甾体皂苷类化合物及其制备方法和应用转让专利
申请号 : CN202110450031.7
文献号 : CN113372407B
文献日 : 2022-04-15
发明人 : 李宁 , 周地 , 陈刚
申请人 : 沈阳药科大学
摘要 :
权利要求 :
1.一种甾体皂苷类化合物的制备方法,其特征在于,主要包括如下步骤:(1)用乙醇水溶液提取天冬,回收提取溶剂,得粗提物;
(2)将步骤(1)所得粗提物加水溶解,上样至大孔吸附树脂色谱柱,梯度洗脱,洗脱液为乙醇‑水体积比由0:100逐渐增加至100:0的混合溶剂,收集乙醇‑水体积比为70:30~95:5的洗脱物;
(3)将步骤(2)所得的洗脱物上样到硅胶柱色谱柱,梯度洗脱,洗脱液为石油醚和乙酸乙酯体积比由100:15逐渐降低到1:2的混合溶剂,或者石油醚和丙酮体积比由100:15逐渐降低到1:2的混合溶剂,或者二氯甲烷和丙酮体积比由100:10逐渐降低到2:1的混合溶剂,或者氯仿和丙酮体积比由100:10逐渐降低到2:1的混合溶剂,或者二氯甲烷和甲醇体积比由100:8逐渐降低到4:1的混合溶剂,或者氯仿和甲醇体积比由100:8逐渐降低到4:1的混合溶剂,收集体积比为100:15~4:1的洗脱物;
(4)将步骤(3)所得的洗脱物上样到ODS柱色谱,梯度洗脱,洗脱液为甲醇‑水体积比由
20:80逐渐增加至100:0的混合溶剂或乙腈‑水体积比由20:80逐渐增加至100:0的混合溶剂,收集甲醇‑水体积比为2:8~8:2或乙腈‑水体积比为2:8~8:2的洗脱物;
(5)将步骤(4)所得的洗脱物,上样到HPLC YMC ODS‑A色谱柱,用甲醇‑水的体积比为5:
5~9:1的混合溶剂或者乙腈‑水的体积比为2:8~7:3的混合溶剂为流动相进行洗脱,得到甾体皂苷化合物;
所得的甾体皂苷类化合物的结构如下:
2.根据权利要求1所述甾体皂苷类化合物的制备方法,其特征在于,步骤(1)中所述提取为加热回流提取或加热超声提取1~6次,乙醇水溶液的体积百分比浓度为50%~99%,天冬与乙醇水溶液的重量体积比为1:5~1:20g/mL。
3.根据权利要求1所述甾体皂苷类化合物的制备方法,其特征在于,步骤(2)中所述的大孔吸附树脂色谱柱采用水溶解后全拌样的上样方法,具体步骤为将粗提物溶解于水中,粗提物与水的重量体积比为1:1~1:8,得到粗提物的水溶液,加入3~10倍粗提物重量的大孔吸附树脂搅拌均匀,滤干。
4.根据权利要求1所述甾体皂苷类化合物的制备方法,其特征在于,步骤(4)中所述洗脱液为甲醇‑水体积比由40:60逐渐增加至80:20的混合溶剂或乙腈‑水体积比由40:60逐渐增加至80:20的混合溶剂,收集甲醇‑水体积比为4:6~8:2或乙腈‑水体积比为4:6~8:2的洗脱物。
5.根据权利要求1所述甾体皂苷类化合物的制备方法,其特征在于,步骤(5)中使用甲醇‑水的体积比为60:40~85:15的混合溶剂或者乙腈‑水的体积比为35:75~65:35的混合溶剂为流动相。
说明书 :
甾体皂苷类化合物及其制备方法和应用
技术领域
背景技术
养阴清热,润肺滋肾,传统用于治疗阴虚发热、肺痈、消渴等病症。天冬主要分布于温带至热
带地区,约有300种,我国有24种和一些外来栽培品种,主要生长于阴湿的山野林边、草丛或
灌木丛中,也有栽培种植,主产于华东、中南、西南等地,其中以贵州所产品质最佳,最早记
载于《神农本草经》,之后历代本草皆有记载。虽然国内外研究学者已对天冬的化学成分和
药理作用进行了部分研究,现仍急需进一步研究开发中药天冬中的功能活性成分以便更好
地开发其药用价值。
发明内容
或β‑D‑Glc‑(1→2)‑[α‑L‑Rha‑(1→4)]‑β‑D‑Glc。
95:5 的洗脱物;
逐渐降低到1:2的的混合溶剂,或者二氯甲烷和丙酮体积比由100:0逐渐降低到1:1的混合
溶剂,或者氯仿和丙酮体积比由100:4逐渐降低到2:1的混合溶剂,或者二氯甲烷和甲醇体
积比由 100:0逐渐降低到1:1的混合溶剂,或者氯仿和甲醇体积比由100:0逐渐降低到1:1
的的混合溶剂,收集体积比为100:8~1:2的洗脱物;
溶剂,收集甲醇‑水体积比为2:8~8:2或乙腈‑水体积比为2:8~8:2的洗脱物;
得到甾体皂苷化合物。
水溶液,加入3~10倍粗提物重量的大孔吸附树脂搅拌均匀,滤干。
二氯甲烷和丙酮体积比由100:10逐渐降低到2:1的的混合溶剂,或者氯仿和丙酮体积比由
100:10逐渐降低到2:1的混合溶剂,或者二氯甲烷和甲醇体积比由100:8逐渐降低到4:1的
混合溶剂,或者氯仿和甲醇体积比由100:8逐渐降低到4:1的的混合溶剂,收集体积比为
100:15~4:1的洗脱物。
~8:2 或乙腈‑水体积比为4:6~8:2的洗脱物。
对制备得到的甾体皂苷类1~8的抗癌活性进行了评价。
具体实施方式
出创造性劳动性的前提下,获得其他的类似的实施例均落入本发明的保护范围。
醇水和90%乙醇水梯度洗脱,得到不同极性的洗脱物;
52min) (收率为0.00054%),得到甾体皂苷2(tR=71min)(收率为0.00030%),得到甾体皂
苷6(tR=67min)(收率为0.00039%)。
(收率为0.00060%),得到甾体皂苷4(tR=39min)(收率为0.00046%)。
(收率为0.00049%)。
(收率为0.00026%),得到甾体皂苷8(tR=66min)(收率为0.00031%)。
[M‑H] (calcd.for C40H63O14,767.4218),可知其分子式为C40H64O14。H‑NMR(600MHz,
pyridine‑d5)中,高场区可见7个甲基氢信号:δH 0.85(3H,s,CH3‑28),0.96(3H,s,CH3‑18),
0.89 (3H,s,CH3‑19),1.10(3H,d,J=6.8Hz,CH3‑21),1.24(3H,s,CH3‑26/27),1.44(3H,s,
CH3‑26/27),1.75(3H,d,J=6.8Hz,CH3‑6”)。低场区提供2个糖端基氢信号:δH 4.99(1H,m,
13
H‑1'),5.92(1H,br.s,H‑1”)和1个双键氢信号δH 5.37(1H,d,J=5.5Hz,H‑11)。C‑NMR(150
MHz,pyridine‑d5)谱中共给出40个碳信号,包含27个变形螺甾烷醇型甾体母核碳信号和2
组糖上碳信号,其中包括2个糖端基碳信号δC 102.5(C‑1'),103.2(C‑1”)和1个甲基碳信号
δC 19.0 (CH3‑6”);根据化合物1的1D NMR数据,并结合文献和化合物1糖端基氢信号的偶合
常数,可推测化合物结构为F环为五元环的变形螺甾烷醇型甾体皂苷,且含有的糖片段为1
1 1
个β‑葡萄糖基和1个α‑鼠李糖基,并根据HSQC和H‑H COSY谱的相关信息对氢碳数据进行归
属 (见表2)。
0.85(3H,s, CH3‑28)与δC 43.5(C‑13),49.8(C‑14),41.1(C‑15),δH 1.24(3H,s,CH3‑26/
27)和45.4(C‑24),78.3 (C‑25),31.8(C‑27/26),δH 1.44(3H,s,CH3‑27/26)和45.4(C‑24),
78.3(C‑25)的远程相关,提示 CH3‑28连接在C‑14位,CH3‑26,27连接在C‑25位,且结构中存
在一个五元氧环,即F环。 NOESY谱中,δH 3.17(H‑2β)与δH 3.80(H‑6),2.08(CH3‑19)相关,
δH 1.53(H‑2α)与δH 3.99(H‑3), 1.27(H‑5)相关,δH 0.85(CH3‑28)和4.93(H‑23)相关,δH
2.67(H‑20)与δH 0.96(CH3‑18),4.38 (H‑23)相关,提示C‑16位和C‑23位上的两个‑OH和C‑
14上的‑CH3均为α取向,3位上的糖取代为β取向,且A/B环为反式骈合。综上,鉴定化合物1的
结构为: furospirost‑5‑ene‑3β,6α,23α‑triol‑3‑O‑α‑L‑rhamnopyranosyl‑(1→4)‑β‑D‑
glucopyrano‑side.经检索,该化合物为一未见报道的新化合物,将其命名为
asparagusoside A。
[M‑H] (calcd.for C39H65O13,741.4425),可知其分子式为C39H66O13,H‑NMR(600MHz,
pyridine‑d5)谱中,在高场区可见6个甲基氢信号:δH 1.15(3H,s,CH3‑18),0.95(3H,s,CH3‑
19), 1.37(3H,d,J=6.8Hz,CH3‑21),1.01(3H,d,J=6.7Hz CH3‑26/27),1.03(3H,d,J=
6.5Hz, CH3‑26/27),1.76(3H,d,J=6.1Hz,CH3‑6”)。在低场区提供2个糖端基氢信号:δH
13
4.98(1H,m, H‑1'),5.95(1H,br.s,H‑1”)和1个双键氢信号δH 5.35(1H,d,J=4.9Hz,H‑6)。C‑
NMR(150 MHz,pyridine‑d5)谱中共给出39个碳信号,包含27个呋甾烷醇型甾体母核碳信号
和2组糖上碳信号,其中包括2个糖端基碳信号δC 102.9(C‑1'),103.2(C‑1”)和1个甲基碳
信号δC 19.0 (CH3‑6”);根据化合物2的1D NMR数据,并结合文献和化合物2糖端基氢信号的
偶合常数,可推测化合物结构为E环开环的呋甾烷醇型甾体皂苷,且含有的糖片段为1个β‑
1 1
葡萄糖基和 1个α‑鼠李糖基,根据HSQC和H‑H COSY谱的相关信息对氢碳数据进行归属(见
表2)。
1.37(3H,d,J= 6.8Hz,CH3‑21)与δC 61.7(C‑17),35.3(C‑20),79.0(C‑22),δH 1.01(3H,d,
J=6.7Hz CH3‑26/27) 和45.8(C‑24),25.6(C‑25),23.0(C‑27/26),δH 1.03(3H,d,J=
6.5Hz,CH3‑27/26)和45.8(C‑24), 24.3(C‑26/27)的远程相关,提示化合物2为E、F环开环
以侧链形式连接在C‑17位上的呋甾烷醇型甾体皂苷。NOESY谱中,δH 0.95(H‑14)与δH 4.87
(H‑16),1.46(H‑17)相关,提示C‑16 位和C‑17位上所连接的长侧链均为β取向,但因为侧链
的自由旋转,无法确定侧链上C‑20, C‑21,C‑22的构型,现仅可确定化合物2的侧链平面结
构。综上,鉴定化合物2的结构为: 16β,22,23‑trihydroxycholest‑5‑ene‑3β‑yl‑O‑α‑L‑
rhamnopyranosyl‑(1→4)‑β‑D‑glucopyranoside。经检索,该化合物为一未见报道的新化
合物,将其命名为asparagusoside B。
[M+CH3COOH‑H] (calcd.for C41H65O15,797.4323),可知其分子式为C39H62O13。H‑NMR(600
MHz,pyridine‑d5)谱中,高场区可见5个甲基氢信号:δH 0.87(3H,s,CH3‑18),0.89(3H,s,
CH3‑19),1.14(3H,d,J=6.9Hz,CH3‑21),0.71(3H,d,J=5.2Hz,CH3‑27),1.75(3H,d,J=6.2
Hz,CH3‑6”)。低场区提供2个糖端基氢信号:δH 4.97(1H,m,H‑1'),5.94(1H,br.s,H‑1”)和1
13
个双键氢信号δH 5.82(1H,d,J=4.0Hz,H‑6)。C‑NMR(150MHz,pyridine‑d5)谱中共给出39
个碳信号,包含27个异螺甾烷醇型甾体母核碳信号和2组糖上碳信号,其中包括2个糖端基
碳信号δC 103.2(C‑1'),103.2(C‑1”)和1个甲基碳信号δC 19.1(CH3‑6”);根据化合物3的1D
NMR数据,并结合文献和化合物3糖端基氢信号的偶合常数,可推测化合物结构中的糖片段
为1个β‑葡萄糖基和1个α‑鼠李糖基,且与已知化合物prosapogrnin B对比发现,主要差异
为化合物3在C‑7位上有一个羟基取代基的存在。当H‑7为β构型时,H‑7与H‑8之间的二面角
约为60°,为α构型时,H‑7和H‑8二面角约为180°,同时根据δH 5.82(1H,d,J=4.0 Hz,H‑6),
3.28(1H,t,J=7.4,4.0Hz,H‑7),3.34(1H,m,H‑8)间的偶合情况,可知H‑7与H‑8间的偶合常
数为J=7.4Hz,因此推测H‑7为β构型。并根据HSQC谱的相关信息对氢碳数据进行归属(见表
2)。
5.82(1H,d,J= 4.0Hz,H‑6)与δC 74.0(C‑7),37.5(C‑1),δH 3.28(1H,t,J=7.4,4.0Hz,H‑
7)和43.5(C‑9)的远程相关,提示化合物3的C‑7位上有一个羟基取代基。NOESY谱中,δH
2.80(H‑4)与δH 3.28(H‑7) 相关,提示C‑7位上的羟基为α取向。综上,鉴定化合物3的结构
为7‑hydroxy prosapogenin B,经检索,该化合物为一未见报道的新化合物,将其命名为
asparagusoside C。
[M‑H] (calcd.for C45H71O17,883.4691),可知其分子式为C45H72O17。H‑NMR(400MHz,
pyridine‑d5)中,高场区可见6个甲基氢信号:δH 0.82(3H,s,CH3‑18),1.05(3H,s,CH3‑19),
1.19 (3H,d,J=6.9Hz,CH3‑21),1.33(3H,d,J=6.9Hz,CH3‑27),1.78(3H,d,J=6.2Hz,CH3‑
6”), 1.65(3H,d,J=6.1Hz,CH3‑6”')。低场区提供3个糖端基氢信号:δH 4.96(1H,m,H‑1'),
6.43(1H, br.s,H‑1”),5.89(1H,br.s,H‑1”')和1个双键氢信号δH 5.32(1H,d,J=3.8Hz,
13
H‑6)。C‑NMR (100MHz,pyridine‑d5)谱中共给出45个碳信号,包含27个螺甾烷醇型甾体母
核碳信号和3组糖上碳信号,其中包括3个糖端基碳信号δC 100.6(C‑1'),102.4(C‑1”),
103.2(C‑1”')和2个甲基碳信号δC 19.0(CH3‑6”)和18.7(CH3‑6”');根据化合物4的1D NMR
数据,并结合文献和化合物4糖端基氢信号的偶合常数,可推测化合物结构中的糖片段为1
个β‑葡萄糖基和2个α‑鼠李糖基,且与已知化合物polygonoside 6对比,主要区别为F环不
同。并根据HSQC谱的相关信息对氢碳数据进行归属(见表2)。
李糖基分别连接在葡萄糖基的C‑2'和C‑4'位。δH 2.16(H‑23)与δC 111.8(C‑22),δC 66.8
(C‑24),δH 4.64(H‑24)与δC 10.1(C‑27)的远程相关,提示F环上的C‑24位有羟基取代。
NOESY谱中,δH 4.57(H‑16)与δH 1.18(H‑14),1.19(CH3‑21),4.64(H‑24)相关,δH 2.01(H‑
20)与δH 0.82(CH3‑18),1.33(CH3‑27) 相关,且与已知化合物polygonoside 6,(24S,25S)‑
spirost‑5‑ene‑3β, 24‑diol‑3‑O‑α‑L‑rhamnopyranosyl‑(1→2)‑[α‑L‑
rhamnopyranosyl‑(1→4)]‑β‑D‑glucopyranoside相比,H3‑27的构型对比δH 0.95(3H,d,J
=6.6Hz H3‑27)/δC 13.5(C‑27),提示C‑24和C‑25构型分别为24S,25R。综上,鉴定化合物4
的结构为 (24S,25R)‑spirost‑5‑ene‑3β,24‑diol‑3‑O‑α‑L‑rhamnopyranosyl‑(1→2)‑
[α‑L‑rhamnopyranosyl‑(1→ 4)]‑β‑D‑glucopyranoside。经检索,该化合物为一未见报道
的新化合物,将其命名为 asparagusoside D。
[M‑H] (calcd.for C39H61O13,737.4112),可知其分子式为C39H62O13。H‑NMR(600MHz,
pyridine‑d5)谱中,高场区给出5个甲基氢信号:δH 0.84(3H,s,CH3‑18),0.91(3H,s,CH3‑
19), 1.18(3H,d,J=7.0Hz,CH3‑21),1.11(3H,d,J=6.5Hz,CH3‑27),1.76(3H,d,J=6.2Hz,
CH3‑6”)。低场区提供2个糖端基氢信号:δH 4.98(1H,d,J=7.9Hz,H‑1'),5.94(1H,br.s,H‑
13
1”) 和1个双键氢信号δH 5.32(1H,d,J=5.0Hz,H‑6)。C‑NMR(150MHz,pyridine‑d5)谱中
共给出39个碳信号,包含27个异螺甾烷醇型甾体母核碳信号和2组糖上碳信号,其中包括2
个糖端基碳信号δC 102.8(C‑1'),103.1(C‑1”)和1个甲基碳信号δC 19.0(CH3‑6”);根据化
合物5 的1D NMR数据,并结合文献和化合物5糖端基氢信号的偶合常数,可推测化合物结构
中的糖片段为1个β‑葡萄糖基和2个α‑鼠李糖基,并与已知化合物polygonoside 6进行对
比,二者母核相同,主要区别糖取代基的不同。并根据HSQC谱相关信息对氢碳数据进行归属
(见表2)。
3.62(H‑26)与δC 71.0(C‑25),δH 1.11(3H,d,J=6.5Hz,CH3‑27)和71.0(C‑24),40.4(C‑
25),65.7(C‑26)的远程相关,提示化合物5的C‑24位有羟基取代。NOESY谱中,H3‑18/H‑20,
H‑20/H‑25,H‑17/H3‑27, H‑15α/H‑24的相关,并且对比polygonoside 6证明24S,25S构型。
综上,鉴定化合物5的结构为:(24S,25S)‑spirost‑5‑ene‑3β,24‑diol‑3‑O‑α‑L‑
rhamnopyranosyl‑(1→4)‑β‑D‑glucopyranoside,经检索,该化合物为一未见报道的新化
合物,将其命名为asparagusoside E。
[M‑H] (calcd.for C39H61O14,753.4061),可知其分子式为C39H62O14。H‑NMR(600MHz,
pyridine‑d5)谱中,高场区可见5个甲基氢信号:δH 1.06(3H,s,CH3‑18),0.86(3H,s,CH3‑
19), 1.22(3H,d,J=7.0Hz,CH3‑21),1.12(3H,d,J=6.5Hz,CH3‑27),1.75(3H,d,J=6.1Hz,
CH3‑6”),低场区提供2个糖端基氢信号:δH 4.97(1H,m,H‑1'),5.94(1H,br.s,H‑1”)和1个双
13
键氢信号δH 5.30(1H,d,J=4.4Hz,H‑6)。C‑NMR(150MHz,pyridine‑d5)谱共给出39个碳信
号,包含27个异螺甾烷醇型甾体母核碳信号和2组糖上碳信号,其中包括2个糖端基碳信号:
δC 102.8(C‑1'),103.2(C‑1”)和1个甲基碳信号δC 19.0(C‑6”);根据化合物6的1D NMR数
据,并结合文献和化合物6糖端基氢信号的偶合常数,可推测化合物结构中的糖片段为1个
β‑葡萄糖基和1个α‑鼠李糖基,并与已知化合物(23S,24R, 25S)‑23,‑24‑
dihydroxyspirost‑5‑en‑3β‑yl‑O‑α‑L‑rhamnopyranosyl‑(1→2)‑β‑D‑glucopyranoside
对比发现,二者母核相同,其主要区别在糖取代基不同。根据HSQC谱相关信息对氢碳数据进
行归属(见表2)。
为: (23S,24R,25S)‑23,‑24‑dihydroxyspirost‑5‑en‑3β‑yl‑O‑α‑L‑rhamnopyranosyl‑(1
→4)‑β‑D‑glucopyra noside。经检索,该化合物为一未见报道的新化合物,将其命名为
asparagusoside F。
[M‑H] (calcd.for C39H63O12,723.4320),可知其分子式为C39H64O12。H‑NMR(600MHz,
pyridine‑d5)谱中,高场区可见5个甲基氢信号:δH 0.84(3H,s,CH3‑18),0.84(3H,s,CH3‑
19), 1.16(3H,d,J=6.8Hz,CH3‑21),0.70(3H,d,J=4.9Hz,CH3‑27),1.73(3H,d,J=6.1Hz,
13
CH3‑6”)。低场区提供2个糖端基氢信号:δH 4.97(1H,m,H‑1'),5.94(1H,br.s,H‑1”)。C‑
NMR (150MHz,pyridine‑d5)谱中共给出39个碳信号,包含27个异螺甾烷醇型甾体母核碳信
号和2 组糖上碳信号,其中包括2个糖端基碳信号:δC 103.0(C‑1'),103.3(C‑1”)和1个甲
基碳信号δC 18.9(C‑6”);根据化合物7的1D NMR数据,并结合文献NMR数据和化合物7糖端
基氢信号的偶合常数,可推测化合物结构中的糖片段为1个β‑葡萄糖基和1个α‑鼠李糖基,
并根据 HSQC谱的相关信息对氢碳数据进行归属(见表1和表2)。
化合物,将其命名为asparagusoside G。
[M‑H] (calcd.for C45H73O17,885.4848),可知其分子式为C46H76O17。H‑NMR(400MHz,
pyridine‑d5)谱中,高场区给出5个甲基氢信号:δH 0.84(3H,s,CH3‑18),0.97(3H,s,CH3‑
19), 1.15(3H,d,J=6.9Hz,CH3‑21),0.71(3H,d,J=5.3Hz,CH3‑27),1.67(3H,d,J=6.1Hz,
CH3‑6”')。低场区提供3个糖端基氢信号:δH 4.86(1H,d,J=7.2Hz,H‑1'),5.43(1H,d,J=
13
7.6Hz, H‑1”),5.90(1H,br.s,H‑1”')。C‑NMR(100MHz,pyridine‑d5)谱中个碳信号,包含
27个异螺甾烷醇型甾体母核碳信号和3组糖上碳信号,其中包括3个糖端基碳信号:δC
102.3(C‑1'),106.0 (C‑1”),102.8(C‑1”')和1个甲基碳信号δC 18.9(C‑6”');根据化合物
8的1D NMR数据,并结合文献NMR数据和化合物8糖端基氢信号的偶合常数,可推测化合物结
构中的糖片段为2个β‑ 葡萄糖基和1个α‑鼠李糖基,并根据HSQC谱的相关信息对氢碳数据
1 13
进行归属(见表1和 2)。通过对比 H和 CNMR数据发现化合物8与已知化合物shatavarin IV
基本相同,主要区别在于F环中的C‑25的构型不同。
合物8的结构为:3‑O‑{[β‑D‑glucopyranosyl‑(1→2)]‑[α‑L‑rhamnopyranosyl‑(1→ 4)]‑
β‑D‑glucopyranosyl}‑(25R)‑5β‑spirostan‑3β‑ol,经检索,该化合物为一未见报道的新
化合物,将其命名为asparagusoside H。
2 30.1 30.7 30.5 30.5 30.6 30.6 27.3 27.4
3 77.9 78.7 78.6 78.4 78.6 78.6 74.8 75.8
4 30.42 39.8 39.9 39.3 39.7 39.7 30.9 31.3
5 50.5 141.3 146.7 141.1 141.2 141.3 37.3 37.2
6 68.9 122.4 121.8 122.1 122.1 122.2 27.3 27.2
7 38.0 32.6 74.0 32.6 32.6 32.6 27.1 27.1
8 41.2 32.3 56.8 32.0 32.0 31.9 35.9 35.9
9 145.9 50.8 43.5 50.6 50.6 50.6 40.5 40.7
10 39.5 37.4 38.4 37.5 37.4 37.4 35.6 35.6
11 117.5 21.6 21.4 21.4 21.5 21.5 21.5 21.5
12 37.5 41.0 40.0 40.2 40.2 40.6 40.6 40.6
13 43.5 43.8 40.7 40.8 40.8 41.3 41.2 41.3
14 49.8 55.2 49.6 57.0 57.0 57.1 56.8 56.9
15 41.1 37.2 32.6 32.5 32.5 32.5 32.5 32.6
16 82.2 73.1 81.6 81.9 81.8 82.4 81.6 81.7
17 59.1 61.7 63.3 62.7 62.9 62.3 63.4 63.6
18 19.7 13.8 16.5 16.6 16.7 17.0 16.9 17.0
19 20.8 19.9 18.7 19.8 19.8 19.7 24.2 24.4
20 36.7 35.3 42.5 42.9 42.6 37.9 42.3 42.4
21 15.2 16.8 15.5 15.2 15.4 15.0 15.4 15.4
22 118.0 79.0 109.7 111.8 112.2 113.7 109.6 109.6
23 72.5 69.6 32.3 36.4 42.2 74.2 32.2 32.3
24 45.4 45.8 29.8 66.8 71.0 76.5 29.6 29.7
25 78.3 25.6 31.1 36.3 40.4 39.7 30.8 31.0
26 31.8/30.3 24.3/23.0 67.3 64.9 65.7 64.9 67.2 67.3
27 31.8/30.3 24.3/23.0 17.8 10.1 14.0 14.1 17.7 17.7
S 3‑O‑glc 3‑O‑glc 3‑O‑glc 3‑O‑glc 3‑O‑glc 3‑O‑glc 3‑O‑glc 3‑O‑glc
1' 102.5 102.9 103.2 100.6 102.8 102.8 103.0 102.3
2' 76.0 76.0 76.0 78.3 76.0 76.0 75.9 83.2
3' 77.2 77.2 77.6 78.1 77.1 77.1 77.1 76.8
4' 78.8 78.7 78.7 78.9 78.6 78.6 78.6 77.8
5' 77.5 77.6 77.2 77.3 77.6 77.6 77.5 77.4
6' 62.0 62.0 61.9 61.6 61.9 61.9 61.9 61.7
S 2'‑rha 2'‑rha 2'‑rha 2'‑rha 2'‑rha 2'‑rha 2'‑rha 2'‑glc
1” 102.4 106.0
2” 72.9 77.4
3” 73.1 78.3
4” 74.5 72.3
5” 69.9 78.9
6” 19.0 63.3
S 4'‑rha 4'‑rha 4'‑rha 4'‑rha 4'‑rha 4'‑rha 4'‑rha 4'‑rha
1”' 103.2 103.2 103.2 103.2 103.1 103.2 103.3 102.8
2”' 73.1 73.1 73.1 72.9 73.1 73.1 73.0 72.9
3”' 73.3 73.3 73.3 73.3 73.2 73.2 73.2 73.2
4”' 74.5 74.5 74.5 74.3 74.4 74.4 74.4 74.4
5”' 70.8 70.8 70.8 70.7 70.8 70.8 70.7 70.6
6”' 19.0 19.0 19.1 18.9 19.0 19.0 18.9 18.9
‑CH3 19.7
90%乙醇‑水梯度洗脱,得到不同极性的洗脱物;
(收率为0.00051%),得到甾体皂苷2(tR=71min)(收率为0.00037%),得到甾体皂苷6(tR=
67min)(收率为0.00045%)。
(收率为0.00066%),得到甾体皂苷4(tR=39min)(收率为0.00054%)。
(收率为0.00045%)。
(收率为0.00032%),得到甾体皂苷8(tR=66min)(收率为0.00041%)。
水和90%乙醇‑水梯度洗脱,得到不同极性的洗脱物;
(收率为0.00055%),得到甾体皂苷2(tR=71min)(收率为0.00038%),得到甾体皂苷6(tR=
67min)(收率为0.00049%)。
(收率为0.00058%),得到甾体皂苷4(tR=39min)(收率为0.00060%)。
(收率为0.00053%)。
(收率为0.00024%),得到甾体皂苷8(tR=66min)(收率为0.00055%)。
水和90%乙醇‑水梯度洗脱,得到不同极性的洗脱物;
(收率为0.00050%),得到甾体皂苷2(tR=71min)(收率为0.00035%),得到甾体皂苷6(tR=
67min)(收率为0.00042%)。
(收率为0.00054%),得到甾体皂苷4(tR=39min)(收率为0.00049%)。
(收率为0.00043%)。
(收率为0.00028%),得到甾体皂苷8(tR=66min)(收率为0.00047%)。
和 90%乙醇‑水梯度洗脱,得到不同极性的洗脱物;
(收率为0.00058%),得到甾体皂苷2(tR=71min)(收率为0.00044%),得到甾体皂苷6(tR=
67min)(收率为0.00051%)。
(收率为0.00062%),得到甾体皂苷4(tR=39min)(收率为0.00057%)。
(收率为0.00058%)。
(收率为0.00039%),得到甾体皂苷8(tR=66min)(收率为0.00046%)。
和90%乙醇‑水梯度洗脱,得到不同极性的洗脱物;
(收率为0.00049%),得到甾体皂苷2(tR=71min)(收率为0.00028%),得到甾体皂苷6(tR=
67min)(收率为0.00035%)。
(收率为0.00051%),得到甾体皂苷4(tR=39min)(收率为0.00049%)。
(收率为0.00046%)。
(收率为0.00030%),得到甾体皂苷8(tR=66min)(收率为0.00029%)。
料,可作用于活细胞线粒体中的呼吸链,在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下
tetrazolium环开裂,生成蓝色的formazan结晶,formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成
正比(死细胞中琥珀酸脱氢酶消失,不能将MTT还原)。还原生成的formazan结晶可在含50%
的N,N‑二甲基甲酰胺和20%的十二甲基磺酸钠(pH 4.7)的MTT溶解液中溶解,利用酶标仪
测定490nm处的光密度OD值,以反映出活细胞数目。也可以用DMSO来溶解。
分别加入浓度分别为100μM、50μM、10μM、1μM的甾体皂苷1‑8,继续培养24小时。24 小时后,
每孔加入50μL MTT储备液,终浓度为2mg/mL。继续培养4小时后,弃去上清,每孔加DMSO 100
μL,10min后用自动酶标仪于490nm测定各孔吸光度A。
然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分或者全部技术特征进
行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术
方案的范围。