一种高稳定性的蛋白多肽-纳米硒及其制备方法与应用

摘要

本发明属于纳米硒技术领域，尤其涉及一种高稳定性的蛋白多肽‑纳米硒及其制备方法。所述蛋白多肽‑纳米硒的制备方法，包括以下步骤：将大豆多肽液与纳米硒溶液混合，反应，制得蛋白多肽‑纳米硒；所述大豆多肽液中大豆多肽的分子量为10‑30kDa。采用上述方法所制得的蛋白多肽‑纳米硒的粒径较小，且稳定性高，不易发生团聚现象，具备良好的可利用度和活性。

权利要求

1.一种蛋白多肽‑纳米硒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将大豆多肽液与纳米硒溶液混合，反应，制得蛋白多肽‑纳米硒；所述大豆多肽液中大豆多肽的分子量为10‑30kDa；

所述大豆多肽液中大豆多肽的浓度为0.25‑2.5mg/mL。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述大豆多肽的制备方法为：将大豆分离蛋白与水混合，加入碱性蛋白酶进行酶解，分离纯化，得到目的分子量的大豆多肽。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述分离纯化的方法包括离心或超滤分级中的至少一种。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述碱性蛋白酶为Alcalase酶。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述纳米硒溶液的制备方法为：将半胱氨酸和亚硒酸钠在溶液中混合，经氧化还原反应，得到纳米硒溶液。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述半胱氨酸与所述亚硒酸钠的物质的量的浓度比为4：1。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，进行所述氧化还原反应时的pH值调节至8。

8.一种蛋白多肽‑纳米硒，其特征在于，由权利要求1‑7中任一项所述的制备方法所制得。

9.权利要求8所述的蛋白多肽‑纳米硒在补硒产品中的应用。

说明书

一种高稳定性的蛋白多肽‑纳米硒及其制备方法与应用

技术领域

[0001] 本发明属于纳米硒技术领域，尤其涉及一种高稳定性的蛋白多肽‑纳米硒及其制备方法。

背景技术

[0002] 硒是一种人体必需的微量元素，是人体内多种酶的组成成分，而且是构成人体多种硒蛋白及硒半胱氨酸的的必需膳食成分，对人的生长发育具有至关重要的作用，可帮助人们维持免疫力、抗衰老和抵御疾病等。人体缺乏硒元素会导致糖尿病、贫血病、关节炎等多种疾病的发生，严重危害人体健康。

[0003] 传统补硒一般采用来源于食物的有机硒或无机硒。其中无机硒的毒性大且吸收率低，而有机硒在生物体中生成要经过一个较长且不易控的生物转化过程，也有一定的潜在安全隐患。纳米硒是一种利用纳米技术制备而成的新型研制品，具有很高的生物活性，而且与无机硒和有机硒相比，它具有高吸收率、低毒安全、可调节免疫和抗氧化性能高等优点。但纳米硒也有其缺点，它的理化性质不稳定，具有较高的表面自由能，容易团聚，极易转变为无活性的黑色单质硒，而且这种黑色单质硒几乎没有有益活性但却能产生毒性，这极大地阻碍了纳米硒作为补硒产品的发展应用。

[0004] 因此，希望提出一种稳定性更高的纳米硒产品，以更好的发挥纳米硒的作用。

发明内容

[0005] 本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种高稳定性的蛋白多肽‑纳米硒及其制备方法，所述蛋白多肽‑纳米硒的粒径较小，且稳定性高，不易发生团聚现象，具备良好的可利用度和活性。

[0006] 本发明提供一种蛋白多肽‑纳米硒的制备方法，包括以下步骤：

[0007] 将大豆多肽液与纳米硒溶液混合，反应，制得蛋白多肽‑纳米硒；所述大豆多肽液中大豆多肽的分子量为10‑30kDa。

[0008] 为了克服现有纳米硒产品的缺点与不足，本发明以大豆多肽作为稳定剂，发现大豆多肽对纳米硒的稳定效果与其分子量有密切相关性，当大豆多肽的分子量为10‑30kDa时，所制得的大豆多肽‑纳米硒颗粒不仅粒径相对较小，且同时具有相当优异的稳定性效果，从而可以大大提高纳米硒的可利用度。除此之外，相比于其他种类的蛋白多肽，本发明所使用的大豆多肽更容易被人体所吸收，还具有抗氧化、降血压、降血脂、抗癌等多种生理功能活性，能够与纳米硒配合产生更好的保健效果。

[0009] 优选的，所述大豆多肽液中大豆多肽的浓度为0.25‑2.5mg/mL。当大豆多肽的浓度为0.25‑2.5mg/mL时，所制得的大豆多肽‑纳米硒能够具备更好的电位稳定性，能够长时间保持较高的电位绝对值。

[0010] 更优选的，所述大豆多肽液中大豆多肽的浓度为2.5mg/mL。

[0011] 优选的，所述大豆多肽的制备方法为：将大豆分离蛋白与水混合，加入碱性蛋白酶进行酶解，分离纯化，得到目的分子量的大豆多肽。

[0012] 更优选的，所述分离纯化的方法包括离心或超滤分级中的至少一种。最优选的，所述分离纯化的方法为超滤分级。

[0013] 更优选的，所述碱性蛋白酶为Alcalase酶。

[0014] 更优选的，所述酶解的条件为：pH＝10.0，温度55℃。

[0015] 优选的，所述纳米硒溶液的制备方法为：将半胱氨酸和亚硒酸钠在溶液中混合，经氧化还原反应，得到纳米硒溶液。其中所述溶液中所用溶剂优选为水。

[0016] 更优选的，所述半胱氨酸与所述亚硒酸钠的浓度比约为4：1。当半胱氨酸和亚硒酸钠的浓度比约为4:1时，所得到纳米硒的粒径和粒径分散指数(PDI)都较小，性能优良。

[0017] 更优选的，进行所述氧化还原反应时的pH值调节至约为8。当pH值约为8时，所得到纳米硒的粒径和粒径分散指数(PDI)都较小，性能优良。

[0018] 本发明还提供了一种蛋白多肽‑纳米硒，由上述制备方法所制得。

[0019] 本发明还提供了上述一种蛋白多肽‑纳米硒在补硒产品中的应用。

[0020] 相对于现有技术，本发明的有益效果如下：

[0021] (1)本发明以半胱氨酸作为还原剂还原亚硒酸钠得到纳米硒颗粒，而半胱氨酸是人体的一种非必需氨基酸，对人体有益无害，此合成方法安全环保，不会产生对人体有害物质。由于纳米硒十分不稳定和难以分离，且分离的过程会导致纳米硒氧化变成灰色或黑色的无活性单质硒而失去应用价值，因此本发明以纳米硒溶液的形式对其进行保存，有利于维持纳米硒的稳定性；

[0022] (2)本发明以大豆分离蛋白酶解得到的大豆多肽为纳米硒的稳定剂，不仅维持了纳米硒的稳定性，而且大豆多肽本身具有的生理功能活性和易被人体吸收的特性会对纳米硒的功能和吸收有进一步提升；

[0023] (3)本发明先制备出纳米硒溶液，然后再用大豆多肽液来稳定纳米硒颗粒，相比于在大豆多肽液中直接加入硒源和还原剂的方式制备纳米硒颗粒，本发明所述制备方法更有利于纳米硒小颗粒的形成及稳定性的提高；

[0024] (4)本发明指出，大豆多肽的分子量大小对于纳米硒的稳定性有着重要影响，且分子量为10‑30kDa的大豆多肽对于维持纳米硒的稳定性的效果最好，能够有效克服纳米硒颗粒易团聚的缺点，大大提高了纳米硒的可利用度，推进纳米硒替代无机硒和有机硒在补硒产品中的应用。

附图说明

[0025] 图1为不同半胱氨酸与亚硒酸钠浓度比下制备的纳米硒的粒径和粒径分散指数(PDI)；

[0026] 图2为不同反应pH值下制备的纳米硒的粒径和粒径分散指数(PDI)；

[0027] 图3为不同浓度下的大豆多肽液与纳米硒溶液反应后得到的大豆多肽‑纳米硒于4℃贮藏时的粒径、粒径分散指数(PDI)和电位图；

[0028] 图4为不同浓度下的大豆多肽液与纳米硒溶液反应后得到的大豆多肽‑纳米硒于4℃贮藏的外观变化图；

[0029] 图5为不同分子量的大豆多肽液与纳米硒溶液反应后得到的大豆多肽‑纳米硒于4℃贮藏的粒径变化图和21天后的粒径分布图；

[0030] 图6为不同分子量的大豆多肽液与纳米硒溶液反应后得到的大豆多肽‑纳米硒于4℃贮藏45天后的外观图；

[0031] 图7为不同分子量的大豆多肽液与纳米硒溶液反应后得到的大豆多肽‑纳米硒的透射电子显微镜(TEM)图。

具体实施方式

[0032] 为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例仅为本发明的优选实施例，对本发明要求的保护范围不构成限制作用，任何未违背本发明的精神实质和原理下所做出的修改、替代、组合，均包含在本发明的保护范围内。

[0033] 以下实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。

[0034] 实施例1

[0035] 制备纳米硒溶液时半胱氨酸与亚硒酸钠的最佳浓度比

[0036] 控制pH＝4，分别按半胱氨酸：亚硒酸钠＝1:1、2:1、4:1、6:1、8:1的浓度比等体积混合半胱氨酸水溶液和亚硒酸钠水溶液，充分反应，得到纳米硒溶液。

[0037] 通过纳米粒度仪测得在不同半胱氨酸与亚硒酸钠浓度比条件下所制得纳米硒溶液中纳米硒颗粒的粒径和粒径分散指数(PDI)。测试结果如图1所示，当半胱氨酸与亚硒酸钠的浓度比为4:1时，所得到纳米硒颗粒的粒径和PDI都较小，其中粒径小于100nm，PDI小于0.2。

[0038] 实施例2

[0039] 制备纳米硒溶液时的最佳反应pH值

[0040] 以实施例1所得到的最佳浓度比等体积混合半胱氨酸水溶液和亚硒酸钠水溶液(半胱氨酸：亚硒酸钠＝4:1)，分别调节溶液pH＝2、4、6、8、10，充分反应，得到纳米硒溶液。

[0041] 通过纳米粒度仪测得在不同pH值条件下所制得纳米硒溶液中纳米硒颗粒的粒径和粒径分散指数(PDI)。测试结果如图2所示，当pH为8时，所得到纳米硒颗粒的粒径和PDI都较小，其中粒径小于200nm，PDI小于0.25。

[0042] 实施例3

[0043] 大豆多肽液中大豆多肽的最佳浓度范围

[0044] 大豆多肽SP1的制备：取5g的大豆分离蛋白溶于100mL蒸馏水中，制成浓度为5％(w/v)的大豆分离蛋白溶液，然后在80℃下水浴15min。后调节水浴锅温度至55℃，用0.1mol/L的氢氧化钠调节大豆分离蛋白溶液pH值至10，然后加入0.25mL Alcalase酶，酶解过程中每隔10min用0.1mol/L NaOH滴定至pH＝10。酶解完成后沸水浴10min灭酶。然后在
4000g、20℃下离心15min后离心去沉淀即得大豆多肽水解液。将水解液进行真空浓缩、冷冻干燥即得大豆混合肽粉末(SP1)。

[0045] 取以上制得的大豆多肽SP1溶于去离子水，分别配置成浓度为40、20、10、5、2.5、1、0.5、0.25mg/mL的大豆多肽液，采用实施例1‑2所确定的半胱氨酸与亚硒酸钠的最佳浓度比和最佳反应pH值制得纳米硒溶液，以上述大豆多肽液和纳米硒溶液为原料，按纳米硒溶液：
大豆多肽液＝6：1的体积比进行充分混合，反应，制得大豆多肽‑纳米硒溶液，于4℃下贮藏。

[0046] 通过纳米粒度仪测得大豆多肽‑纳米硒溶液随时间变化的粒径、PDI、电位及外观变化，测试结果如图3‑4所示。由图3中A可知，刚制备好的大豆多肽‑纳米硒颗粒粒径在85nm左右。在14天内，随着贮藏时间延长，加入了大豆多肽作为稳定剂的大豆多肽‑纳米硒的粒径也没有显著变化。由图3中B可知，经过14天的贮藏后，只有加入了浓度为0.25‑2.5mg/mL大豆多肽的大豆多肽‑纳米硒的电位绝对值仍然在30mV以上。延长贮藏时间至30天时，从图4可知，在0.25‑2.5mg/mL的浓度范围内，只有加入了2.5mg/mL大豆多肽的大豆多肽‑纳米硒溶液未出现明显沉淀。从以上分析可以得出，添加大豆多肽的最佳浓度为2.5mg/mL。

[0047] 实施例4

[0048] 大豆多肽的最佳分子量大小

[0049] 大豆多肽SP2的制备：取5g的大豆分离蛋白溶于100mL蒸馏水中，制成浓度为5％(w/v)的大豆分离蛋白溶液，然后在80℃下水浴15min。后调节水浴锅温度至55℃，用0.1mol/L的氢氧化钠调节大豆分离蛋白溶液pH值至10，然后加入0.25mL Alcalase酶，酶解过程中每隔10min用0.1mol/L NaOH滴定至pH＝10。酶解完成后沸水浴10min灭酶。然后在
4000g、20℃下离心15min后去沉淀即得大豆多肽水解液。将水解液通过截留分子量为3kDa的超滤膜得到分子量小于3kDa的大豆多肽水解液，将水解液真空浓缩、冷冻干燥得到的分子量小于3kDa的大豆多肽粉末(SP2)。

[0050] 大豆多肽SP3的制备：取5g的大豆分离蛋白溶于100mL蒸馏水中，制成浓度为5％(w/v)的大豆分离蛋白溶液，然后在80℃下水浴15min。后调节水浴锅温度至55℃，用0.1mol/L的氢氧化钠调节大豆分离蛋白溶液pH值至10，然后加入0.25mL Alcalase酶，酶解过程中每隔10min用0.1mol/L NaOH滴定至pH＝10。酶解完成后沸水浴10min灭酶。然后在
4000g、20℃下离心15min后去沉淀即得大豆多肽水解液。将水解液通过截留分子量为5kDa和3kDa的超滤膜得到分子量在3‑5kDa之间的大豆多肽水解液，将水解液真空浓缩、冷冻干燥得到的分子量在3‑5kDa之间的大豆多肽粉末(SP3)。

[0051] 大豆多肽SP4的制备：取5g的大豆分离蛋白溶于100mL蒸馏水中，制成浓度为5％(w/v)的大豆分离蛋白溶液，然后在80℃下水浴15min。后调节水浴锅温度至55℃，用0.1mol/L的氢氧化钠调节大豆分离蛋白溶液pH值至10，然后加入0.25mL Alcalase酶，酶解过程中每隔10min用0.1mol/L NaOH滴定至pH＝10。酶解完成后沸水浴10min灭酶。然后在
4000g、20℃下离心15min后去沉淀即得大豆多肽水解液。将水解液通过截留分子量为10kDa和5kDa的超滤膜得到分子量在5‑10kDa之间的大豆多肽水解液，将水解液真空浓缩、冷冻干燥得到的分子量在5‑10kDa之间的大豆多肽粉末(SP4)。

[0052] 大豆多肽SP5的制备：取5g的大豆分离蛋白溶于100mL蒸馏水中，制成浓度为5％(w/v)的大豆分离蛋白溶液，然后在80℃下水浴15min。后调节水浴锅温度至55℃，用0.1mol/L的氢氧化钠调节大豆分离蛋白溶液pH值至10，然后加入0.25mL Alcalase酶，酶解过程中每隔10min用0.1mol/L NaOH滴定至pH＝10。酶解完成后沸水浴10min灭酶。然后在
4000g、20℃下离心15min后去沉淀即得大豆多肽水解液。将水解液通过截留分子量为10kDa的超滤膜得到分子量大于10kDa的大豆多肽水解液，将水解液真空浓缩、冷冻干燥得到的分子量大于10kDa大豆多肽粉末(SP5)。

[0053] 大豆多肽‑纳米硒溶液的制备：

[0054] 以实施例3‑4所制得的大豆多肽SP1‑SP5为原料，分别将上述大豆多肽溶于去离子水，各自配置成浓度为2.5mg/mL的大豆多肽液；采用实施例1‑2所确定的半胱氨酸与亚硒酸钠的最佳浓度比和最佳反应pH值制得纳米硒溶液，以上述大豆多肽液和纳米硒溶液为原料，按纳米硒溶液：大豆多肽液＝6：1的体积比进行充分混合，反应，即制得对应的大豆多肽‑纳米硒溶液(SP1‑SeNPs、SP2‑SeNPs、SP3‑SeNPs、SP4‑SeNPs、SP5‑SeNPs)，将制得的大豆多肽‑纳米硒溶液于4℃下贮藏。

[0055] 通过纳米粒度仪测得上述5种大豆多肽‑纳米硒溶液随时间变化的粒径及30天后的粒径分布和外观图，测试结果如图5‑6所示。通过透射电子显微镜(TEM)观察上述5种大豆多肽‑纳米硒溶液的形貌，测试结果如图7所示。

[0056] 由图5中A可知，经检测，分子量大于10kDa的大豆多肽‑纳米硒(SP5‑SeNPs)随贮藏时间的延长，粒径变化较小，其他分子量的大豆多肽‑纳米硒的粒径都在第21天时出现了较明显增大。从图5中B也可以看出，SP5‑SeNPs的粒径分布集中在100nm左右，而其他的多肽纳米硒在超过1000nm处还有分布，说明SP5‑SeNPs的稳定性较好，而其他的大豆多肽‑纳米硒都出现了不同程度的团聚。由图6可知，当大豆多肽‑纳米硒在4℃下贮藏至45天时，未加多肽的纳米硒(空白组)已经出现了明显的黑红色沉淀，SP2‑SeNPs、SP3‑SeNPs、SP4‑SeNPs也都出现了不同程度的红色沉淀，只有SP1‑SeNPs和SP5‑SeNPs的沉淀较少。由图7可以看出，本发明所制备的大豆多肽‑纳米硒颗粒呈球状，而只有SP5‑SeNPs的球形大小均匀且没有出现聚集现象。以上结果表明，大豆多肽的分子量对纳米硒颗粒的稳定性有着重要影响，分子量≥10kDa(SP5)的大豆多肽对于维持纳米硒稳定性的效果明显更好，但出于实际应用考量，大豆多肽的分子量应不大于30kDa。

[0057] 上面结合附图对本申请实施例作了详细说明，但是本申请不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本申请宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。