素、角黄素、β‑胡萝卜素的10倍，是α‑生育酚的
2+
100倍。然而，虾青素稳定性极差，在食品储存和加工过程中易受Fe 诱导的化学降解，因为
铁是人体的一种微量矿物元素，尤其是亚铁，通过反应式1‑3，可以在需氧条件下诱导溶液
·‑
中的活性氧化物种。所有这些活性氧(ROS)包括O2 ，H2O2和HO·是有毒性的，可损害虾青素
等功能营养因子。因此，开发一种简单而有效的方法来保护虾青素免受铁诱导的氧化损伤
至关重要。
如藻类、鲑鱼、鳟鱼、虾和螃蟹等。虾青素分子结构中有2个β‑紫罗酮环和11个共轭双键，具
有极强的抗氧化性和良好的生理活性，能够有效淬灭单线态氧、清除氧自由基、防紫外线辐
射等，同时，在保护机体免受糖尿病、癌症、高血压、心血管疾病、神经退行性疾病以及某些
免疫系统疾病等多种疾病的侵袭方面具有非凡的潜力，另外目前虾青素已经被用作鱼类、
虾蟹等甲壳类动物以及家禽的饲料添加剂，提高畜禽、鱼类的繁殖能力和成活率，优化体色
肉质；用作食品添加剂改善食品的着色、保鲜及增强营养，因而在食品、保健品、药品、化妆
品、水产养殖等领域中具有巨大的潜在应用价值和广阔开发前景。虽然缺乏维生素A原活
性，但虾青素的抗氧化能力是玉米黄质、叶黄素、角黄素、β‑胡萝卜素的10倍，是α‑生育酚的
2+
100倍。然而，虾青素稳定性极差，在食品储存和加工过程中易受Fe 诱导的化学降解，因为
铁是人体的一种微量矿物元素，尤其是亚铁，通过反应式1‑3，可以在需氧条件下诱导溶液
·‑
中的活性氧化物种。所有这些活性氧(ROS)包括O2 ，H2O2和HO·是有毒性的，可损害虾青素
等功能营养因子。因此，开发一种简单而有效的方法来保护虾青素免受铁诱导的氧化损伤
至关重要。
[0003]
[0004] O2·‑+H++H2O→H2O2 (2)
[0005] H2O2+Fe2+→Fe3++HO·+HO‑ (3)
[0006] 铁蛋白是一种重要的铁储藏蛋白，广泛分布于人类和许多生物中。每个铁蛋白由24个亚基组成，这些亚基自组装形成一个外径为12nm、内腔直径为8nm的中空蛋白笼结构。
在脊椎动物中，铁蛋白由两种亚基H和L组成。这两种亚基在铁蛋白的比率取决于组织的性
质和功能而有所不同。在功能上，H亚基含有双核“亚铁氧化中心”，当添加到脱铁蛋白的铁
2+
离子浓度低时(亚铁离子与蛋白质的比例≤48/1)，铁蛋白的亚铁氧化中心催化Fe 被O2快
3+ 3+ 3+
速氧化为Fe (反应式4)，然后水解Fe 并迁移出亚铁氧化中心，形成Fe 矿物核，超过该比
2+
例，在亚铁氧化中心产生的H2O2会迅速与过量的Fe 发生去毒反应(反应式5)。因此，铁蛋白
具有解毒活性，可通过方程式4和5减弱亚铁离子诱导的ROS的产生，防止铁诱导的细胞氧化
损伤。另外来源于海洋生物的虾铁蛋白具有很好的稳定性，在90℃加热10分钟而不发生变
性。通过其与反式虾青素在溶液中的非共价相互作用，可以将反式虾青素结合在虾铁蛋白
2+
外表面，以此提高虾青素的水溶性并保护虾青素免受Fe 氧化降解。
在脊椎动物中，铁蛋白由两种亚基H和L组成。这两种亚基在铁蛋白的比率取决于组织的性
质和功能而有所不同。在功能上，H亚基含有双核“亚铁氧化中心”，当添加到脱铁蛋白的铁
2+
离子浓度低时(亚铁离子与蛋白质的比例≤48/1)，铁蛋白的亚铁氧化中心催化Fe 被O2快
3+ 3+ 3+
速氧化为Fe (反应式4)，然后水解Fe 并迁移出亚铁氧化中心，形成Fe 矿物核，超过该比
2+
例，在亚铁氧化中心产生的H2O2会迅速与过量的Fe 发生去毒反应(反应式5)。因此，铁蛋白
具有解毒活性，可通过方程式4和5减弱亚铁离子诱导的ROS的产生，防止铁诱导的细胞氧化
损伤。另外来源于海洋生物的虾铁蛋白具有很好的稳定性，在90℃加热10分钟而不发生变
性。通过其与反式虾青素在溶液中的非共价相互作用，可以将反式虾青素结合在虾铁蛋白
2+
外表面，以此提高虾青素的水溶性并保护虾青素免受Fe 氧化降解。
[0007] 2Fe2++O2+4H2O→2Fe(O)OH(core)+H2O2+4H+ (4)
[0008] 2Fe2++H2O2+2H2O→2Fe(O)OH(core)+4H+ (5)
[0009] 目前，利用铁蛋白来提高虾青素的水溶性，保护虾青素免受Fe2+氧化降解的技术在国内外还尚无报道。
发明内容
[0010] 本发明的目的是提供一种提高虾青素水溶性、保护其免受Fe2+化学降解的一种方法。以水溶性和稳定性较好的虾铁蛋白为模板，可以显著提高其水溶性和稳定性，利用虾铁
2+ 3+
蛋白“亚铁氧化中心”催化Fe 被O2快速氧化为Fe 的性能，保护虾青素在储存和加工过程中
2+
免受Fe 诱发的氧化降解，可以将其用于食品、保健品、药品、化妆品、水产养殖等领域中。
2+ 3+
蛋白“亚铁氧化中心”催化Fe 被O2快速氧化为Fe 的性能，保护虾青素在储存和加工过程中
2+
免受Fe 诱发的氧化降解，可以将其用于食品、保健品、药品、化妆品、水产养殖等领域中。
[0011] 为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
[0012] 一种提高虾青素水溶性且保护其免受Fe2+氧化降解的方法，所述制备方法包括如下步骤：
[0013] a)制备浓度为0.25～3.0mmol/L的虾青素溶液，即称取0.0036g虾青素将其溶于2.0mL～24.0mL二甲基亚砜/乙醇/丙酮中；
[0014] b)分离纯化虾铁蛋白，制备浓度为0.5～20μmol/L的虾铁蛋白溶液。
[0015] c)将步骤b制备的虾铁蛋白溶液缓慢搅拌，之后将步骤a制备的虾青素溶液缓慢滴加到虾铁蛋白溶液中，虾铁蛋白与虾青素的摩尔比为1:10～1:200；
[0016] d)缓慢搅拌反应，反应时间为0.5～2h，反应温度为15℃～35℃，获得虾青素‑虾铁蛋白复合物溶液；
[0017] 根据上述的制备方法制备的虾青素‑虾铁蛋白复合物，虾铁蛋白和虾青素最终的结合比例为1：10～1：48。
[0018] 所述虾青素‑虾铁蛋白复合物在450nm和280nm处具有紫外可见光谱特征吸收峰，溶液颜色为橘红色。
[0019] 虾铁蛋白浓度为1.0μmol/L时，虾青素的水溶性可达到48μmol/L。
[0020] 在加入的Fe2+与虾铁蛋白的摩尔比例为10:1～200:1时，所述虾青素‑虾铁蛋白复合物在450nm的紫外可见光谱分析中，可以很大程度上提高虾青素的保留率，保护虾青素免
2+
受Fe 的氧化降解。
2+
受Fe 的氧化降解。
[0021] 与游离虾青素相比，一定量虾铁蛋白的存在可以将虾青素的保留率从56％升高至95％。
[0022] 与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
[0023] 虾青素具有很好的抗氧化效果，但其水溶性和稳定性极差，易受光、热、氧和溶剂等环境因素的影响，且在人体消化系统的吸收较差。为了提高虾青素的物理稳定性和生物
利用度，目前已经采用了许多策略，如高压均质、微通道乳化等，但这些方法大都需要严苛
的环境条件且较为繁琐，配方和成分受到食品级应用要求的限制，而且没有针对保护虾青
素免受铁诱导的氧化损伤的简易方法。近年来，铁蛋白由于其独特的结构和纳米尺寸，在营
养物质或药物的封装、传递和持续释放方面获得了极大的兴趣。目前，种类繁多的生物活性
小分子，特别是水溶性差的分子如β‑胡萝卜素、姜黄素、芦丁和光敏剂已被封装在铁蛋白的
笼内，以提高其水溶性或稳定性。然而，人们很少关注H型铁蛋白(例如人H链铁蛋白)是一种
酶，它能以可溶的、无毒的、生物可利用的形式存储大量的铁原子，可以抑制活性氧的产生，
防止铁诱导的细胞氧化损伤。
利用度，目前已经采用了许多策略，如高压均质、微通道乳化等，但这些方法大都需要严苛
的环境条件且较为繁琐，配方和成分受到食品级应用要求的限制，而且没有针对保护虾青
素免受铁诱导的氧化损伤的简易方法。近年来，铁蛋白由于其独特的结构和纳米尺寸，在营
养物质或药物的封装、传递和持续释放方面获得了极大的兴趣。目前，种类繁多的生物活性
小分子，特别是水溶性差的分子如β‑胡萝卜素、姜黄素、芦丁和光敏剂已被封装在铁蛋白的
笼内，以提高其水溶性或稳定性。然而，人们很少关注H型铁蛋白(例如人H链铁蛋白)是一种
酶，它能以可溶的、无毒的、生物可利用的形式存储大量的铁原子，可以抑制活性氧的产生，
防止铁诱导的细胞氧化损伤。
[0024] 本发明所采用的方法技术简单易操作。主要成份为虾铁蛋白，即是一种天然水产品蛋白，当虾铁蛋白浓度为1.0μmol/L时，通过与反式虾青素的简单结合，可以将虾青素在
水溶液中的溶解度提高至48μmol/L。目前研究表明，20μmol/L的虾青素就可以起到显著地
清除自由基以及抑制脂质过氧化的作用。因此，本发明所制得的虾青素样品足以满足日常
抗氧化需求，可以用于功能性食品及保健品的制备。另外，本发明通过其与铁蛋白的结合，
2+
可以使其免受Fe 的氧化降解，对简化其贮藏条件，提高其贮藏期颇有益处。
水溶液中的溶解度提高至48μmol/L。目前研究表明，20μmol/L的虾青素就可以起到显著地
清除自由基以及抑制脂质过氧化的作用。因此，本发明所制得的虾青素样品足以满足日常
抗氧化需求，可以用于功能性食品及保健品的制备。另外，本发明通过其与铁蛋白的结合，
2+
可以使其免受Fe 的氧化降解，对简化其贮藏条件，提高其贮藏期颇有益处。
附图说明
[0025] 图1为不同浓度Fe2+离子对游离虾青素及本发明制备的虾青素‑虾铁蛋白氧化降解的紫外可见光谱图。
具体实施方式
[0026] 下面结合附图和实施例对本发明进行进一步说明。
[0027] 本发明借助虾铁蛋白的外表面结合虾青素分子，形成虾青素‑虾铁蛋白复合物，利2+
用蛋白质的水溶性和去毒保护作用，提高虾青素的水溶性和稳定性，使其免受Fe 诱导的氧
化降解，扩大虾青素的应用范围，简化虾青素的贮藏条件。
用蛋白质的水溶性和去毒保护作用，提高虾青素的水溶性和稳定性，使其免受Fe 诱导的氧
化降解，扩大虾青素的应用范围，简化虾青素的贮藏条件。
[0028] 一种虾青素‑虾铁蛋白复合物的制备方法，包括如下步骤：
[0029] a)制备浓度为0.25～3.0mmol/L的虾青素溶液，即称取0.0036g虾青素将其溶于2.0mL～24.0mL二甲基亚砜/乙醇/丙酮中；
[0030] b)分离纯化虾铁蛋白，制备浓度为0.5～20μmol/L的虾铁蛋白溶液。
[0031] c)将步骤b制备的虾铁蛋白溶液缓慢搅拌，之后将步骤a制备的虾青素溶液缓慢滴加到虾铁蛋白溶液中，虾铁蛋白与青素的摩尔比为1:10～1:200；
[0032] d)缓慢搅拌反应，反应时间为0.5～2h，反应温度为15℃～35℃，获得虾青素‑虾铁蛋白复合物溶液；
[0033] 一种根据所述的制备方法制备的虾青素‑虾铁蛋白复合物，虾铁蛋白和虾青素最终的结合比例为1：10～1：48。
[0034] 所述虾青素‑虾铁蛋白复合物在450nm和280nm处具有紫外可见光谱特征吸收峰，溶液颜色为橘红色。
[0035] 虾铁蛋白浓度为1.0μmol/L时，虾青素的水溶性可达到48μmol/L。
[0036] 在加入的Fe2+与虾铁蛋白的摩尔比例为10:1～200:1时，所述虾青素‑虾铁蛋白复合物在450nm的紫外可见光谱分析中，可以很大程度上提高虾青素的保留率，保护虾青素免
2+
受Fe 的氧化降解。
2+
受Fe 的氧化降解。
[0037] 与游离虾青素相比，一定量虾铁蛋白的存在可以将虾青素的保留率从56％升高至95％。
[0038] 实施例
[0039] 虾青素‑虾铁蛋白复合物的制备：
[0040] a)制备浓度为1.0mmol/L的虾青素溶液，将其溶于二甲基亚砜中；
[0041] b)分离纯化虾铁蛋白，制备浓度为1.0μmol/L的虾铁蛋白溶液；
[0042] c)将步骤b制备的虾铁蛋白溶液缓慢搅拌，之后将步骤a制备的虾青素溶液缓慢滴加到虾铁蛋白溶液中，每次2μL,滴加10次，虾铁蛋白与青素的摩尔比为1:20；
[0043] d)缓慢搅拌反应，反应时间为0.5h，反应温度为20℃，获得虾青素‑虾铁蛋白复合物溶液；
[0044] 检测本发明的虾青素‑虾铁蛋白复合物免受Fe2+诱导的氧化降解的能力。
[0045] 通过在分光光度计上扫描200‑700nm的紫外可见光谱，研究了Fe2+诱导的虾青素氧化损伤。首先，将虾青素(1.0mmol/L，10μL)稀释至1.0mLMOPS缓冲液或虾铁蛋白溶液(0.5μ
mol/L，pH7.5)，制备成虾青素终浓度为10.0μmol/L的溶液。其次，以1分钟的间隔将2.0μ
2+
LFeSO4溶液(5mmol/L，pH2.0)滴定到上述溶液中10次。如图1所示，随着Fe 的滴加，虾青素
2+
在450nm的吸收峰逐渐下降，表明虾青素降解，而虾青素‑虾铁蛋白复合溶液在滴加Fe 后，
450nm的虾青素特征吸收峰只有很轻微的下降。虾铁蛋白的存在可以将虾青素的保留率从
2+
56％升高至95％，表明虾铁蛋白可以极大程度上保护虾青素免受Fe 诱导的氧化降解。
mol/L，pH7.5)，制备成虾青素终浓度为10.0μmol/L的溶液。其次，以1分钟的间隔将2.0μ
2+
LFeSO4溶液(5mmol/L，pH2.0)滴定到上述溶液中10次。如图1所示，随着Fe 的滴加，虾青素
2+
在450nm的吸收峰逐渐下降，表明虾青素降解，而虾青素‑虾铁蛋白复合溶液在滴加Fe 后，
450nm的虾青素特征吸收峰只有很轻微的下降。虾铁蛋白的存在可以将虾青素的保留率从
2+
56％升高至95％，表明虾铁蛋白可以极大程度上保护虾青素免受Fe 诱导的氧化降解。