一种载牛乳铁蛋白肽壳聚糖纳米粒及其制备方法和一种冻干粉

摘要

本发明提供了一种载牛乳铁蛋白肽壳聚糖纳米粒的制备及其制备方法和一种冻干粉，属于纳米材料技术领域。本发明将低分子量壳聚糖粉末溶于冰醋酸溶液中，调整溶液pH为3～5，得到低分子量壳聚糖溶液；将牛乳铁蛋白肽溶液加入到低分子量壳聚糖溶液中反应得到反应液A；将三聚磷酸钠溶液加入反应液A中继续反应至得到淡蓝色乳光分散液。本发明制备的载牛乳铁蛋白肽壳聚糖纳米粒具有良好的物理化学表征及体外抑菌作用，无细胞毒性，可作为一种有前途的抗微生物肽药物释放系统。

权利要求

1.一 种载牛乳铁蛋白肽壳聚糖纳米冻干粉，其特征在于，其制备方法包含以下步骤：将载牛乳铁蛋白肽壳聚糖纳米粒的分散液与蔗糖溶液混合预冻至共晶点，之后进行真空冷冻干燥即得到所述冻干粉；

所述载牛乳铁蛋白肽壳聚糖纳米粒的制备方法，包括以下步骤：

1）将低分子量壳聚糖溶于冰醋酸溶液中，调整溶液pH为3 5，得到低分子量壳聚糖溶~液；

2）将牛乳铁蛋白肽加入到低分子量壳聚糖溶液中反应得到反应液A；

3）将三聚磷酸钠溶液加入反应液A中继续反应至得到淡蓝色乳光分散液；

所述低分子量壳聚糖溶液和三聚磷酸钠溶液的浓度独立的为0.5 2mg/mL；

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所述低分子量壳聚糖的分子量为50000 190000Da；

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所述牛乳铁蛋白肽、三聚磷酸钠溶液与低分子量壳聚糖溶液的质量体积比为0.5~

1.5mg：5 15mL：25 35mL；

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所述蔗糖溶液的质量浓度为5%；所述载牛乳铁蛋白肽壳聚糖纳米粒的分散液与蔗糖溶液的体积比为1：1。

2.根据权利要求1所述的载牛乳铁蛋白肽壳聚糖纳米冻干粉，其特征在于，所述真空冷冻干燥的条件为：冷冻温度为‑75 ‑80℃，压力0.05 0.15Pa，冷冻时间22 26h。

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3.根据权利要求1所述的载牛乳铁蛋白肽壳聚糖纳米冻干粉，其特征在于，所述冰醋酸溶液的体积浓度为0.01 0.5%。

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4.根据权利要求1所述的载牛乳铁蛋白肽壳聚糖纳米冻干粉，其特征在于，所述步骤2）的反应温度为0 4℃，反应时间为5 15min。

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5.根据权利要求1所述的载牛乳铁蛋白肽壳聚糖纳米冻干粉，其特征在于，所述步骤3）的反应温度为0 4℃，反应时间为20 40min。

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说明书

一种载牛乳铁蛋白肽壳聚糖纳米粒及其制备方法和一种冻

干粉

技术领域

[0001] 本发明涉及纳米材料技术领域，尤其涉及一种载牛乳铁蛋白肽壳聚糖纳米粒及其制备方法和一种冻干粉。

背景技术

[0002] 大多数多细胞生物产生的抗微生物肽(AMPs)可作为快速抵御入侵病原微生物的第一道防线，这使得多细胞生物能够在竞争环境中生存，而无需复杂的自适应免疫系统。AMPs由氨基酸组成，具有不同的大小和形状，通常带有净正电荷，并且具有两亲性结构。不同类别的AMPs的抗菌作用机制有所不同，但通常AMPs可与带负电荷的细菌膜直接相互作用，从而引起膜去极化。AMPs广泛存在于生物体中，近年来其在抗菌方面获得了相当大的关注，由于其具有复杂且多模式的抗菌作用，因此被认为是一种有前途的抗生素替代品。

[0003] 牛乳铁蛋白(Bovine lactoferrin，BLF)是哺乳动物黏膜上皮细胞产生的一种糖蛋白，其含有703个氨基酸，相对分子质量为80kDa，主要存在于牛奶和体液中。牛乳铁蛋白肽(Bovine lactoferricin，BLfcin)是BLF经胃蛋白酶水解后产生的一种AMPs，BLfcin具有抗菌、抗真菌、抗病毒和免疫调节等生物学活性，与天然蛋白相比，BLfcin具有更高的抗菌活性，表明BLfcin是BLF的杀菌结构域。BLF及其衍生肽的优点是具有广泛的抗菌谱，且不会引起细菌耐药性，扩大了它在奶牛乳房炎治疗中作为抗生素替代品的应用潜力。

[0004] 尽管AMPs具有许多生物学功能，但静脉给药或口服无法取得理想的效果，这很可能是由于静脉注射后AMPs被血清蛋白灭活或是口服后在胃肠道中被酶降解。近年来，纳米制剂作为AMPs的药物递送系统受到了广泛关注，这种药物包封和递送体系可以保护肽免于被血清蛋白降解、提供理想的表面特性、改善药物对靶组织的生物分布和选择性，以取得更好的治疗效果。Leng等人制备出的载BLfcin纳米胶囊通过破坏白色念球菌的细胞壁和细胞膜从而导致其死亡，同时该纳米胶囊还增强了上皮细胞对白色念珠菌的自然杀伤特性。Qi等人制备了一种加载牛乳铁蛋白肽的pH和热双敏感的纳米颗粒，该纳米颗粒表现出抗肿瘤和免疫细胞激活作用。BLfcin可以通过纳米颗粒传递到肿瘤部位，在溶酶体的酸性环境和微波辐射引起的热条件下立即从纳米颗粒释放，并随着损伤相关分子模式的释放最终诱导肿瘤凋亡。

[0005] 但是目前，应用于奶牛乳房炎防治的AMPs‑纳米复合制剂的开发仍然较少；将纳米粒直接冻干后不易溶解，且粒径变化大，不利于后续的研究，研究一种稳定性好、载药量高、可以预防奶牛乳房炎的纳米粒冻干制剂是目前亟待解决的问题。

发明内容

[0006] 本发明的目的在于提供一种载牛乳铁蛋白肽壳聚糖纳米粒及其制备方法和一种冻干粉，本发明制备得到的纳米粒具有较高的生物相容性和体外抑菌活性，且载药量高，对于制备预防奶牛乳房炎制剂具有突出的贡献。

[0007] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

[0008] 本发明提供了一种载牛乳铁蛋白肽壳聚糖纳米粒的制备方法，包括以下步骤：

[0009] 1)将低分子量壳聚糖溶于冰醋酸溶液中，调整溶液pH为3～5，得到低分子量壳聚糖溶液；

[0010] 2)将牛乳铁蛋白肽加入到低分子量壳聚糖溶液中反应得到反应液A；

[0011] 3)将三聚磷酸钠溶液加入反应液A中继续反应至得到淡蓝色乳光分散液。

[0012] 进一步的，所述冰醋酸溶液的体积浓度为0.01～0.5％。

[0013] 进一步的，所述低分子量壳聚糖溶液和三聚磷酸钠溶液的浓度独立的为0.5～2mg/mL。

[0014] 进一步的，所述低分子量壳聚糖的分子量为50000～19000Da。

[0015] 进一步的，所述牛乳铁蛋白肽、三聚磷酸钠溶液与低分子量壳聚糖溶液的质量体积比为0.5～1.5mg：5～15mL：25～35mL。

[0016] 进一步的，所述步骤2)的反应温度为0～4℃，反应时间为5～15min。

[0017] 进一步的，所述步骤3)的反应温度为0～4℃，反应时间为20～40min。

[0018] 本发明提供了一种载牛乳铁蛋白肽壳聚糖纳米粒。

[0019] 本发明提供了一种载牛乳铁蛋白肽壳聚糖纳米粒冻干粉，其制备方法包含以下步骤：将载牛乳铁蛋白肽壳聚糖纳米粒的分散液与蔗糖溶液混合预冻至共晶点，之后进行真空冷冻干燥即得到所述冻干粉。

[0020] 进一步的，所述蔗糖溶液的质量浓度为2～8％。

[0021] 进一步的，所述载牛乳铁蛋白肽壳聚糖纳米粒的分散液与蔗糖溶液的体积比为1：2～2：1。

[0022] 进一步的，所述真空冷冻干燥的条件为：冷冻温度为‑75～‑80℃，压力0.05～0.15Pa，冷冻时间22～26h。

[0023] 本发明的有益效果：

[0024] 本发明通过离子交联法制备载牛乳铁蛋白肽纳米粒(BLfcin‑NPs)，其中纳米粒粒径较小且分布均匀，载药纳米粒表面带正电荷，纳米体系较稳定。BLfcin‑NPs在透射电镜下呈近似圆球形，红外吸收光谱结果表明，BLfcin成功加载到壳聚糖纳米粒中。BLfcin‑NPs对奶牛乳腺上皮细胞具有促进增殖作用，生物相容性好，对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌有显著的抑菌作用，在体外可持续释放药物，维持抑菌效果。

[0025] 蔗糖的化学性质稳定，多呈无定型结构，对阻止多肽二级结构改变、冻干处理过程中以及贮藏期内多肽的伸展和聚集起显著作用。以蔗糖为冻干保护剂进行冷冻干燥，能够很好地解决冻干后复溶性差、纳米粒表征变化大等问题，能较好的保存物质本身的活性，并且所需要的温度较低，有利于热敏性物质的干燥。冷冻干燥法能除去大约95％的水分，使样品保持较好的稳定性，便于长期贮存和长途运输。

[0026] 向BLfcin‑NPs水分散液中加入蔗糖溶液作为冻干保护剂，得到的冻干粉剂为饼状，表面光滑，颜色均匀，结构致密，再分散性好，且粒径、PDI变化率最小。

附图说明

[0027] 图1为低分子量壳聚糖、三聚磷酸钠、牛乳铁蛋白肽以及实施例1的载牛乳铁蛋白肽纳米粒冻干粉的傅立叶红外光谱图；

[0028] 图2为在不同浓度的牛乳铁蛋白肽，空白壳聚糖纳米粒，实施例2的负载牛乳铁蛋白肽的壳聚糖纳米粒冻干粉处理下，用MTT法测定BMECs的细胞活力值；

[0029] 图3为实施例3的负载牛乳铁蛋白肽的壳聚糖纳米粒冻干粉的时间‑抑菌曲线。

具体实施方式

[0030] 本发明提供了一种载牛乳铁蛋白肽壳聚糖纳米粒的制备方法，包括以下步骤：

[0031] 1)将低分子量壳聚糖溶于冰醋酸溶液中，调整溶液pH为3～5，得到低分子量壳聚糖溶液；

[0032] 2)将牛乳铁蛋白肽加入到低分子量壳聚糖溶液中反应得到反应液A；

[0033] 3)将三聚磷酸钠溶液加入反应液A中继续反应至得到淡蓝色乳光分散液。

[0034] 在本发明中，所述冰醋酸溶液的体积浓度为0.01～0.5％，优选为0.05～0.4％，进一步优选为0.1～0.3％，更优选为0.2％。

[0035] 在本发明中，所述低分子量壳聚糖溶液的浓度为0.5～2mg/mL，优选为0.6～1.8mg/mL，进一步优选为0.8～1.5mg/mL，更优选为1.0mg/mL。在本发明中，所述低分子量壳聚糖的分子量为50000～190000Da，优选为55000～180000Da，进一步优选为70000～
150000Da。在本发明中，所述低分子量壳聚糖的黏度为20～300cP，脱乙酰度＞75％，优选为黏度为50～200cP，脱乙酰度＞80％。

[0036] 在本发明中，用浓度为0.5～1.5mg/mL的氢氧化钠溶液调整低分子量壳聚糖溶液pH为3～5，优选为用浓度为0.8～1.2mg/mL的氢氧化钠溶液调整低分子量壳聚糖溶液pH为3.5～4.5，进一步优选为用浓度为1.0mg/mL的氢氧化钠溶液调整低分子量壳聚糖溶液pH为
4.0。

[0037] 在本发明中，所述三聚磷酸钠溶液的浓度为0.5～2mg/mL，优选为0.8～1.5mg/mL，进一步优选为1.0mg/mL。

[0038] 在本发明中，所述牛乳铁蛋白肽、三聚磷酸钠溶液与低分子量壳聚糖溶液的质量体积比为0.5～1.5mg：5～15mL：25～35mL，优选为0.8～1.2mg：8～12mL：28～32mL，进一步优选为1.0mg：10mL：30mL。

[0039] 在本发明中，低分子量壳聚糖溶液与牛乳铁蛋白肽溶液反应之前，需要将低分子量壳聚糖溶液在55～65℃的水浴中保温5～15min，优选为在58～62℃的水浴中保温7～12min，进一步优选为在60℃的水浴中保温10min。

[0040] 在本发明中，所述步骤2)的反应温度为0～4℃，反应时间为5～15min，优选为反应温度为1～3℃，反应时间为8～12min，进一步优选为反应温度为2℃，反应时间为10min。

[0041] 在本发明中，所述步骤3)的反应温度为0～4℃，反应时间为20～40min，优选为反应温度为1～3℃，反应时间为25～35min，进一步优选为反应温度为2℃，反应时间为30min。

[0042] 本发明提供了一种载牛乳铁蛋白肽壳聚糖纳米粒。

[0043] 本发明提供了一种载牛乳铁蛋白肽壳聚糖纳米粒冻干粉，其制备方法包含以下步骤：将载牛乳铁蛋白肽壳聚糖纳米粒的分散液与蔗糖溶液混合预冻至共晶点，之后进行真空冷冻干燥即得到所述冻干粉。

[0044] 在本发明中，所述蔗糖溶液的质量浓度为2～8％，优选为3～7％，进一步优选为4～6％，更优选为5％。

[0045] 在本发明中，所述载牛乳铁蛋白肽壳聚糖纳米粒的分散液与蔗糖溶液的体积比为1：2～2：1，优选为4：10～3：2，进一步优选为1：1。

[0046] 在本发明中，所述真空冷冻干燥的条件为：冷冻温度为‑75～‑80℃，压力0.05～0.15Pa，冷冻时间22～26h，优选为冷冻温度为‑76～‑79℃，压力0.08～0.12Pa，冷冻时间23～25h，进一步优选为冷冻温度为‑78℃，压力0.1Pa，冷冻时间24h。

[0047] 下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

[0048] 实施例1

[0049] 载牛乳铁蛋白肽壳聚糖纳米粒的制备：

[0050] 将低分子量壳聚糖溶于0.2％冰醋酸溶液中，制成1mg/ml的溶液，用1mol/L的氢氧化钠溶液将其pH值调整为4.5，高压灭菌后备用；另精密称取三聚磷酸钠溶于纯水中，制成浓度为1mg/ml的溶液，经0.22μm一次性针式滤器过滤除菌，随后置于冰箱中备用。将低分子量壳聚糖溶液置于60℃水浴中预热10min，在磁力搅拌条件下，加入一定量的牛乳铁蛋白肽混合均匀，随后恒速滴加三聚磷酸钠溶液，搅拌30min后即得具有淡蓝色乳光的载牛乳铁蛋白肽壳聚糖纳米粒，其中牛乳铁蛋白肽、三聚磷酸钠溶液与低分子量壳聚糖溶液的质量体积比为1.0mg：10mL：30mL。所述低分子量壳聚糖的分子量为150000Da。

[0051] 载牛乳铁蛋白肽壳聚糖纳米冻干粉的制备：

[0052] 将载牛乳铁蛋白肽壳聚糖纳米粒的分散液与5％的蔗糖溶液混合均匀后置于西林瓶中，西林瓶不塞盖，放置在预冻架上，在真空冷冻干燥机的冷陷中预冻至共晶点，之后在‑75℃、0.1Pa下真空冷冻干燥24h，即得到冻干粉，其中分散液和蔗糖溶液的体积比为1：2。

[0053] 实施例2

[0054] 载牛乳铁蛋白肽壳聚糖纳米粒的制备：

[0055] 将低分子量壳聚糖溶于0.5％冰醋酸溶液中，制成0.8mg/ml的溶液，用1.2mol/L的氢氧化钠溶液将其pH值调整为4.0，高压灭菌后备用；另精密称取三聚磷酸钠溶于纯水中，制成浓度为0.8mg/ml的溶液，经0.22μm一次性针式滤器过滤除菌，随后置于冰箱中备用。将低分子量壳聚糖溶液置于55℃水浴中预热15min，在磁力搅拌条件下，加入一定量的牛乳铁蛋白肽混合均匀，随后恒速滴加三聚磷酸钠溶液，搅拌30min后即得具有淡蓝色乳光的载牛乳铁蛋白肽壳聚糖纳米粒，其中牛乳铁蛋白肽、三聚磷酸钠溶液与低分子量壳聚糖溶液的质量体积比为1.2mg：14mL：32mL。所述低分子量壳聚糖的分子量为120000Da。

[0056] 载牛乳铁蛋白肽壳聚糖纳米冻干粉的制备：

[0057] 将载牛乳铁蛋白肽壳聚糖纳米粒的分散液与4％的蔗糖溶液混合均匀后置于西林瓶中，西林瓶不塞盖，放置在预冻架上，在真空冷冻干燥机的冷陷中预冻至共晶点，之后在‑78℃、0.12Pa下真空冷冻干燥25h，即得到冻干粉，其中分散液和蔗糖溶液的体积比为1：1。

[0058] 实施例3

[0059] 载牛乳铁蛋白肽壳聚糖纳米粒的制备：

[0060] 将低分子量壳聚糖溶于0.3％冰醋酸溶液中，制成1.2mg/ml的溶液，用0.8mol/L的氢氧化钠溶液将其pH值调整为5.0，高压灭菌后备用；另精密称取三聚磷酸钠溶于纯水中，制成浓度为1.2mg/ml的溶液，经0.22μm一次性针式滤器过滤除菌，随后置于冰箱中备用。将低分子量壳聚糖溶液置于65℃水浴中预热5min，在磁力搅拌条件下，加入一定量的牛乳铁蛋白肽混合均匀，随后恒速滴加三聚磷酸钠溶液，搅拌30min后即得具有淡蓝色乳光的载牛乳铁蛋白肽壳聚糖纳米粒，其中牛乳铁蛋白肽、三聚磷酸钠溶液与低分子量壳聚糖溶液的质量体积比为0.8mg：8mL：28mL。所述低分子量壳聚糖的分子量为190000Da。

[0061] 载牛乳铁蛋白肽壳聚糖纳米冻干粉的制备：

[0062] 将载牛乳铁蛋白肽壳聚糖纳米粒的分散液与6％的蔗糖溶液混合均匀后置于西林瓶中，西林瓶不塞盖，放置在预冻架上，在真空冷冻干燥机的冷陷中预冻至共晶点，之后在‑80℃、0.08Pa下真空冷冻干燥23h，即得到冻干粉，其中分散液和蔗糖溶液的体积比为2：1。

[0063] 对比例1

[0064] 采用与本申请实施例1相同的制备方法制备载牛乳铁蛋白肽壳聚糖纳米粒，区别在于牛乳铁蛋白肽、三聚磷酸钠溶液与低分子量壳聚糖溶液的质量体积比调整为5.0mg：10mL：30mL。

[0065] 分别测量实施例1～3及对比例1所制备纳米粒表征及包封率和载药量，结果见下表1。

[0066] 表1

[0067]  粒径(nm) PDI 电位(mV) 包封率(％) 载药量(％)
实施例1 103.9±2.08 0.223±0.004 20.57±0.80 72.18±0.78 2.17±0.03
实施例2 111.3±4.87 0.257±0.033 19.83±1.18 46.69±5.94 1.41±0.18
实施例3 101.2±1.57 0.200±0.019 21.37±0.88 66.34±3.27 2.03±0.22
对比例1 135.9±1.85 0.381±0.014 21.00±0.08 17.29±0.54 0.52±0.02

[0068] 由上表可知，通过本申请制备方法得到的纳米粒粒径较小，分散稳定，且包封率和载药量较高。

[0069] 对比例2～4

[0070] 采用与本申请实施例1相同的制备方法制备载牛乳铁蛋白肽壳聚糖纳米粒冻干粉，区别在于对比例2为不添加蔗糖溶液、对比例3为添加5％的甘露醇溶液、对比例4为添加5％的乳糖溶液，将实施例1和对比例2～4所得到的冻干粉外观进行对比，取同等质量的冻干粉分别置于西林瓶1～4中，加入等量纯水，混合均匀，观察冻干粉的再分散情况；将上述组分的再分散样品进行粒径和PDI检测，并分别计算冻干粉复溶后的粒径变化率和PDI变化率，结果见下表2。

[0071] 表2

[0072]

[0073] 表2中可以看出，5％甘露醇溶液组合5％乳糖溶液组冻干粉复溶后粒径分别增加29.2％、14.35％，粒径变化较大，且PDI均大于0.350，表明这两组样品复溶后的溶液稳定性变差；而本申请实施例1采用5％蔗糖溶液得到的冻干粉为饼状，表面光滑，颜色均匀，结构松脆致密，PDI小于0.30，且粒径、PDI变化率最小。

[0074] 实验例1

[0075] 采用傅立叶红外变换光谱分别对低分子量壳聚糖(LCS)、三聚磷酸钠(TPP)、牛乳铁蛋白肽(BLfcin)以及载牛乳铁蛋白肽纳米粒冻干粉(BLfcin‑NPs)的结构进行表征，结果‑1见图1，从图1中可以看出，LCS在3379cm 处是‑OH与‑NH2的伸缩振动吸收峰重叠而增宽的多重吸收峰，由于壳聚糖分子中存在着大量的链内、链间氢键，因氢键的长短和强弱不等，使‑1
其伸缩峰出现在一较宽的频率范围内；2877cm 处的吸收带‑CH2的伸缩峰，其偏移程度与结‑1 ‑1
晶度有关；1659cm 和1560cm 处分别为较强的酰胺I(主要为C＝O伸缩振动)和酰胺II(N‑H‑1
为次键)的吸收峰；1380cm 为‑CH3变形吸收峰。

[0076] TPP在1095cm‑1处有明显的磷酸根基团不对称伸缩振动吸收峰；899cm‑1处为P‑O‑P‑1 ‑1的对称伸缩振动峰；664cm 、483cm 等处为磷酸根的面内弯曲振动峰。

[0077] BLfcin在3286cm‑1处是氢键缔合的‑OH伸缩振动峰与‑NH的伸缩振动峰；在1672cm‑1 ‑1 ‑1 ‑1处具有较强的明显的酰胺键的特征峰；此外在1532cm 、1203cm 和840cm 处还出现了多肽中的碳酸根的吸收峰。

[0078] BLfcin‑NPs与BLfcin的红外吸收特征相似，3431cm‑1处也具有较宽的氢键缔合的‑1 ‑1伸缩振动峰；在1641cm 处酰胺I的C＝O伸缩振动峰减弱，同时1561cm 处为酰胺II的N‑H次‑1 ‑1
键吸收峰增强；1168cm 处的磷酸根吸收峰减弱偏移，形成了1075cm 处较宽的吸收峰，可能是磷酸根与氨基位点进行了相连；C‑CH3的对称变形振动吸收峰变弱，说明可能形成了氢键。红外吸收光谱结果表明，BLfcin成功加载到壳聚糖纳米粒中。

[0079] 实验例2

[0080] 细胞毒性试验：

[0081] 用3‑(4,5‑二甲基‑2‑噻唑基)‑2,5‑二苯基‑2H‑四氮唑鎓溴化物(MTT)评估实施例1纳米冻干粉的细胞毒性。将纳米冻干粉与奶牛乳腺上皮细胞(Bovine mammary epithelial cells，BMECs)共同孵育24h后，评价该冻干粉的细胞毒性，见图2。从图2中可以看出随着游离牛乳铁蛋白肽(BLfcin)浓度升高，游离牛乳铁蛋白肽组的细胞活力仍保持在
100％以上，与之相似地，空白壳聚糖纳米粒(LCS‑NPs)组和负载牛乳铁蛋白肽的壳聚糖纳米粒(BLfcin‑NPs)组在浓度范围为0μg/mL～1000μg/mL时同样保持100％以上的细胞活力。
尽管空白壳聚糖纳米粒在较高浓度时细胞活力有所下降，但该载体仍能促进细胞增殖，表明其具有良好的生物相容性。同时，在加载牛乳铁蛋白肽后，未观察到明显的细胞毒性，其细胞活力大于BLfcin组和LCS‑NPs组，表明BLfcin‑NPs浓度在≤1000μg/mL时对BMECs无明显细胞毒性作用，该纳米制剂具有很大的应用潜力。

[0082] 实验例3

[0083] 体外抑菌试验：

[0084] 用无菌接种环将待测细菌划线于灭菌琼脂平板上，于37℃恒温培养箱中过夜培养。挑取单个菌落接种于无菌肉汤培养基中，37℃下以140r/min培养14‑16h。将培养后的菌液取300μL于30mL新鲜无菌肉汤培养基中，37℃下以240r/min恒温震荡培养4h至对数生长期。采用稀释涂布平板法，计算每毫升菌液的菌落形成单位(ColonyForming Units，CFU)。

[0085] 取BLfcin、实施例3的BLfcin‑NPs分别设置1×MIC、2×MIC以及4×MIC组，菌液浓6
度为1×10CFU/mL，将纳米粒冻干粉与菌悬液以1：1(v/v)混合，用涡旋震荡器混合均匀，在气浴恒温振荡器中以37℃，100r/min培养。在培养0、2、6、12、24h后取出，使用稀释涂布平板法计算菌落数，取100μl菌液，用玻璃板将其涂布在固体琼脂培养基上，静置30min，置于37℃恒温电热培养箱中过夜培养后取出计数。以时间为横坐标，菌落数为纵坐标绘制时间‑抑菌曲线，BLfcin和BLfcin‑NPs对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的时间抑菌曲线分别见图3A，B。从图3可以看出，对于金黄色葡萄球菌，BLfcin和BLfcin‑NPs在各个试验浓度下均可抑制对数生长期的细菌增殖，但BLfcin在与金黄色葡萄球菌作用2h后细菌菌落数有所增长，而BLfcin‑NPs各组浓度在24h内的菌落数均小于BLfcin组。两种药物对大肠杆菌的抑菌趋势与金黄色葡萄球菌相似，表明BLfcin‑NPs在24h内可持续释放药物，且抑菌作用优于单药。

[0086] 由以上实施例可知，本发明提供了载牛乳铁蛋白肽壳聚糖纳米粒及其制备方法和一种冻干粉，本发明通过离子交联法制备载牛乳铁蛋白肽纳米粒(BLfcin‑NPs)，其粒径较小且分布均匀，载药纳米粒表面带正电荷，纳米体系较稳定。BLfcin‑NPs在透射电镜下呈近似圆球形，红外吸收光谱结果表明，BLfcin成功加载到壳聚糖纳米粒中。BLfcin‑NPs对奶牛乳腺上皮细胞具有促进增殖作用，生物相容性好，对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌有显著的抑菌作用，在体外可持续释放药物，维持抑菌效果。

[0087] 向BLfcin‑NPs水分散液中加入蔗糖溶液作为冻干保护剂，得到的冻干粉剂为饼状，表面光滑，颜色均匀，结构致密，再分散性好，且粒径、PDI变化率最小。

[0088] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。