基于表型与SSR分子标记联合构建普通菜豆的指纹图谱转让专利
申请号 : CN202110879961.4
文献号 : CN113373259B
文献日 : 2022-04-05
发明人 : 杜吉到 , 杜艳丽 , 赵强 , 张琦 , 夏春阳 , 李明 , 任心雨 , 王广达 , 张兆宁
申请人 : 黑龙江八一农垦大学
摘要 :
权利要求 :
1.一种用于鉴别菜豆的分子标记组合,其特征在于,所述分子标记包括PvSSR‑01‑1、PvSSR‑02‑1、PvSSR‑02‑2、PvSSR‑03‑1、PvSSR‑03‑2、PvSSR‑04‑1、PvSSR‑04‑2、PvSSR‑05‑1、PvSSR‑05‑2、PvSSR‑06‑1、PvSSR‑06‑2、PvSSR‑07‑1、PvSSR‑07‑2、PvSSR‑08‑1、PvSSR‑08‑2、PvSSR‑09‑1、PvSSR‑09‑2、PvSSR‑10‑1、PvSSR‑10‑2、PvSSR‑11‑1、PvSSR‑11‑2,所述分子标记分别通过如下引物对扩增得到:SEQ ID NO:1‑2、SEQ ID NO:3‑4、SEQ ID NO:5‑6、SEQ ID NO:7‑8、SEQ ID NO:9‑10、SEQ ID NO:11‑12、SEQ ID NO:13‑14、SEQ ID NO:15‑16、SEQ ID NO:17‑18、SEQ ID NO:19‑20、SEQ ID NO:21‑22、SEQ ID NO:23‑24、SEQ ID NO:25‑26、SEQ ID NO:27‑28、SEQ ID NO:29‑30、SEQ ID NO:31‑32、SEQ ID NO:33‑34、SEQ ID NO:35‑36、SEQ ID NO:37‑38、SEQ ID NO:39‑40、SEQ ID NO:41‑42所示引物。
2.一种引物组合,其特征在于,包括21对特异性引物对,其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1‑SEQ ID NO:42所示。
3.一种试剂盒,其特征在于,包含权利要求1所述的分子标记组合或者权利要求2所示的引物组合。
4.一种普通菜豆指纹图谱的构建方法,其特征在于,包括构建表型指纹图谱和DNA指纹图谱:
不同普通菜豆的花色,生长习性,结荚习性,荚色,荚面,种皮斑纹,种皮斑纹色,粒形性状被采集并进行编号,构建表型指纹图谱;
利用权利要求2所述的引物组合对不同品种普通菜豆的DNA进行PCR扩增,再对扩增产物进行电泳检测,根据电泳检测结果构建DNA指纹图谱;
所述表型指纹图谱和DNA指纹图谱组合构建成普通菜豆的指纹图谱;
所述普通菜豆品种为资源库号为YD001的红腰饭豆、资源库号为YD002的YD33、资源库号为YD003的黑豆Y124、资源库号为YD005的普通菜豆Y137、资源库号为YD006的日本白普通菜豆、资源库号为YD007的黑普通菜豆Y92、资源库号为YD008的黑普通菜豆Y120、资源库号为YD009的红普通菜豆F3389、资源库号为YD010的奶圆粒、资源库号为YD011的英国红、资源库号为YD012的菜豆12、资源库号为YD013的点滴褐13、资源库号为YD016的黑普通菜豆、资源库号为YD017的蒙古圆、资源库号为YD018的英国红普通菜豆Y84、资源库号为YD019的77、资源库号为YD020的Y10Y14、资源库号为YD022的英国红普通菜豆Y84‑1、资源库号为YD023的普通菜豆Y80、资源库号为YD024的黑豆Y135、资源库号为YD025的紫花普通菜豆、资源库号为YD026的黑普通菜豆03、资源库号为YD027的Y09、资源库号为YD028的叙利亚奶花Y91、资源库号为YD029的英国红普通菜豆、资源库号为YD031的点滴褐31、资源库号为YD032的英国红普通菜豆Y84‑2、资源库号为YD033的红菜豆33、资源库号为YD034的普通菜豆Y137和资源库号为YD035的普通菜豆Y80;所述普通菜豆品种名称及资源库号均来自国家杂粮工程技术研究中心种质资源库;
根据标准DNA分子量和引物的迁移率记录电泳结果,每对引物迁移率最大的条带记为
1,迁移率次之的记为2,依次类推,无条带记为0,建立SSR基因型信息数据,按照引物顺序进行编码,得到的指纹代码即为该品种的特征指纹图谱。
5.根据权利要求4所述的构建方法,其特征在于,扩增反应体系包括如下组分:DNA模板
0.8μL,l0pmo1/L上游引物0.2μL,10pmo1/L下游引物0.2μL,10×PCR buffer 2μL,25mmol/L
2+
Mg 1.2μL,10mmol/L dNTP 0.5μL,5U/μL Taq酶0.2μL,ddH2O 14.4μL;所述PCR buffer不含
2+
Mg 。
6.根据权利要求4所述的构建方法,其特征在于,扩增反应程序包括:94℃预变性3min;
94℃变性30s,56℃退火30s,72℃延伸30s,共30个循环;72℃延伸5min,4℃保存。
7.根据权利要求1所述的分子标记组合或者权利要求2所述的引物组合或者权利要求3所述的试剂盒在获取普通菜豆指纹图谱中的应用;
所述普通菜豆品种为资源库号为YD001的红腰饭豆、资源库号为YD002的YD33、资源库号为YD003的黑豆Y124、资源库号为YD005的普通菜豆Y137、资源库号为YD006的日本白普通菜豆、资源库号为YD007的黑普通菜豆Y92、资源库号为YD008的黑普通菜豆Y120、资源库号为YD009的红普通菜豆F3389、资源库号为YD010的奶圆粒、资源库号为YD011的英国红、资源库号为YD012的菜豆12、资源库号为YD013的点滴褐13、资源库号为YD016的黑普通菜豆、资源库号为YD017的蒙古圆、资源库号为YD018的英国红普通菜豆Y84、资源库号为YD019的77、资源库号为YD020的Y10Y14、资源库号为YD022的英国红普通菜豆Y84‑1、资源库号为YD023的普通菜豆Y80、资源库号为YD024的黑豆Y135、资源库号为YD025的紫花普通菜豆、资源库号为YD026的黑普通菜豆03、资源库号为YD027的Y09、资源库号为YD028的叙利亚奶花Y91、资源库号为YD029的英国红普通菜豆、资源库号为YD031的点滴褐31、资源库号为YD032的英国红普通菜豆Y84‑2、资源库号为YD033的红菜豆33、资源库号为YD034的普通菜豆Y137和资源库号为YD035的普通菜豆Y80;所述普通菜豆品种名称及资源库号均来自国家杂粮工程技术研究中心种质资源库。
8.根据权利要求1所述的分子标记组合或者权利要求2所述的引物组合或者权利要求3所述的试剂盒或者权利要求4‑6任一项所述的构建方法在鉴别普通菜豆品种中的应用;
所述普通菜豆品种为资源库号为YD001的红腰饭豆、资源库号为YD002的YD33、资源库号为YD003的黑豆Y124、资源库号为YD005的普通菜豆Y137、资源库号为YD006的日本白普通菜豆、资源库号为YD007的黑普通菜豆Y92、资源库号为YD008的黑普通菜豆Y120、资源库号为YD009的红普通菜豆F3389、资源库号为YD010的奶圆粒、资源库号为YD011的英国红、资源库号为YD012的菜豆12、资源库号为YD013的点滴褐13、资源库号为YD016的黑普通菜豆、资源库号为YD017的蒙古圆、资源库号为YD018的英国红普通菜豆Y84、资源库号为YD019的77、资源库号为YD020的Y10Y14、资源库号为YD022的英国红普通菜豆Y84‑1、资源库号为YD023的普通菜豆Y80、资源库号为YD024的黑豆Y135、资源库号为YD025的紫花普通菜豆、资源库号为YD026的黑普通菜豆03、资源库号为YD027的Y09、资源库号为YD028的叙利亚奶花Y91、资源库号为YD029的英国红普通菜豆、资源库号为YD031的点滴褐31、资源库号为YD032的英国红普通菜豆Y84‑2、资源库号为YD033的红菜豆33、资源库号为YD034的普通菜豆Y137和资源库号为YD035的普通菜豆Y80;所述普通菜豆品种名称及资源库号均来自国家杂粮工程技术研究中心种质资源库。
说明书 :
基于表型与SSR分子标记联合构建普通菜豆的指纹图谱
技术领域
背景技术
要受温度的制约。中国的西北和东北地区在春夏栽培;直播或育苗移栽均可。同时,普通菜
豆营养丰富,含有丰富的蛋白质、脂肪、碳水化合物、膳食纤维、维生素A、萝卜素、硫胺素、核
黄素、尼克酸、维生素C、维生素E、钙、磷、钠等成分。多年来,品种鉴定是以形态学标记为依
据的。这种方法虽然简单经济,但周期长,花费大,受季节限制,而且很多性状的表现受栽培
措施及环境因子影响,从而制约了鉴定的准确性。DNA分子标记技术则具有高效、准确、不受
环境条件影响、实验操作简单等优点,已广泛应用于植物品种真实性鉴定及纯度检测研究。
SSR标记是近年来发展起来的建立在PCR基础上的第二代分子标记。由于SSR分子标记具有
数量丰富、多态性高、遗传共显性、谱带扩增稳定、精度高、检测时间短、技术成熟等特点,已
应用于作物遗传学研究。目前,菜豆中也有利用分子标记技术进行研究的,但是没有具体只
针对普通菜豆品种开发的SSR分子标记以及利用SSR分子标记构建的技术体系。
发明内容
PvSSR‑05‑2、PvSSR‑06‑1、PvSSR‑06‑2、PvSSR‑07‑1、PvSSR‑07‑2、PvSSR‑08‑1、PvSSR‑08‑2、
PvSSR‑09‑1、PvSSR‑09‑2、PvSSR‑10‑1、PvSSR‑10‑2、PvSSR‑11‑1、PvSSR‑11‑2,所述分子标
记分别通过如下引物对扩增得到:SEQ ID NO:1‑2、SEQ ID NO:3‑4、SEQ ID NO:5‑6、SEQ ID
NO:7‑8、SEQ ID NO:9‑10、SEQ ID NO:11‑12、SEQ ID NO:13‑14、SEQ ID NO:15‑16、SEQ ID
NO:17‑18、SEQ ID NO:19‑20、SEQ ID NO:21‑22、SEQ ID NO:23‑24、SEQ ID NO:25‑26、SEQ
ID NO:27‑28、SEQ ID NO:29‑30、SEQ ID NO:31‑32、SEQ ID NO:33‑34、SEQ ID NO:35‑36、
SEQ ID NO:37‑38、SEQ ID NO:39‑40、SEQ ID NO:41‑42所示引物。
菜豆、资源库号为YD007的黑普通菜豆Y92、资源库号为YD008的黑普通菜豆Y120、资源库号
为YD009的红普通菜豆F3389、资源库号为YD010的奶圆粒、资源库号为YD011的英国红、资源
库号为YD012的有机斑豆、资源库号为YD013的点滴褐、资源库号为YD016的黑普通菜豆、资
源库号为YD017的蒙古圆、资源库号为YD018的英国红普通菜豆Y84、资源库号为YD019的77、
资源库号为YD020的Y10Y14、资源库号为YD022的英国红普通菜豆Y84、资源库号为YD023的
普通菜豆Y80、资源库号为YD024的黑豆Y135、资源库号为YD025的紫花普通菜豆、资源库号
为YD026的黑普通菜豆、资源库号为YD027的Y09、资源库号为YD028的叙利亚奶花、资源库号
为YD029的英国红普通菜豆、资源库号为YD031的点滴褐、资源库号为YD032的英国红普通菜
豆Y84、资源库号为YD033的有机红小豆、资源库号为YD034的普通菜豆Y137和资源库号为
YD035的普通菜豆。
因型信息数据,按照引物顺序进行编码,得到的指纹代码即为该品种的特征指纹图谱。
2+
μL,5U/μL Taq酶0.2μL,ddH2O 14.4μL;所述PCR buffer不含Mg 。
100%。因此,本发明公开的分子标记组合和引物组合在进一步鉴别大量普通菜豆品种方面
具有很大潜力,与现有常规形态鉴定相比,具有效果更佳,且节约时间、成本等优点,本发明
可为普通菜豆品种DNA指纹鉴定提供技术支持。
附图说明
例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获
得其他的附图。
具体实施方式
个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中
间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括
或排除在范围内。
实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所
有文献通过引用并入,用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的
文献冲突时,以本说明书的内容为准。
施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
集以及编号。表型指纹排序依照主要性状、次要性状、易变性状、特殊性状进行排序,其先后
顺序为:花色、生长习性、结荚习性、荚色、荚面、种皮斑纹、种皮斑纹色、粒形(如表2所示),
表型指纹图谱见表3。
花色 白 粉红 黄白 浅紫
生长习性 直立 蔓生 半蔓生
结荚习性 无限 有限
荚色 斑纹 褐 黄白
荚面 平 微凸 凸
种皮斑纹 点 条 网 无
种皮斑纹色 粉红 褐 浅黄 无 紫
粒形 圆 方 卵 肾
成粉末。采用试剂盒法提取DNA,操作实验步骤按照试剂盒说明书进行。用琼脂糖凝胶电泳
和分光光度计检测总DNA的质量,然后将总DNA稀释成100ng/μL,储存于‑20℃备用。
DNA模板0.8μL,F‑primer(10pmol/L)0.2μL,R‑primer(10pmol/L)0.2μL,10×PCR buffer
2+ 2+
(不含Mg )2μL,Mg (25mmo1/L)1.2μL,dNTP(10mmol/L)0.5μL,Taq酶(5U/μL)0.2μL,ddH2O
14.4μL,总计20.0μL。
为2,依次类推,无条带记为0,建立SSR基因型信息数据,按照引物顺序进行编码,得到的指
纹代码即为该品种的特征指纹图谱;记录方式如图1所示。
提供技术支撑。
的各种变形和改进,均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。